Định tính saponin trong dược liệu giảo cổ lam bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG DƢỢC
LIỆU GIẢO CỔ LAM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ






HÀ NỘI - 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC


ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG DƢỢC
LIỆU GIẢO CỔ LAM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược Liệu
2. Bộ môn Vật Lý – Hóa Lý

HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC”
được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu và bộ môn Vật Lý - Hóa Lý trường
Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân
và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn.
Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn
Anh người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu,
giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn DS Lê Xuân Kỳ, DS Đào Văn Nam đã giúp đỡ,
chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn Vật Lý-
Hóa Lý.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học
Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược
liệu, bộ môn Vật Lý - Hóa Lý đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi
mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực
không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 3
1.1 TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU GIẢO CÔ LAM. 3
1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố của chi Gynostemma Blume. 3
1.1.2 Thành phần hóa học của G. pentaphyllum 3
1.1.3 Tác dụng dược lý 5
1.1.4 Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. 7
1.2 PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC
LIỆU …………………………………… 8
1.2.1 Phương pháp HPLC 8
1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong phân tích Dược liệu và các hợp chất tự nhiên 10
1.3 PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN TRONG THỰC PHẨM VÀ
DƢỢC LIỆU 11
1.4 DẤU VÂN TAY TRONG HPLC VÀ XU HƢỚNG ĐỊNH TÍNH DƢỢC
LIỆU VÀ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC 13
1.4.1 Phương pháp dấu vân tay trong HPLC 13
1.4.2 Xu hướng định tính dược liệu và chế phẩm đông dược. 14
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 16
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 16
2.1.1 Nguyên liệu 16
2.1.2 Dụng cụ thiết bị 16
2.1.3 Hóa chất 16

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17


2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ DL. 17
2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 20
2.3.3 Thẩm định phương pháp 21
2.3.4 Phân tích định tính saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng HPLC 22
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 23
3.1 CHIẾT XUẤT - TINH CHẾ SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ DL 23
3.1.1 Chiết xuất. 23
3.1.2 Tinh chế 23
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25
3.2.1 Khảo sát bước sóng 25
3.2.2 Khảo sát hệ dung môi 25
3.2.3 Khảo sát thể tích bơm mẫu 26
3.2.4 Khảo sát tốc độ dòng 27
3.2.5 Đánh giá chuẩn nội Rb1 28
3.3 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 29
3.3.1 Tính phù hợp của hệ thống 29
3.3.2 Độ ổn định 30
3.3.3 Độ lặp lại 31
3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU GCL THU HÁI TẠI ĐÀ LẠT 31
3.5 BÀN LUẬN 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38
PHỤ LỤC 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MeOH
Methanol
EtOH
Ethanol
ACN
Acetonitril
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance
liquid chromatography)
G.
Gynostemma
GCL
Giảo cổ lam
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard
Deviation)
SKLM
Sắc kí lớp mỏng
STT
Số thứ tự
SKLM
Sắc kí lớp mỏng
UV – VIS
Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible)
V
Thể tích
TB
Trung bình

DL
Dược liệu




DANH MỤC CÁC HÌNH

STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin
triterpen tetracyclic
4
2
Hình 1.2 Sơ đồ máy HPLC
8
3
Hình 3.1 Sắc ký đồ của dung dịch trước và sau khi qua
cột nhựa Diaion HP-20
24
4
Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử
24
5
Hình 3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn
Ginsenoside Rb1 trên máy HPLC
25
6

Hình 3.4 Sắc ký đồ của các saponin trong GCL (khảo sát
điều kiện sắc ký)
28
7
Hình 3.5 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Rb1
28
8
Hình 3.6 Sắc ký đồ của 5 mẫu GCL thu hái tại Đà Lạt
32
9
Hình 3.7 Bốn tiểu vùng saponin trong GCL bằng phương
pháp dấu vân tay trong HPLC
35




DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải
23
2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký
29
3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình phân

tích
30
4
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích
31
5
Bảng 3.5 Khoảng tin cậy (95%) của 5 mầu GCL thu hái tại
Đà Lạt
33
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở
Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kỳ đã
phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Thành phần hóa học chính
của Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường [2], [5]. Các đặc tính
dược lý của Giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở
thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc
[36]. GCL được biết đến với rất nhiều tác dụng quý như tác dụng hạ lipid
[20], [39], hạ đường huyết [36], ức chế khối u [21], [36], tác dụng tốt trên tim
mạch và hệ thần kinh [12], [36]…Do vậy, GCL hỗ trợ tốt trong các trường
hợp mỡ máu cao, huyết áp cao, đái tháo đường tuýp II…
Tuy nhiên, nguồn gốc và thành phần hóa học của GCL khá phức tạp.
Saponin trong GCL khác nhau giữa các loài và vùng trồng, thay đổi theo điều
kiện thời tiết khí hậu [18]. Hơn nữa, hiện chưa xác định được saponin có tác
dụng dược lý đặc trưng do vậy việc kiểm soát chất lượng của dược liệu gặp
nhiều khó khăn.
Các loại kỹ thuật dấu vân tay - Fingerprint đã dần dần đi vào thực tế bằng
việc xây dựng mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các
đặc tính hóa học của thảo dược. Phương pháp này góp phần xác thực loài,

đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, giúp kiểm soát chất
lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược. Đây là một xu
hướng trong định tính dược liệu và các chế phẩm đông dược. Nhằm hoàn
thiện tiêu chuẩn dược liệu Giảo cổ lam, giúp lựa chọn nguồn nguyên liệu ổn
định và chất lượng, khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ
lam bằng HPLC” đươc thực hiện với 2 mục tiêu sau:
2

1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu
Giảo cổ lam.
2. Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino bằng phương pháp dấu vân tay - Fingerprint trong
HPLC.

3

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU GIẢO CÔ LAM.
1.1.1. Vị trí phân loại, phân bố của chi Gynostemma Blume.
 Vị trí phân loại của chi Gynostemma
Theo [5], [8] chi Gynostemma được xếp vào họ Bầu bí - Cucurbitaceae.
Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược.
Ngành Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Sổ Dilleniidae
Liên bộ Hoa tím Violanae
Bộ Bí Cucurbitales
Họ Bầu bí Cucurbitaceae
Chi Gynostemma
 Phân bố

Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á
và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Tại
Trung Quốc có 14 loài (trong đó có 9 loài đặc thù) [19].
Loài G. pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal,
Bangladesh, Srilanca, Lào, Myanma, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [19].
 Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam
Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma được công bố ở Việt
Nam là G. pentaphyllum (Thunb.) Makino và G. laxum (Wall.) Cogn [5], [2],
G. longipes C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [28].
1.1.2. Thành phần hóa học của G. pentaphyllum
Theo [5], [2] thành phần hóa học của G. pentaphyllum có saponin,
flavonoid và các loại đường.

4

- Saponin
Nhiều nghiên cứu đã phát hiện saponin có mặt trong GCL thuộc nhóm
dammaran [29]. Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng
(triterpenoid tetracyclic). Trong phân tử có 30C và do 6 nhóm hemiterpen
ghép lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều
trong các cây thuộc chi Panax, họ Araliaceae. Đặc biệt saponin trong nhân
sâm (Panax ginseng) có nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên
thế giới nghiên cứu.
1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24
26
27
23 25
28 29
30

Hình 1.1 Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm
saponin triterpenoid tetracyclic
Đã có trên 100 saponin trong thành phần Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin
giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng C. A.
Mayer là Rb1 (Gypenosid III) [27], [35], [14], [29], Rc [32], [29], [14], Rb3
(Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [14], [29], [32], Rg3 [33], [29],
[14], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [27], [29], [14]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf

là 1 protopanaxatriol [33].
- Flavonoid
Flavonoid là 1 trong những nhóm chất chính nhưng ít được nghiên cứu.
Đã phát hiện 1 số flavonoid chính: ombuin [30], ombuoside, rutin [34], ngoài
5

