Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ DIỆP THANH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ DIỆP THANH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện
Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo
cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu,
trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản
thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn.
Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh
người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên
trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học
Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược
liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt
và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ
để tôi có kết quả ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Trịnh Thị Diệp Thanh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN 2
1.1.1. Saponin 2

1.1.2. Saponin nhân Dammaran 2
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA
PENTAPHYLLUM 6

1.2.1. Chi Gynostemma Blume 6
1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 7
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG
SAPONIN 9

1.3.1. Chiết xuất 9
1.3.2. Tinh chế 9
1.3.3. Định lượng 10
1.4. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 11
1.4.1. Phổ hấp thụ UV-VIS 11
1.4.2. Định luật Lambert – Beer. 11

1.4.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một
thành phần 13

1.5. TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ 15
1.5.1. Định nghĩa và phân loại 15
1.5.2. Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin 15
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 17

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 17
2.1.1. Nguyên liệu 17
2.2.2. Dụng cụ thiết bị 17

2.1.3. Hóa chất 18

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.3.1. Chiết xuất 18
2.3.2. Tinh chế 22
2.3.3. Định lượng bằng phương pháp đo quang 22
2.3.4. Thẩm định và đánh giá phương pháp 24
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 25
2.3.6. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng saponin toàn phần
trong một số mẫu Giảo cổ lam. 27

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 28
3.1. KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ MẪU 28
3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết xuất 28
3.1.2. Khảo sát phương pháp tinh chế 29
3.1.3. Quy trình xử lí mẫu 30
3.3. KHẢO SÁT CỰC ĐẠI HẤP THỤ QUANG VÀ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG 31
3.3.1. Khảo sát cực đại hấp thụ quang 31
3.3.2. Khảo sát điều kiện phản ứng 32
3.4. THẨM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP UV-VIS KHI ĐỊNH
LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM. 36

3.4.1. Thẩm định phương pháp 36
3.4.2. Đánh giá phương pháp. 41
3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VỪA XÂY DỰNG VÀO ĐỊNH LƯỢNG
MỘT SỐ MẪU GIẢO CỔ LAM 42

3.5.1. Quy trình định lượng 42
3.5.2. Xây dựng công thức tính hàm lượng saponin toàn phần trong GCL 44

3.5.3. Kết quả 44
3.6. BÀN LUẬN 45
3.6.1. Về phương pháp chiết xuất và tinh chế mẫu 45


3.6.2.
Về khảo sát điều kiện đo quang 45
3.6.3. Về thẩm định phương pháp định lượng 45
3.6.5.Về kết quả định lượng saponin trong các mẫu Giảo cổ lam 47
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48
4.1. KẾT LUẬN 48
4.2. ĐỀ XUẤT 49


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C
chuẩn
, C
thử
: Nồng độ của chất chuẩn, chất thử
D
: Mật độ quang
ELSD
: Detector tán xạ bay hơi
(Evaporative light scattering detector)
ESI
: Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)
EtOH
: Ethanol
G. : Gynostemma

GCL
: Giảo cổ lam
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
MeOH
: Methanol
RI
: Chỉ số khúc xạ (Refractive Index)
RSD
: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
SD
: Độ lệch chuẩn(Standard Deviation)
SKLM
: Sắc kí lớp mỏng
STT
: Số thứ tự
TT
: Thuốc thử
tt/tt
: Thể tích/thể tích
UV – VIS
: Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible)
V
: Thể tích


DANH MỤC BẢNG BIỂU
STT
Tên bảng biểu
Trang

1
Bảng 1.1. Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G.
pentaphyllum
4
2
Bảng 3.1. Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ GCL bằng
các phương pháp và dung môi chiết khác nhau
28
3
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi rửa giải
29
4
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng
33
5
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
33
6
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
34
7
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
35
8
Bảng 3.7. Kết quả xây dựng đường chuẩn
37
9
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
38
10

