Định tính saponin trong giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



PHẠM THỊ LAN
ĐỊNH TÍNH SAPONIN
TRONG GIẢO CỔ LAM
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện
Bộ môn Dược Liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI -2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ LAN
ĐỊNH TÍNH SAPONIN
TRONG GIẢO CỔ LAM
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn

ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện
Bộ môn Dược liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI – 2013


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ sự kính trọng và
lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh, người thầy đã tận tình hướng
dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức cũng như những kinh nghiệm
nghiên cứu khoa học quý báu. Tôi cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới sự
giúp đỡ của ThS. Lê Thanh Bình, người đã cho tôi sự hỗ trợ kịp thời trong
quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang
công tác tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều
kiện để tôi hoàn thành khóa luận đúng hạn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn
sâu sắc tới gia đình, bạn bè tôi, những người đã luôn tin tưởng, cổ vũ, động
viên tôi trong học tập và trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Phạm Thị Lan

MỤC LỤC


LỜI CẢM ƠN
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM 2
1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume 2
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume 2
1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma Blume tại Việt Nam 3
1.1.2. Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam 5
1.1.2.1. Saponin trong Giảo cổ lam 5
1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid 10
1.1.2.3. Các chất khác 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG
CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0 12
1.3.1. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer
chromatography: HPTLC) 12
1.3.2.Camag Reprostar 3 138
1.3.3.Linomat 5.0 14
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên liệu 16
2.2. Phương tiện nghiên cứu 16
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh 16
2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ 17
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 18


2.3.2. Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng 193
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Thực nghiệm và kết quả 21
3.1.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 21
3.1.1.1.Chuẩn bị dịch chiết 21
3.1.1.2. Điều kiện sắc ký 21
3.1.2. Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam 24
3.1.2.1. Định tính các mẫu thuộc loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
Makino 24
3.1.2.2. Định tính các loài Giảo cổ lam Việt Nam 303
3.2. Bàn Luận 3539
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 404
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BuOH Buthanol
EtOH Ethanol
G Gynostemma
GCL Giảo cổ lam
NXB Nhà xuất bản
SKLM Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen
tetracyclic
5
2
Hình 1.2. Khung cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum
(Thunb.) Makino
6
3
Hình 1.3. Cấu trúc epoxy dammaran từ G. pentaphyllum
(Thunb.) Makino
8
4
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Gylongosid A
9

5
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Gylongosid B
9
6
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vinagynostesid A
10
7
Hình 1.7. Camag reprostar 3
13
8
Hình 1.8. Linomat 5.0
15
9
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước
18
10
Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum
(Thunb.) Makino trong n – BuOH bão hòa nước, quan sát
dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366
nm và phun
hai loại thuốc thử hiện màu
22
11
Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum
(Thunb.) Makino ở Đắc Nông trong n – BuOH bão hòa nước
với các thể tích chấm lần lượt từ 1µl đến 5µl sau khi khai
triển với hệ dung môi (I), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và
phun thuốc thử hiện màu
23
12

Hình 3.3. Hình ảnhsắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu thuộc loài
G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử
ngoại bước sóng 254 nm
25
13
Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu loài G.
pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử
ngoạibước sóng 366 nm
27


14
Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu G.
pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi phun thuốc thử hiện
màu
28
15
Hình 3.6. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo
cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh
sáng tử ngoại bước sóng 254 nm
31
16
Hình 3.7. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo
cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam khi quan sát
dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm
32
17
Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo
cổ lam Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử
vanillin – acid sulfuric

33




DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1. Saponin thường gặp trong G. pentaphyllum (Thunb.)
Makino
7
2
Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC
12
3
Bảng 3.1. Giá trị R
f
của các vết quan sát được trên sắc ký đồ
của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở ánh sáng tử
ngoại bước sóng 254 nm
25
4
Bảng 3.2. Giá trị R
f
và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của
các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi hiện màu
28