ra còn có quercetin-di-(rhamno)-hexosid, quercetin-rhamno-hexosid,
kaempferol-rhamno-hexosid và kaempferol-3-O-rutinosid [25].
- Các thành phần khác
+ Các sterol trong G. pentaphyllum chiếm 1 lượng nhỏ (khoảng
0.0001%) bao gồm ergostanol, sitosterol và stigmasterol [16].
+ Nhóm alcaloid được báo cáo là không có trong G. pentaphyllum [2],
[9].
+ Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có
15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag.
Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag
(0.0001%) [6].
+ Một số chất khác cũng được tìm thấy là polysaccharid, các vitamin,
chất khoáng và các amino acid [29].
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý
Các đặc tính dược lý của G. pentaphyllum hầu hết đều thuộc về saponin,
thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu
dược học tại Trung Quốc [36].
- Tác dụng trên chuyển hóa lipid
Các nghiên cứu về lâm sàng của G. pentaphyllum trên chuyển hóa lipid
đã được thực hiện ở nhiều trường đại học, các viện nghiên cứu và các bệnh
viện ở Trung Quốc. Một thử nghiệm được thực hiện trên 158 bệnh nhân
nhiễm lipid máu, với 106 bệnh nhân được dùng gypenosid dạng nước sắc và
52 bệnh nhân dùng dạng viên nén. Cả 2 nhóm đều dùng lượng tương đương
với 120 mg/ngày trong 2 tháng. Lượng lipid trong máu giảm theo thứ tự là

85% và 69%. Thử nghiệm khác với gypenosid viên 120 mg/ngày trên 39 bệnh
nhân nhiễm lipid máu. Trong số 14 bệnh nhân tăng cholesterol, nồng độ
6

cholesterol trong huyết tương giảm 35%; trong 25 bệnh nhân tăng triglycerid,
nồng độ triglycerid huyết tương giảm 35% [39].
G. pentaphyllum cũng được thử nghiệm ở dạng viên nang mềm chứa
dịch chiết saponin toàn phần. Trên 300 bệnh nhân từ bệnh viện hữu nghị
Sino-Japan, đã cho thấy sự giảm rõ rệt lượng cholesterol, triglycerid,
fibrinogen và tăng lượng HDL [20].
- Tác dụng trên đường huyết
Dịch chiết gypenosid (100 và 200 mg/kg) dùng qua đường uống trong 2
tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải
thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose
(2 g/kg) [36].
- Tác dụng trên tim mạch
Nghiên cứu do Circosta và các cộng sự năm 2005 dịch chiết nước của G.
pentaphyllum (2,5; 5 và 10 mg/kg tiêm tĩnh mạch) có thể bảo vệ được lợn với
chứng loạn nhịp tim [12].
- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
Cao G. pentaphyllum (450 mg/kg) có tác động ức chế những hoạt động
tự phát của chuột nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột khi đang ở
trên tấm kim loại nóng [36].
Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu gypenosid liều 100
mg/kg hạn chế rõ rệt sự phá hủy AND và ARN [17].
- Tác động trên chức năng miễn dịch
Gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg trong 7 ngày gây
tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong
huyết thanh và giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng IgG huyết thanh tăng
và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim [36].

7

- Tác dụng trên ung thư
Gypenosid toàn phần 50 mg/kg qua dạ dày trong 7 ngày có tác dụng ức
chế sarcoma (S180) ở chuột nhắt [18]. Khi dùng liều 30 và 300 mg/kg qua dạ
dày hoặc 120 mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày đã cản trở quá
trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt. Gypenosid nồng độ 0,38-0,75%
invitro đã trực tiếp gây hại lên các tế bào S180 [36].
G. pentaphyllum cũng hỗ trợ cơ thể, giúp cơ thể chống lại và ức chế tế
bào ung thư phổi ở người [21]. Gypenosid ức chế sự phát triển dòng tế bào
ung thư gan (Hep3B and HA22T) [11].
- Tác dụng trên sự kết tập tiểu cầu
Gypenosid có tác dụng chống huyết khối [83] do gypenosid làm giảm
hoạt tính của nhiều yếu tố đông máu và làm tăng tốc độ điện di hồng cầu ở
mẫu máu lấy từ người. Một nghiên cứu khác cho thấy G. pentaphyllum với
liều 40 mg/kg ức chế quá trình kết tập tiểu cầu ở huyết thanh thỏ bằng cách
tăng nồng độ AMP vòng tiểu cầu và làm hạn chế sự phóng thích tiểu cầu [37].
1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng.
Giảo cổ lam được dùng chủ yếu dưới 2 dạng là trà giảo cổ lam và viên
uống giảo cổ lam. Các sản phẩm này đều là thực phẩm chức năng, giúp hỗ trợ
điều trị bệnh mỡ máu cao, huyết áp cao, tiểu đường tuýp II. Ngoài ra sản
phẩm còn tăng lưu thông máu, hỗ trợ điều trị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt,
giúp dễ ngủ, ngủ sâu giấc, tăng khả năng làm việc, giảm căng thẳng, mệt mỏi.
Các sản phẩm từ GCL được lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo
cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Thiên Bảo, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam
Tam Đảo…Các sản phẩm từ GCL cũng xuất hiện trên thị trường Nhật Bản,
Trung Quốc và Thái Lan.
8