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
40
11
Bảng 3.10. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng
phương pháp cân và phương pháp UV-VIS
41
12
Bảng 3.11. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong các mẫu
Giảo cổ lam
44


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
1
Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin
triterpen tetracyclic
3
2
Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum
4
3
Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7
4
4
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Ginsenoside Rb1
5
5

Hình 1.5. Ảnh của cây Giảo cổ lam
7
6
Hình 1.6. Kĩ thuật thêm đường chuẩn
14
7
Hình 2.1. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
19
8
Hình 2.2. Bộ dụng cụ chiết hồi lưu
20
9
Hình 2.3. Máy chiết siêu âm
20
10
Hình 2.4. Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp
cân bằng các phương pháp chiết và dung môi khác nhau
21
11
Hình 3.1. Quy trình tinh chế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết
lỏng-lỏng
31
12
Hình 3.2. Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng
32
13
Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
33
14
Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng

34
15
Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử Vanilin
35
16
Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric
36
17
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ
chất chuẩn tại bước sóng 550nm
37
18
Hình 3.8. Đồ thị xác định hàm lượng saponin toàn phần trong
mẫu GCL theo kỹ thuật thêm đường chuẩn
39

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay trên thế giới, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc
mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Giảo cổ lam là một vị thuốc quý
được người dân ở nhiều nước châu Á sử dụng từ lâu đời nhằm tăng cường sức khỏe
và tuổi thọ. Nhiều báo cáo khoa học chứng minh một số tác dụng sinh học của Giảo
cổ lam như: hạ đường huyết, giảm cholesterol, giảm triacylglycerol máu …, trong
đó saponin được cho là thành phần tạo nên các tác dụng sinh học này.
Trên thị trường Việt nam hiện nay xuất hiện rất nhiều chế phẩm Giảo cổ lam
dưới dạng trà và được người dân sử dụng rộng rãi. Vì vậy việc quản lí chất lượng
dược liệu là một vấn đề cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng của các sản
phẩm cũng như việc sử dụng thuốc trong dân gian có hiệu quả. Tuy nhiên Dược
điển Việt Nam chưa có chuyên luận về dược liệu Giảo cổ lam nên quá trình đánh
giá còn gặp nhiều khó khăn.

Với mục đích xác định hàm lượng saponin trong Giảo cổ lam, đồng thời xây
dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm Giảo cổ lam đang được
sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm
phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc, chúng tôi đã
tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong Giảo cổ lam
bằng phương pháp đo quang” với các mụ
c tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu
Giảo cổ lam.
2. Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam
bằng phương pháp đo quang.
3. Thẩm định phương pháp xây dựng được và ứng dụng để định lượng saponin
toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam.
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN
1.1.1. Saponin [15]
• Định nghĩa
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong
thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao.
• Phân loại, cấu trúc hóa học.
- Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia thành saponin
triterpenoid và saponin steroid.
- Saponin triterpenoid có loại trung tính và loại acid, saponin steroid có loại
trung tính và loại kiềm.
- Saponin triterpenoid có phần genin gồm 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm
hemiterpene, chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin
triterpenoid tetracyclic.
+ Saponin triterpenoid pentacyclic: gồm 4 nhóm là olean, ursan, lupan hopan.

+Saponin triterpenoid tetracyclic: gồm 3 nhóm là dammaran, lanostan và
cucurbitan.
- Saponin steroid được chia thành 5 nhóm: nhóm spirostan, nhóm furostan,
nhóm aminofurostan, nhóm spirosolan và nhóm solanidan.
1.1.2. Saponin nhân Dammaran
Theo các nghiên cứu [24], [27], [32] saponin là một trong những nhóm chất
chính của các loài trong chi Gynostemma, trong đó chủ yếu là các saponin thuộc
nhóm Dammaran. Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm cấu trúc này.
Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid
tetracyclic). Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép
lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây
thuộc chi Panax, họ Araliaceae. Đặc biệt saponin trong nhân sâm (Panax ginseng)
có nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu.
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