5
Bảng 3.3. Giá trị R
f
của các vết trên sắc ký đồ của dịch chiết
một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan
sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm
31
6
Bảng 3.4. Giá trị R
f
và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của
một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume sau khi
hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric
34
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở
Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kì đã
phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Trong những năm gần đây,
Giảo cổ lam được trồng trên diện rộng ở các địa phương, được chế biến thành
các sản phẩm chè Giảo cổ lam đa dạng và được lưu thông rộng rãi trên thị
trường như Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam Tam
Đảo… Do nguồn gốc Giảo cổ lam phức tạp, không rõ ràng lại được sử dụng
với số lượng lớn nên rất khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo,
dược liệu kém chất lượng vẫn lưu thông tự do trên thị trường ảnh hưởng đến
sức khỏe của nhân dân. Vì vậy, việc phân tích so sánh các mẫu Giảo cổ lam
và lựa chọn dược liệu sử dụng để đảm bảo chất lượng thuốc là hết sức cần
thiết.
Những nghiên cứu để đưa ra các tiêu chuẩn truyền thống về Giảo cổ lam

trước đây như cảm quan về hình thái, đặc điểm vi phẫu, chỉ thị hóa học… rất
khó để đánh giá chính xác chất lượng Giảo cổ lam. Vì vậy, việc phân tích
thành phần hóa học đặc biệt là thành phần saponin để bước đầu xây dựng tiêu
chuẩn vân tay hóa học của Giảo cổ
lam là rất quan trọng và và có ý nghĩa thực
tiễn trong kiểm soát nguồn gốc và chất lượng của dược liệu này. Xuất phát từ
yêu cầu thực tế trên, khóa luận
“Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng
sắc ký lớp mỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu:
- Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino.
- So sánh thành phần saponin giữa các loài GCL thuộc chi
Gynostemma ở Việt Nam.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM
1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume
Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật [15], Cây cỏ Việt
Nam [10], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu
bí). Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược
như sau:
Ngành Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Sổ Dilleniidae
Liên bộ Hoa tím Violanae
Bộ Bí Cucurbitales
Họ Bầu bí Cucurbitaceae
Chi Gynostemma.

Hiện nay, đã nhận dạng 21 loài của chi Gynostemma Blume. Ở Trung
Quốc đã được ghi nhận 14 loài [22]. Ở Việt Nam, chi Gynostemma Blume có
5 loài [23].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chiGynostemma Blume
Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825
dựa trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium [22]. Từ đó đến nay, đã
có thêm nhiều loài được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc
điểm chung như sau [10], [45]:
Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía
răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng
chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có
3

lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng
hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ
nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô. Nhụy: bầu
hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3 đầu nhọn.
Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên
hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi.
Các loài của chi Gynostemma Blume phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới
châu Á và Đông Nam Á từ Hymalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New
Guinea. Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino là loài phổ biến
nhất, nó phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn
Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [45].
1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam
Hiện nay có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố tại Việt Nam.
a. Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
- Đặc điểm thực vật:
Cây thảo, mọc leo, thân cành mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc lông
thưa thớt ở mấu. Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5

– 3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [6].
Cụm hoa đực dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài
rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng
hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5.
Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực. Hoa cái có đài và tràng
giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3, nhị lép 5, ngắn.
Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín màu đen.
Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù, gốc hình
tim dẹt.
Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [5], [6], [7].
4

Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm
bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [6].
- Phân bố: tại Việt Nam, cây mọc ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng
Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6].
b. Gynostemma longipes C.Y.W
- Đặc điểm thực vật:
Cây dây leo. Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác. Lá kép chân vịt.
Mép lá răng cưa to. Ngọn lá nhọn dài. Mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới
nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa. Lá bên nhỏ dần. Tua
cuốn mảnh, rẽ đôi muộn.
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh. Hoa đực rất
nhỏ, màu trắng. Đài 5 rời, hình tam giác. Tràng 5, hình tam giác, rời. Nhị 5,
chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, hình sao; bao phấn 2 ô.
Cụm hoa cái kép 3 lần chùm. Hoa cái, cuống dài 1,8 – 2,0 mm. Đài và
tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3 lá noãn hàn liền, 2 – 3
vòi nhụy mập, rời; núm nhụy chia 2 – 3; bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt.
Quả mọng, khi chín màu xanh, đường kính 6 – 7 mm, cuống quả dài 8 – 15
mm. Hạt hình tim, rộng 3 – 4 mm, màu xám nhạt, 2 mặt có hoa văn dạng cục,