1.2. PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH
DƢỢC LIỆU
1.2.1. Phƣơng pháp HPLC
 Nguyên tắc:
HPLC là 1 kỹ thuật tách trong đó các chất di chuyển qua cột chứa các hạt
pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng
giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh
và pha động [1]. Pha động đi qua cột sử dụng áp suất cao, kết quả mỗi thành
phần trong hỗn hợp ra khỏi cột với thời gian khác nhau và rửa giải được dựa
trên độ phân cực. Sau khi qua cột, các chất tan tách ra được ghi nhận bằng 1
detector lắp đặt trong hệ thống [7]
Hình 1.2 Sơ đồ máy HPLC [7]

Các nét gạch không liên tục tượng trưng cho các bộ phận tùy chọn không bắt buộc.
9

 Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký
a) Thời gian lƣu
Thời gian lưu (t
R
hay đôi khi còn được ký hiệu là R
t
) của 1 chất tan là
thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký
đồ.
Thời gian lưu lý tưởng t
o
là thời gian lưu của 1 chất tan không bị giữ lại
bởi pha tĩnh. Trên thực tế, thời gian lưu lý tưởng là thời gian cần thiết để pha
động đi ra khỏi hệ thống tính từ lúc bơm mẫu [7].

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của 1 chất tan
(giống như giá trị R
f
của vết trong sắc ký lớp mỏng). Trong những điều kiện
sắc ký nhất định (cột, pha động, nhiệt độ, tốc độ dòng ) thì thời gian lưu là 1
hằng số với 1 chất tan.
b) Độ chọn lọc
Độ chọn lọc là một biểu hiện về mức độ tách giữa 2 đỉnh. Độ chọn lọc là
tỷ số giữa các thể tích hoặc thời gian lưu của các đỉnh trên sắc ký đồ.



V
R1
, V
R2
: thể tích lưu của chất tan 1, 2. V
0
: Thể tích lưu lý tưởng.
t
R1
, t
R2
: Thời gian lưu của chất tan 1, 2. t
o:
Thời gian lưu lý tưởng.
k’
1
, k’
2

: Hệ số dung lượng của chất tan 1, 2
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [7].
c) Độ phân giải
Hệ số phân giải thể hiện mối liên quan giữa hiệu lực của cột và của dung
môi trên sắc ký. Độ nhọn của đỉnh tùy thuộc vào hiệu lực cột, khoảng cách
giữa hai đỉnh tùy thuộc vào hiệu lực dung môi.

'
'
1
2
01
02
01
02
k
k
tt
tt
VV
VV
R
R
R
R









ww
t
t
R
R
R
S
21
1
2
)
(2



t
R1
, t
R2
: thời gian lưu của hai đỉnh 1, 2.
W
1
, W
2
: chiều rộng của 2 đỉnh 1, 2 [7].
10