17
18
19
20
21
22
24
26
27
23 25
28 29
30

Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
• Tác dụng sinh học của các saponin nhân Dammaran
Có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng của triterpenoid dammaran trong
nhân sâm và các loài thuộc chi Gynostemma, trong đó nổi bật là các tác dụng
- Chống mệt mỏi và tăng sức đề kháng: các saponin triterpenoid tetracyclic
nhóm dammaran của nhâm sâm có tác dụng cải thiện rõ rệt tinh thần cũng như thể
chất, tác dụng kéo dài thời gian sống trên động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh cũng
đã được chứng minh.
- Tác dụng hạ cholesterol đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm.
- Tác dụng hạ đường huyết do các saponin này có khả năng chuyển glucose
thành glycogen và ngăn ngừa hiện tượng giảm glycogen.
• Các saponin trong chi Gynostemma
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc
nhóm dammaran. Đã có trên 100 saponin trong thành phần G. pentaphyllum được
phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại
protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [24],
[32], Rc [27], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [27], Rg3 [29],

malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [24]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol
[27]. Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây
và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ
Araliaceae. Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy
trong loài Gymnema sylvestra [35]. Các saponin còn lại chiếm phần lớn các
4
gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G. pentaphyllum. Cấu trúc một số saponin
trong G. pentaphyllum được trình bày ở hình 1.2, hình 1.3 và bảng 1.1.

R
7
R
5
R
6
1 9
18
20
30
28
29
17
R
3
R
4
O
R
2
R

1

Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong
G.pentaphyllum

CH
2
OH
OH
OH
OOH
O
OCH
3
CH
2
O
OH
Glu
O
Rha
a
b
c
d
e
f
g
h
i

Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7

Bảng 1.1. Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G. pentaphyllum
Nhóm thế
Một số saponin tương ứng
R
2
- H
- OH
Gypenosid I, Rb1
Gynos TN1, Gynos TN2
R
3
- CH
3
hoặc - CH
2
OH
- CHO
Gypenosid I, Rb1
Gylongiposid I
R
4
- OH
- H
= O
Rb1
Gylongiposid I
Gypentonosid A

R
5
- OH
- đường đôi
Rg3, Rf
Rb1, gymnemasid II
R
6
- CH
3
hoặc - CH
2
OH
- CH
2
O -glu hoặc CH
2
O –xyl
Rb1
R
7
Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i
Các ginsenoid đều có cấu trúc a
5

Loại đường chính trong saponin của GCL (hầu hết thuộc dạng pyranose) là β-
D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20.
Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH
3
, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là

nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3). Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β).
Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng được phát
hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S,
24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [26]. Các saponin trong GCL đa số ở
dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [28] và
gynosaponin TN1 [30].
• Saponin Ginsenoside Rb1
- Tên IUPAC: (20S)-3β-[(2-O-β-d-Glucopyranosyl-β-d- glucopyranosyl)oxy]-
20-[(6-O-β-d-glucopyranosyl-β-d- glucopyranosyl)oxy]-5α-dammar-24-en-12β-ol.
H
H
H
O
O
H
O
H
O
H
O
OO
O
H
H
O
H
O O
H
O
O

H
O
H
O
H
O
O
O
O
H
H
O O
H
O
H
H
O

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Rb1
- Công thức phân tử: C
54
H
92
O
23
- Trọng lượng phân tử
: 1109.29448
(g/mol).
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH,
H

2
O.
- Tác dụng dược lý: tác dụng an thần,
tốt cho đường tiêu hóa, tăng sức chịu
đựng, bảo vệ gan và là chất chố
ng oxy
hóa, chống mệt mỏi, chống co giật,
giảm đau và chống loét [17].