viền hạt có răng cưa.
- Mùa hoa vào tháng 8 – 10, mùa quả vào tháng 11 – 12.
- Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [2].
c. Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.
- Tên khác: Cổ yếm lá bóng, Thư tràng thưa [5].
- Đặc điểm thực vật:
Cây dây leo mảnh, phân nhánh nhiều, nhẵn hoặc có lông tơ rất thưa,
gióng dài 10 – 20 cm. Lá mỏng, lá kép hình chân vịt, 3 lá chét, cuống dài 1,5
– 4 cm, nhẵn, gân phụ 5 – 7 cặp. Lá chét kích cỡ 4 – 10 × 2 – 3 cm; mép lá
5

hình sóng rãnh. Hoa khác gốc. Cụm hoa đực hình chùy, mọc ở ngọn hoặc ở
nách lá, dài 10 – 30 cm, có lông tơ mịn. Tràng hoa 5, rời, màu vàng xanh.
Kích thước 1,5 × 0,5 mm. Nhị 5, hàn liền ở chỉ nhị và bao phấn. Cụm hoa cái
giống cụm hoa đực, bầu hình cầu, đường kính 1 mm. Vòi nhụy 3, rời, xẻ đôi ở
đỉnh. Quả hình cầu, to 6 – 8 cm, màu vàng xanh, nhẵn, không tự mở, hơi dẹt.
Hạt 2 – 3, hình trứng rộng, đường kính 4 mm [5], [10]. Mùa hoa vào tháng 5.
- Phân bố:
Cây mọc ở độ cao 1200 m, trong các khu rừng, dọc theo các con suối
[25], [27].
Cây mọc leo ở các khu rừng thưa, savan cỏ, trên đất sét hoặc các rừng
cây bụi trên núi đá vôi.Ở Việt Nam, cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh: Lào
Cai, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Trị [5], [10].
1.1.2. Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam
1.1.2.1. Saponin trong Giảo cổ lam

1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24
26
27
23 25
28 29
30

Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong Giảo cổ lam
thuộc nhóm dammaran (hình 1.1). Dammaran là nhóm saponin triterpenic có
cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic). Trong công thức phân tử có 30
carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin

thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax L., họ
Araliaceae. Đặc biệt các saponin trong Nhân sâm (Panax ginseng C. A.
6

Mayer) cho thấy nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu.
a. Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino:
Đã có trên 100 saponintrong thành phần Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin
giống như loại protoPanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng C. A.
Mayer là Rb1 (Gypenosid III) [31], [42], Rc [33], Rb3 (Gypenosid IV), Rd
(Gypenosid VIII), F2 [33], Rg3 [35], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [38].
Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protoPanaxatriol [33]. Những ginsenosid đó
chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu
tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae [32]. Một
số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài
Gynostemma sylvestre (Retz) Schult [48]. Các saponin còn lại chiếm phần lớn
các gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G. pentaphyllum (Thunb.)
Makino.
R
7
R
5
R
6
1 9
18
2
0
30

28
29
17
R
3
R
4
O
R
2
R
1

CH
2
OH
OH
OH
OOH
O
OCH
3
CH
2
O
OH
Glu
O
Rha
a

b
c
d
e
f
g
h
i

Hình 1.2a Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino Hình 1.2b Các dạng cấu trúc R7
Hình 1.2. Khung cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino





7


Bảng 1.1. Saponin thường gặp trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các nhóm thế
Ví dụ
R1
Đường glu, rham, xyl, có thể 1 hoặc 2,
3 đường kết hợp với nhau

R2
- H
- OH
Gypenosid I, Rb1

Gynos TN1, Gynos TN2
R3
- CH
3
- CH
2
OH
- CHO
Gypenosid I, Rb1

Gylongiposid I
R4
- OH
- H
= O
Rb1
Gylongiposid I
Gypentonosid A
R5
- OH
- đường đôi; thường là glu kết hợp với
rha hoặc xyl
Rg3, Rf
Rb1, gymnemasid II
R6
- CH
3

- CH
2

OH
- CH
2
O -glu hoặc CH
2
O –xyl
Rb1
R7
Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i
Các ginsenoid đều có cấu trúc a

Loại đường chính trong saponin của G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
(hầu hết thuộc dạng pyranose) là β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-
L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20. Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -
CH¬3, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19
(R3). Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β) [31], [32].