1.2.2. Ứng dụng của HPLC trong phân tích Dƣợc liệu và các hợp chất tự
nhiên
 Vai trò, tầm quan trọng
HPLC là công cụ đáng tin cậy cho việc tách các hỗn hợp phức tạp, cho
hiệu quả tách và độ nhạy cao, thường xuyên đổi mới về mức độ thuận tiện,
tốc độ phân tích, sự lựa chọn của cột HPLC đang đóng vai trò quan trọng
trong nhiều lĩnh vực. Với khả năng phân tích nhanh, hiệu quả, áp dụng rộng
rãi với nhiều mẫu phức tạp, HPLC đang trở thành công cụ không thể thiếu
trong các ngành khoa học và công nghệ.
Vai trò:
- Giúp xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn
định, kiểm soát chất lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo
dược [18].
- Cho phép xác định nồng độ chưa biết của 1 chất trong một dung dịch biết
trước, phân tích các thành phần có hàm lượng thấp, thậm chí các thành
phần dưới dạng vết trong các hỗn hợp phức tạp [7].
 Ứng dụng HPLC trong kiểm nghiệm dƣợc liệu và hợp chất tự nhiên
 Định tính dược liệu và các hợp chất tự nhiên
+ Xác định độ tinh khiết: Khi chất chỉ có 1 đỉnh đối xứng, tách riêng biệt
không bị chồng phủ với các đỉnh kế cận thì có khả năng là 1 chất tinh khiết.
+ Định tính
- Phương pháp “dấu vân tay”: Thường áp dụng cho DL có thành phần hóa
học chưa được biết rõ dựa trên nguyên tắc so sánh sự phù hợp của các
đỉnh, dữ liệu sắc ký của dược liệu hoặc phân đoạn phân tích với mẫu đối
chiếu.
- Phương pháp định tính với chất đánh dấu và chất chuẩn
11

Dựa vào thời gian lưu của mẫu thử và mẫu đối chiếu. Để khẳng định kết
quả có thể khảo sát trên 2 điều kiện thực nghiệm khác nhau hoặc khi hệ thống

có trang bị các detector cung cấp dữ liệu liên quan như phổ IR, UV, MS…Do
dược liệu có nhiều thành phần khác nhau nên có thể định tính dựa vào các
hoạt chất chính của DL hoặc các chất đánh dấu.
 Định lượng dược liệu và các hợp chất tự nhiên
+ Khi không có chất chuẩn: Dựa vào nguyên tắc quy về 100% diện tích pic.
+ Có chất chuẩn:
- Phương pháp chuẩn nội: đưa chất chuẩn nội vào mẫu thử và tiến hành sắc
ký. Áp dụng khi không có chất chuẩn đối chiếu do kém bền hoặc quá
đắt…
- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp phổ biến để định lượng các
thành phần trong dược liệu và các hợp chất tự nhiên. Nguyên tắc là so sánh
trực tiếp chiều cao hoặc diện tích pic của dung dịch thử với dung dịch
chuẩn tương ứng có nồng độ đã biết [7].

1.3 PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN TRONG THỰC PHẨM VÀ
DƢỢC LIỆU
Chiết pha rắn ( SPE ) là một kỹ thuật chiết xuất sử dụng một pha rắn và
một pha lỏng để tách một, hoặc một loại chất phân tích từ một dung dịch. SPE
thường được sử dụng để làm sạch mẫu trước khi sử dụng một phương pháp
phân tích sắc ký hoặc 1 phương pháp khác để định lượng chất phân tích trong
mẫu.
SPE chia thành 4 loại chính như sau:
 Pha đảo
Pha động phân cực hoặc phân cực trung bình. Pha tĩnh không phân cực.
Chất phân tích có độ phân cực trung bình đến không phân cực. Sự lưu giữ của
12

chất phân tích phụ thuộc vào cấu trúc của chất phân tích, chứ không phải là
tương tác của các nhóm chức trên chất phân tích với bề mặt chất hấp thụ.
Pha tĩnh là các silica liên kết với các gốc -alkyl, -aryl như octadecyl,

octyl, xyclohexyl, butyl, phenyl…[13], [40].
 Pha thuận
Chất phân tích phân cực, DM pha động có độ phận cực từ trung bình đến
không phân cực như hexan, aceton…và pha tĩnh phân cực. Sự lưu giữ của
một chất phân tích trong pha thuận chủ yếu do sự tương tác giữa các nhóm
chức phân cực của chất phân tích và nhóm phân cực trên bề mặt chất hấp thụ,
bao gồm liên kết hydro, tương tác л-л, và 1 số tương tác khác.
Pha tĩnh: silicagel liên kết với các nhóm cyano, amin hoặc diol… [13],
[40].
 Trao đổi ion
Cơ chế chủ yếu dựa vào lực hút tĩnh điện của nhóm chức mang điện tích
trong các hợp chất với nhóm mang điện tích được liên kết với bề mặt silica.
Pha tĩnh là các silica liên kết với các nhóm mang điện tích như – SO
3
-
,
-N
+
(CH
3
)
3
[13], [40].
 Hấp phụ
Chất hấp thụ phổ biến và thường được sử dụng là: Florisil (1 loại
Magnesi Silicat), Alumina (Al
2
O
3
). Florisil và Alumina thích hợp cho việc