6
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI
GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM
1.2.1. Chi Gynostemma Blume
• Vị trí phân loại chi Gynostemma
Theo các tài liệu [10], [13], chi Gynostemma được xếp vào họ Cucurbitaceae
(họ bầu bí). Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược:
Ngành Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Sổ Dilleniidae
Liên bộ Hoa tím Violanae
Bộ Bí Cucurbitales
Họ Bầu bí Cucurbitaceae
Chi Gynostemma
• Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma
Chi Gynostemma được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc
điểm hình thái của loài G. simplicifolium [34]. Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài
được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung [10], [34]:
Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng
cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy
mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con;

cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi
hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột.
Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô. Bầu hình cầu nhỏ, 2-3 ngăn, 2-3 vòi nhụy
với đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2-3 hạt
hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi.
Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và
Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Loài G.
pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca,
Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [
34].
7
• Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam
Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [5], [10], chi Gynostemma
có 2 loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino và G. laxum (Wall.) Cogn. Năm 2009
Ths. Hoàng Văn Lâm đã công bố thêm 1 loài mới thuộc chi Gynostemma, bổ sung
vào hệ thực vật Việt Nam là G. longipes C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [22].
Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố ở Việt Nam.
1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM
• Đặc điểm thực vật.

Hình 1.5. Ảnh cây Giảo cổ lam
Cây thảo mọc leo, yếu, thân cành
mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có
lông thưa thớt ở mấu. Lá kép chân vịt,
cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7
lá chét với mép có răng. Tua cuốn
mảnh, xẻ đôi ở đỉnh. Cụ
m hoa đ
ực
dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh,

phân nhánh nhiều, cỡ 10-15cm.
Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, đỉnh
nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ
2,5-3 × 1mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực.
Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm
nhụy có 2 thùy. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5-6 mm, khi chín màu đen,
2 hạt. Hạt hình trứng hoặc hình tim, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [5], [6], [7].
• Phân bố, thu hái
Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ
cao 2000m, ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Vĩnh
Phúc, Đà Lạt, Đắc Nông, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Nai [
5], [6].
8
• Thành phần hóa học
Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong cây có chứa saponin, flavonoid,
acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử [4], [9], [11], [14], [20]. Bằng phương
pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si,
Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag. Trong đó, nguyên tố có hàm lượng
cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0.0001%) [7].
• Tác dụng dược lý
Trên thế giới loài G. pentaphyllum đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh
học, trong đó [19]:
- Tác dụng hạ cholesterol: các gypenosid trong G. pentaphyllum làm giảm
cholesterol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) và rất thấp (VLDL), làm tăng
lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) và tỉ lệ HDL/LDL.
- Trên đường huyết: các dịch chiết gypenosid với liều uống 100 và 200 mg/kg
thể trọng chuột trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột
cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng
glucose (2g/kg).
- Tác dụng trên tim mạch: gypenosid (nồng độ 50, 100 và 200 µg/ml) có tác

dụng bảo vệ cơ tim bằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và oxygen, ức
chế giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH).
- Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300
mg/kg thể trọng trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng
thành phần có hoạt tính trong huyết thanh, giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng
IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim.
- Tác dụng chữa khối u: tác dụng này do một vài saponin có trong G.
pentaphyllum. Khi dùng gypenosid liều 30mg/kg và 300mg/kg qua dạ dày hoặc
120mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày nhận thấy tác dụng cản trở quá
trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt.
- Cao G. pentaphyllum (450 mg/kg) ức chế những hoạt động tự phát của chuột
nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột đang ở trên tấm kim loại nóng.
9
Các nghiên cứu về loài G. pentaphyllum ở Việt Nam cho thấy dược liệu GCL
có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u và
tăng đáp ứng miễn dịch [2], [7], [8], [11], [12].
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH
LƯỢNG SAPONIN
1.3.1. Chiết xuất [15]
- Saponin loại trung tính và acid: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để
loại chất béo, chiết saponin bằng methanol-nước (4:1). Loại methanol dưới áp suất
giảm. Hoà cặn trong nước được dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-
butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để chấm sắc
ký. Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng
lớn gấp 10-15 lần (có thể dùng aceton hoặc n-hexan thay ether).
- Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột
dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy. Dịch lọc đem bốc hơi
đến khô. Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 80
0
C rồi kiềm hoá