8

R
3
O
O
R
2
R
1
O

OH
28
29
30
12
24
26
27
18

Hình 1.3. Cấu trúc epoxy dammaran từ G.pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được
phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-
epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [34].
Các saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đa số ở dạng bột vô
định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [31], Gynogenin II
[33] và Gynosaponin TN1 [31].
b. Loài Gynostemma longipes C.Y. Wu
Năm 1993, Sun và cộng sự đã phát hiện 2 saponin là Gylongosid A: 18-
Norfurostan-19-al, 23-hydroxy-4,4,8,14,24-pentamethyl-3-[(2-O-β-D-
xylopyranosyl-β-D-xylopyranosyl)oxy]- (3β,16ξ,21β)- (9Cl) và Gylongosid
B: 18-Norfurostan-19-al, 3-[(O-6-deoxy-β-L-mannopyranosyl (1→2)-O-β-D-
xylopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl)oxy]-23-hydroxy-4,4,8,14,24 -
pentamethyl-, (3β,16ξ,21β)- (9Cl) [40]. Năm 1997, Guo và cộng sự đã phân
lập được 3 saponin nhân dammaran trong đó có 1 saponin mới là
Gylongiposid 1: 19-oxo-3β,20(S),21-trihydroxydammar-24-ene-3-O-{[α-L-
rhamnopyranosyl(1-2)][β-D-xylopyranosyl(1-3)]} α-L-arabinopyranoside,
còn 2 chất còn lại là gypenosid XLIX và ginsenosid Rb1 [24].

9

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Gylongosid A


Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Gylongosid B

Năm 2010, Phan Thị Thảo đã tiến hành nghiên cứu loài Gynostemma
longipes ở Việt Nam và đã phân lập được 1 saponin là GCL1, dựa vào phổ
khối ESI – MS, 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HMBC, HSQC, 1H - 1H –
COSY đã xác định được cấu trúc của GCL1 là (20S,24R)-3β,12β,25-
trihydroxy-20,24-epoxydammaran3-O-{[α-L-rhamnopyranosy(1→2)][α-L-
rhamnopyranosy(1→3)][β-D-xylopyranosy(1→6)]} β-D-glucopyranoside,
đây là một saponin mới nên được đặt tên là vinagynosteside A [17].
10






Hình 1.6. Công thức cấu tạo của vinagynostesid A

c. Một số loài khác:
- Đã phân lập được saponin 1-8 từ phần trên mặt đất của loài
Gynostemma pubescens (Gagnep.) C.Y.Wu. Trong số chúng, hợp chất 1-4, có
8 nhóm carboxyl ở cả 2 vị trí C21 và C29, 5 có chứa một nhóm carboxylic ở
C-21 và một nhóm chức aldehyd ở C-29, 6 và 7 chứa nhóm carboxylic ở C-21
và 1 nhóm hydroxymethylen ở C-29 [46]. Đã nghiên cứu phân lập 6

dammaran glycosid mới từ dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất loài
Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex Oliver. Phần aglycol triterpenoid
có nhóm carbonyl ở cả C21 và C28, lần đầu tiên được tìm thấy trong họ
Cucurbitaceae [48].
1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid
Flavonoid cũng là một trong những nhóm chất chính trong các loài thuộc
chi Gynostemma Blume nhưng ít được nghiên cứu.
- Từ Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino đã phát hiện một số
flavonoid là ombuin, ombuoside, rutin [36]
, quercetin-di-(rhamno)-hexosid,
11