làm sạch các dịch chiết thực phẩm chứa chất béo, thuốc trừ sâu…[13], [40].
Ngoài ra còn có nhựa hấp phụ lỗ lớn là các polyme ưa nước, bền, có khả
năng hấp phụ cao, chi phí tương đối thấp, và dễ dàng tái tạo [31]. Nguyên tắc
của nhựa hấp phụ dựa trên sự khác biệt về trọng lượng phân tử, mức độ phân
cực, hoặc hình dạng phân tử, dẫn đến sự khác biệt ái lực với chất hấp phụ
[10]. Trong những năm gần đây, nhựa lỗ lớn đã được áp dụng rộng rãi để tách
và làm sạch các thành phần hoạt tính sinh học của các loại thảo dược.
13

Các loại nhựa được sử dụng nhiều hiện nay: D101, DA201, Diaion, chuỗi
SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111,
WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9, …[23].
Chúng tôi xin trình bày sâu hơn về nhựa Diaion - loại nhựa được sử dụng
trong khóa luận:
- Diaion là tên gọi chung của nhiều nhựa (resin) polyme tổng hợp được
điều chế nhờ quá trình đồng trùng hợp giữa styren và divinyl benzen. Hoạt
động theo cơ chế chủ yếu là phân bố pha đảo dưới tên gọi chung là Diaion
HP.
- Phân loại: Tùy kích thước hạt và đường kính của xoang, có 4 loại
Diaion HP là Diaion HP-10, 20, 30, 40. Thông dụng nhất là Diaion HP-20.
- Ứng dụng: Diaion HP-20 là một lựa chọn rất tốt trong việc phân tích
các hợp chất tan nhiều trong các dung môi phân cực mạnh (polyphenol,
glycosid…) vốn rất khó phân lập bằng cơ chế hấp phụ. Diaion HP-20 chủ yếu
được sử dụng như một pha tĩnh nhằm mục đích phân tích một hỗn hợp đa
thành phần thành các nhóm hợp chất có độ tan khác nhau trong các dung môi
khác nhau, các nhóm hợp chất này thường là một hỗn hợp. Ít khi Diaion
HP-20 được sử dụng nhằm mục đích phân lập ngay một hỗn hợp đa thành
phần thành các chất tinh khiết riêng biệt.

1.4 DẤU VÂN TAY TRONG HPLC VÀ XU HƢỚNG ĐỊNH TÍNH

DƢỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC
1.4.1. Phƣơng pháp dấu vân tay trong HPLC
 Định nghĩa: Dấu vân tay sắc ký của thảo dược và các loại thuốc thảo dược
là mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính
hóa học trong chiết xuất [24].

14


 Đặc điểm:
- Phương pháp phổ biến nhất trong nhiều phòng thí nghiệm là HPLC-UV
và HPLC-DAD (70%), HPLC-MS chiếm khoảng 20%, HPLC-ECD
3%, HPLC-NMR 2% và ELSD 1,5% [24].
- Việc tách chất được thực hiện chủ yếu với sắc ký pha đảo C18, hệ dung
môi ACN-H
2
0 hoặc MeOH-H
2
0 với chế độ rửa giải Gradient [24].
- Phương pháp dấu vân tay trong sắc ký có thể được thực hiện 1 cách
chính xác ngay cả khi số lượng hoặc nồng độ của các thành phần hóa
học đặc trưng không tương tự như nhau trong các mẫu khác nhau [18].
- Đánh giá dấu vân tay sẽ dựa trên những điểm tương đồng và / hoặc sự
khác biệt của các hình dạng sắc ký, hoặc mức độ tách và phân phối tập
trung mỗi thành phần hóa học từ sắc ký thu được giữa các thảo dược
khác nhau [18].
1.4.2. Xu hƣớng định tính dƣợc liệu và chế phẩm đông dƣợc.
- Xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất của thuốc
thảo dược và các sản phẩm liên quan của thảo dược đó [24].
- Phân tích các dẫn xuất có tác dụng dược lý và sinh học đặc trưng theo