bằng amoniac. Tủa được ly tâm rồi hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký.
1.3.2. Tinh chế [15]
Ðể tinh chế, có thể thực hiện với các phương pháp sau:
- Thẩm tích.
- Dùng bột MgO hoặc bột polyamid để tách saponin ra khỏi tanin: hòa saponin
vào nước, trộn với bột polyamid hoặc bột MgO trên nồi cách thủy 10 phút để có
khối nhão, chiết saponin từ khối nhão này bằng ethanol 80% nóng. Lọc rồi bốc hơi.
- Dùng Sephadex loại G-25, G-50, G-75: lượng Sephadex dùng gấp 50 lần
saponin, đem ngâm nước cất cho trương lên, gạn lượng nước thừa, cho gel vào cột
sắc ký.
Dung dịch đậm đặc saponin trong nước cho lên phần trên cột rồi khai triển
bằng nước cất. Saponin có phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước saponin có phân tử nhỏ.
- Saponin steroid có thể tinh chế bằng cách kết hợp với cholesterol: 1g saponin
hoà trong 200ml ethanol đun nóng đến 50-60
0
C rồi cho tác dụng với một dung dịch
10
Trong đó
S: hàm lượng saponin (%)
a: khối lượng saponin toàn phần (g)
M: khối lượng dược liệu (g)




chứa 2g cholesterol trong 200ml ethanol đã đun nóng, tủa phức sẽ tạo thành. Lọc
tủa, sấy khô, phá phức bằng cách hoà tan trong pyridin. Saponin tinh khiết được tủa
trong ether. Hoà tan trong methanol để loại hết cholesterol rồi lại tủa với ether.
1.3.3. Định lượng [15].
• Phương pháp cân

Bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, sau đó chiết
saponin bằng MeOH:H
2
O = 4:1. Loại MeOH dưới áp suất giảm. Hòa cặn trong
nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung
môi dưới áp suất giảm đến cắn, để trong bình hút ẩm, cân đến khi khối lượng không
đổi. Thực hiện thao tác chiết, cân, lấy trung bình 3 lần và suy ra lượng saponin thô
toàn phần trong dược liệu.
Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần
Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức:
S =
)
1( x
M
a
−×
%
100×





• Phương pháp HPLC
Đây là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định lượng
các chất nói chung và saponin nói riêng.
- Pha tĩnh cho HPLC dùng kiểm nghiệm các saponin thường là pha đảo RP-18.
Pha tĩnh theo cơ chế rây phân tử cũng có thể được dùng.
- Hệ dung môi được sử dụng trong HPLC là hỗn hợp nước-methanol-
acetonitril với các tỉ lệ khác nhau, có hay không có dung dịch đệm. Chương trình

dung môi có thể là isocratic hoặc gradient.
Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ số khúc xạ (RI) hay tán xạ bay
hơi (ELSD). Detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ (MS hay
11
MS/MS với kĩ thuật ion hóa ESI hay APCI). Do các saponin ít có các nối đôi, nhất
là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm, do đó
việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế trong phân tích saponin.
1.4. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS)
1.4.1. Phổ hấp thụ UV-VIS [1]
Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản xạ,
tán xạ, hấp thụ, huỳnh quang và quang hóa. Khi đo quang phổ tử ngoại khả kiến,
người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra. Vì bức xạ điện từ là các hạt
mang năng lượng nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ electron của phân tử
và làm tăng nội năng của nó. Năng lượng tổng của một phân tử bao gồm: năng
lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử (E
t
), năng lượng của điện tử (E
e
), năng
lượng của các dao động (E
v
) và năng lượng của chuyển động quay (E
r
).
E
tổng
= E
t
+ E
e