quercetin-rhamno-hexosid, kaempferol-rhamno-hexosidvà kaempferol-3-O-
rutinosid [38].
- Năm 2006, Yin và các cộng sự đã phân lập được 3 flavonoid là rutin,
kaempferol và quercetin từ loài Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex
Oliver [48].
- Một nghiên cứu của các tác giả tại Đại học Y Quảng Tây (Trung Quốc)
so sánh hàm lượng của flavonoid trong 6 loài Gynostemma thu hái tại Quảng
Tây bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng 510 nm, so sánh với
chuẩn nội rutin
cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong loài
Gynostemma guangxiense X.X.Chen&D.H.Qin là cao nhất [28].
1.1.2.3. Các chất khác
- Sterol: chiếm 1 lượng nhỏ (khoảng 0.0001%) bao gồm các loại ergostanol,
sitosterol và stigmasterol [34].
- Nghiên cứu phương pháp xác định chlorophyll và dẫn chất trong G.
pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng HPLC-MS. Đã tách và xác định được
trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino có 15 chlorophyll và dẫn chất:
Pheophytina, pheophytin a’, chlorophyll a, chlorophyll a’, hydroxypheophytin

a, hydroxypheophytin a’, pheophytin b, pheophytin b’, chlorophyll b,
chlorophyll b’, hydroxychlorophyll b, hydroxypheophytin b và
hydroxypheophytin b’ [26].
- Bằng
phương pháp phân tích điện di mao quản đã phát hiện trong dịch chiết
nước G. pentaphyllum (Thunb.) Makino có 1 loại hetero polysaccharid không
tinh bột có thành phần chính là monosaccharid, galactose, arabinose,
rhamnose, galacturonic acid, xylose, manosevà acid glucuronic [46].
- Nhóm alcaloid được báo cáo là không có trong G. pentaphyllum (Thunb.)
Makino [19].
12

1.2. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG
CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0
1.3.1. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin
layer chromatography: HPTLC)
Hệ thống thiết bị tinh vi, được điều khiển bởi một nền tảng phần mềm
tích hợp đảm bảo đến mức độ cao nhất tính hữu ích, độ tin cậy, và độ lặp lại
của các kết quả [20], [38].
Các dụng cụ:
- Thiết bị chia mẫu.
- Thiết bị triển khai sắc ký.
- Triển khai sắc ký theo chiều dọc.
- Triển khai sắc ký theo chiều ngang.
- Triển khai sắc ký tự động.
- Triển khai nhiều sắc ký đồ.
- Thiết bị densitometer.
- Máy quét.
- Máy lưu kết quả: lưu hình ảnh sắc ký đồ ở các bước sóng tử ngoại và
sau khi phun thuốc thử [38].

Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC [38], [37]
Đặc điểm
HPTLC
TLC
Kỹ thuật
Tự động
Thủ công
Kích thước hạt
hấp phụ
5 – 6µm
10 – 12µm
Độ dày bản mỏng
100µm
250µm
Chiều cao đĩa
12µm
30µm
Hiệu quả
Cao do kích thước hạt nhỏ
hơn
Thấp hơn
13

Phân tách ở
3 – 5 cm
10 – 15 cm
Thời gian phân
tích
Khoảng cách di chuyển

ngắn hơn nên thời gian
phân tích giảm
Lâu hơn
Pha tĩnh
Nhiều sự lựa chọn như
silicagel trong trường hợp
thông thường và C
8
, C
18

cho pha đảo
Silicagel, kielsulguhr,
alumina
Bình khai triển
Kiểu mới do yêu cầu lượng
nhỏ hơn của pha động
Yêu cầu lượng lớn hơn
Lấy mẫu
Tự động
Thủ công
Thể tích chấm
0,1 – 0,5 µl
1 – 5 µl
Số vết
≤ 36
≤ 10
Quét hình ảnh
Sử dụng UV / máy quét
huỳnh quang để quét toàn

bộ sắc ký đồ và máy qu
ét
là hình thức cao
densitometer
Không
Thời gian tách
3 – 20 phút
20 – 200 phút
Giới hạn phát
hiện
( hấp phụ )
100 – 500 pg
1 -5 ng
Giới hạn phát
hiện huỳnh quang
5 – 10 pg
50 – 100 pg
1.3.2. Camag Reprostar 3

14

Hình 1.7. Camag Reprostar 3
Camag reprostar 3, là bộ phận chụp hình ảnh sắc ký đồ, gồm một máy
ảnh đứng và các thiết bị đáp ứng yêu cầu tạo ra một bước sóng ánh sáng phù
hợp.
Các loại bước sóng ánh sáng:
- 254 nm, UV bước sóng ngắn – ánh sáng thường.
- 366nm, UV bước sóng dài – ánh sáng thường.
- Ánh sáng trắng 400 – 750 nm – ánh sáng thường, ánh sáng truyền qua,
ánh sáng thường kết hợp ánh sáng truyền qua.