các nguồn gốc địa lý khác nhau [38].
- Theo dõi sự ổn định thể hiện qua sự già hóa của dược liệu và các chế
phẩm của dược liệu trong quá trình tồn trữ và bảo quản từ đó xác định
tuổi thọ thuốc. Tiến hành sắc ký và theo dõi kết quả HPLC định kỳ xác
định “dấu vân tay” của mẫu thuốc. Xem xét sự biến đổi đáng kể của
“ dấu vân tay” như mất đi hoặc xuất hiện các đỉnh mới, giảm cường độ
các đỉnh chủ yếu…thì mẫu thuốc đã có sự biến đổi thành phần [7].
- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, kiểm nghiệm bán thành phẩm từ dược
liệu… Phương pháp này có thể ứng dụng vào định tính kiểm tra trong
15

quá trình sản xuất (In Process Control-IPC) hay định tính kiểm tra
thành phẩm viên nang OPZEN…[7].
- Hiện nay còn có khái niệm “Dấu vân tay sinh học Bio-Fingerprint”
trong nghiên cứu dược liệu. Theo khái niệm này, các phân đoạn hay
hợp chất chiết tách từ dược liệu chỉ được xem là phù hợp với mẫu đối
chiếu tương ứng khi thể hiện các tác dụng tương ứng trên các mô hình
sàng lọc, đánh giá sinh học [7].

16

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1.1. Nguyên liệu
Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ
60
0
C (tủ sấy Shellab) và bảo quản trong túi nilon kín ở nơi khô ráo, thoáng
mát của loài G. pentaphyllum thu hái tại Đà Lạt (5 mẫu).

2.1.2. Dụng cụ thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies 1200 Series.
- Cột sắc ký: StableBond Analaytical ZORBAX SB-C18 4,6 x 250mm,
5µm, AgilenTechnologies - Mỹ.
- Tiền cột: SB-C18.
- Màng lọc 0,45 µm.
- Cân phân tích Precisa XT220A.
- Máy chiết siêu âm Qsonica - Mỹ.X
- Tủ sấy SHELLAB.
- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF
254
của MERCK
(Đức).
- Tủ sấy BINDER – Đức.
- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200.
- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống nghiệm, ống đong,
ống ly tâm, phễu lọc, cốc có mỏ, đũa thủy tinh
Nghiên cứu sử dụng các bộ dụng cụ tại phòng thí nghiệm của bộ môn
Dược liệu và bộ môn Vật lý - Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.3. Hóa chất
- Dung môi dùng cho quá trình chiết xuất: EtOH, MeOH, nước cất.
17

- Chất chuẩn tinh khiết Rb1 chiết xuất từ Panax ginseng C.A.Mey của
công ty Shanghai TautoBiotech, độ tinh khiết đạt 97%.
- Hóa chất tinh khiết dùng cho chạy máy HPLC: Acetonnitril, Methanol,
Nước…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế phân đoạn saponin toàn phần
từ dược liệu Giảo cổ lam.

- Khảo sát các điều kiện để định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng
phương pháp HPLC: Bước sóng, hệ dung môi, tốc độ dòng, thể tích
tiêm mẫu.
- Thẩm định lại phương pháp vừa xây dựng: Độ phù hợp của hệ thống,
độ lặp lại, độ ổn định.
- Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành định tính saponin trong
một số mẫu Giảo cổ lam của loài G. pentaphyllum.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ
dƣợc liệu.
a) Chiết xuất
Trịnh Thị Diệp Thanh, khóa luận tốt nghiệp dược sỹ năm 2013 đã tiến
hành khảo sát quy trình chiết xuất dược liệu chứa saponin trong GCL với 3
phương pháp: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, với mỗi phương pháp
sử dụng 4 dung môi khác nhau là MeOH 4:1, EtOH 50%, 70%,

90%.
Khảo sát các phương pháp và dung môi khác nhau nhằm đảm bảo hợp lí
cả hai yêu cầu: chiết được tối đa lượng chất nghiên cứu và tối thiểu tạp chất
để thuận tiện cho quá trình tinh chế và định tính tiếp theo.
Kết quả thu được cho thấy chiết siêu âm với EtOH 70% là phương pháp
chiết đơn giản, nhanh chóng, dung môi rẻ tiền, an toàn và hàm lượng saponin