+ E
v
+ E
r
(E
e
>> E
v
>> E
r
)
Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại-khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng điện
tử E
e
và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là phổ điện tử.
1.4.2. Định luật Lambert – Beer [1].
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I
0
qua dung
dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là L. Khi đi qua dung dịch, một
phần ánh sáng sẽ bị hấp thụ lại, một phần bị phản xạ, phần còn lại sẽ đi qua dung
dịch với cường độ I .
Mối quan hệ giữa phần ánh sáng I và
thể hiện bằng định luật Lambert - Beer

Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc nồng
độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào
dung dịch.
* Điều kiện ứng dụng của định luật.
- Chùm tia sáng phải đơn sắc.

- Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp).
12
- Dung dịch phải trong suốt.
- Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh sáng
(UV – VIS).
* Một số đại lượng thông dụng
- Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang)
Đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt hóa học) của dung dịch, được định nghĩa

Thường T tính ra phần trăm. Một chất có T=1 (hay 100%) nghĩa là hoàn toàn
không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt.
- Độ hấp thụ
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa:

Đối với 1 chất xác định (có ε xác định) thường đo trên 1 loại cốc đo và thường
có bề dày l=1cm, như vậy độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch:

- Hệ số hấp thụ riêng (

Theo công thức
nếu l=1cm, C=1% thì

Vậy
chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo có
bề dày 1cm. Với 1 chất tan xác định, tại một ε xác định,
là một hằng số.
- Hệ số hấp thụ phân tử (

Hệ số hấp thụ phân tử (còn gọi là hệ số mol) là độ hấp thụ của dung dịch có
nồng độ 1M, dùng cốc đo có bề dày 1cm.

13
Cũng như
, với 1 chất xác định, trong điều kiện đo nhất định (bước sóng,
dung môi, nhiệt độ…)
là 1 hằng số.
Giữa
và có mối liên hệ
Trong đó: M là phân tử lượng gam của chất tan.
1.4.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một
thành phần [3]
Đối với dung dịch một thành phần có thể sử dụng các kĩ thuật định lượng sau.
• Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo được
Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một
bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong
dung môi tương ứng tại bước sóng này. Nồng độ dung dịch được tính theo công
thức:

Muốn áp dụng kĩ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng
và giá trị mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng
đáp ứng của định luật Lambert – Beer.
• Đo so sánh với dung dịch chuẩn
Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ C
x
(chưa biết) được tiến
hành đồng thời với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ C
c
đã biết chính xác, trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer thì C
x
được
tính theo công thức:

Trong kĩ thuật so sánh, kết quả càng chính xác khi nồng độ C
x
càng gần với
nồng độ dung dịch chuẩn C
c

• Kỹ thuật đường chuẩn
Là so sánh dung dịch thử với nhiều dung dịch chuẩn bằng cách chuẩn bị 5-8
dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau. Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn
1%
1cm
x
x
E
A
C =
c
c
x
x
c
x
c
x
C.
A
A
C
C

C
A
A
=→=
14
và vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch
chuẩn. Trong trường hợp các dung dịch đo thỏa mãn điều kiện định luật Lambert-
Beer thì đường chuẩn thẳng, sau đó từ mật độ quang của dung dịch thử, dựa vào
phương trình đường chuẩn để tính ra nồng độ của dung dịch thử.
• Kỹ thuật thêm chuẩn
Để hạn chế ảnh hưởng của tạp chất người ta đưa thêm vào dung dịch thử một
lượng chính xác chuẩn làm cho nồng độ dung dịch tăng thêm một lượng C
o.
Đo mật
độ quang của dung dịch thử (A) và dung dịch thử thêm chuẩn (A’), nồng độ của
dung dịch thử được tính theo công thức
=  C
x
= * C
o