Máy ảnh trong các reprostar có thể là máy ảnh thông thường, máy ảnh
lấy ảnh ngay, tuy nhiên tốt nhất là nên sử dụng máy ảnh kỹ thuật số, hoặc một
camera hiện đại.
Để đảm bảo hình ảnh sắc nét và khả năng lặp lại giữa các lần chụp, trong
camag reprostar 3 cần:
- Một ống kính có tiêu cự cố định.
- Bỏ qua chức năng zoom để đảm bảo hình ảnh của cùng một đĩa định
dạng luôn có cùng kích thước.
- Thời gian bản mỏng tiếp xúc với ánh sáng được tính toán tự động bằng
winCATS để vùng sáng của hình ảnh được tối ưu.
Vỏ tủ đảm bảo loại trừ hoàn toàn ánh sáng của môi trường xung quanh,
do đó cammag reprostar 3 thực hiện được việc chụp ảnh dưới các loại ánh
sáng trong một phòng không được làm tối [51].
1.3.3. Linomat 5.0




15








Hình 1.8. Linomat 5.0
Các Linomat 5.0 là thiết bị độc lập và là công cụ lý tưởng cho việc đưa
mẫu lên bản mỏng để triển khai sắc ký lớp mỏng.Với phiên bản được điều

khiển bằng phần mềm cho phép HPTLC được ứng dụng rộng rãi. Linomat 5.0
là một thiết bị bán tự động có thể thay thế cho thiết bị tự động ATS 4 mà
không ảnh hưởng đến chất lượng của hệ thống. Thiết bị này được dùng trong
phân tích định tính và định lượng, phù hợp với lượng mẫu trung bình. Trái
ngược với ATS 4, việc thay đổi mẫu đối với Linomat 5.0 được thực hiện thủ
công.
Các tính năng chính:
- Hoạt động theo chế độ độc lập hoặc theo winCATS.
- Đưa mẫu thành dải hẹp bằng cách phun kỹ thuật.
- Áp dụng các giải pháp trên sắc ký phẳng.
- Hoạt độngbán tự động, việc thay đổi mẫu (làm sạch, làm đầy và thay
thế ống tiêm) được thực hiện bằng tay [20].





16

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 4 loài Giảo cổ lam với 16 mẫu khác
nhau bao gồm:
- Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái tại các địa
phương khác nhau gồm: Tam Đảo (5 mẫu), Đà Lạt (4 mẫu), Đắc Nông (1
mẫu), Hòa Bình (3 mẫu). Trong 5 mẫu Tam Đảo, có 3 mẫu có cách trồng
khác nhau (trồng ngoài nắng, trồng giâm hom trong nhà lưới, trồng xen kẽ với
cây rừng và cây ăn quả), 2 mẫu thu hái tại thời điểm khác nhau (3 tháng, 4
tháng).

- Loài Gynostemma longipes C.Y.W
- Loài Gynostemma laxum (Wall).Cogn.
- Loài Gynostemma pubescen (Gagn.) C.Y.W.
Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ
60
0
C (tủ sấy Shellab có quạt thông gió), sau đó được nghiền thành bột và
được bảo quản trong túi nilon ở nơi khô ráo, thoáng mát.
Nguyên liệu thành phẩm: chè Giảo cổ lam Ba Tri (được cung cấp bởi
công ty TNHH Hoàng Tùng), Giảo cổ lam Tuệ Linh (được cung cấp bởi công
ty TNHH Tuệ Linh).
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh
a. Các thuốc thử:
- Dung dịch H
2
SO
4
10%/ EtOH.
- Dung dịch vanillin - acid sulfuric được tạo bởi 2 dung dịch:
• Dung dịch 1: vanillin 1%/EtOH.