• Kỹ thuật thêm đường chuẩn
Được tiến hành bằng cách thêm chính xác các lượng chất chuẩn khác nhau vào
dung dịch cần định lượng. Vẽ đường chuẩn thể hiện mối quan hệ của mật độ quang
và nồng độ dung dịch thử thêm chuẩn. Giao điểm của đường chuẩn với trục nồng độ
là giá trị nồng độ dung dịch cần định lượng.
C
x
x
A

A
Nång ®é chuÈn thªm vµo
Dung dÞch thö thªm chuÈn
Nång ®é
dd thö
0

15
1.5. TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ
1.5.1. Định nghĩa và phân loại
Nhựa hấp phụ là hạt polymer hình cầu, màu trắng, có cấu trúc xốp với các lỗ
lớn trên bề mặt; hấp phụ nhờ lực liên kết tự do Vander Waals hoặc liên kết hydro,
có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách
các nhóm chất khác nhau [37].
Nhựa hấp phụ có thể được chia thành hai loại chính: không phân cực và phân
cực. Theo độ phân cực được chia thành phân cực yếu, phân cực trung bình và phân
cực mạnh. Được sử dụng nhiều hiện nay gồm các loại nhựa: D101, DA201, D,
chuỗi SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111,
WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9,… [20].
1.5.2. Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin
Tại Mỹ, nhựa hấp phụ chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp hóa chất,
luyện kim, thực phẩm với tác dụng làm sạch và khử trùng nước uống [21], loại bỏ
chất thải công nghiệp chứa các ion Cr (VI) độc hại [31]. Tại Trung Quốc, nhựa chủ
yếu được sử dụng trong công nghệ thực phẩm và Y học cổ truyền [20].
Wang Hong và cộng sự đã sử dụng nhựa D101, ngoài ra có thể sử dụng
DA20111, D3520, AB8, AASI2, D3520, D4020 để nghiên cứu và tối ưu hóa việc
tách và tinh chế saponin toàn phần từ Sơn thù du (Cornus officinalis). Kết quả thu
được hàm lượng saponin toàn phần là 2.49%, cao hơn so với phương pháp tách
chiết bằng dung môi hữa cơ là 2,19%. Ngoài ra có thể sử dụng các loại nhựa khác
như DA20111, D3520, AB8, AASI2, D3520, D4020

Nghiên cứu đã chứng minh
nhựa hấp phụ còn cho hiệu quả tốt trong việc loại bỏ đường hòa tan trong nước và
các tạp chất khác. Phương pháp tách chiết dung môi thông thường có chi phí cao,
quá trình phức tạp, đặc biệt là việc sử dụng chiết xuất bằng dung môi hữu cơ là khó
khăn hơn trong sản xuất thực tế. Quy trình mới sử dụng nước – ethanol và nhựa hấp
phụ không chỉ đơn giản, tiết kiệm mà sản lượng sản phẩm và chất lượng còn được
cải thiện đáng kể [33]. Zhang Chongxi sử dụng nhựa D101 cho tỉ lệ thu
Ginsenosides lên đến 90% với độ tinh khiết cao nhất, đưa tổng hàm lượng saponin
16
trong nhâm sâm khô đạt 60% [36]. Liu Chen và cộng sự nghiên cứu sử dụng trên
Ngũ gia bì (Acanthopanax) với 3 loại nhựa D101, NKA9, AB8, sử dụng phương
pháp HPLC để định lượng glycoside D. Kết quả D101, NKA9, AB8 có khả năng
hấp phụ bão hòa tương ứng là 11.88 mg/g; 7.92 mg/g và 12.18 mg/g [26]. Li-Sheng
Wang và cộng sự dùng phương pháp TLC để kiểm tra khả năng hấp phụ của nhựa
D101 đối với saponin trong Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis). Kết quả nhựa
D101 có thể hấp phụ 8,7% đến 27,3% saponin, tăng 20% - 52,1% so với phương
pháp thông thường [25].