Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học của cây nút áo

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Vũ
Vân Anh – những người thầy đã trực tiếp dạy dỗ và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giảng viên, kỹ thuật viên
bộ môn Thực Vật vì đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành
khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo và cán bộ trường Đại học
Dược Hà Nội đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong 5 năm học tại trường.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè tôi, gia đình tôi - những người luôn
bên cạnh tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Vũ Lê Thu









BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VŨ LÊ THU

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC
DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


VŨ LÊ THU

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC
DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. Th.S Vũ Vân Anh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013




LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Vũ
Vân Anh – những người thầy đã trực tiếp dạy dỗ và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giảng viên, kỹ thuật viên
bộ môn Thực vật vì đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành
khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo và cán bộ trường Đại học
Dược Hà Nội đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong 5 năm học tại trường.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tôi, bạn bè tôi - những người luôn
bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Vũ Lê Thu

MỤC LỤC
Trang
Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Đặt vấn đề………………………………………………………………………… 1
Phần 1 - Tổng quan……………………………………………………………… 3
1.1. Đặc điểm thực vật và phân loại chi Spilanthes………………………………3
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Spilanthes……………………………………… 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Spilanthes và một số loài thuộc
chi này……………………………………………………………………….3
1.2. Thành phần hóa học của cây Nút áo………………………………………….5
1.3. Tác dụng sinh học, công dụng của cây Nút áo……………………………….8
1.3.1. Tác dụng sinh học của cây Nút áo…………………………………… 8
1.3.2. Công dụng, cách sử dụng của cây Nút áo………………………………… 8
1.4. Một số vi khuẩn gây sâu răng……………………………………………… 10
Phần 2 – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu………………………………….12
2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………12
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu…………………………………………………… 12
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu…………………………………………………… 13
2.2. Nội dung nghiên cứu…….……………………………………………………13
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật………………………………………………13
2.2.2. Thử hoạt tính sinh học …………………………………………………… 14
2.2.3 Định tính các thành phần hóa học và phân lập một số thành phần hóa học
trong mẫu cây Nút áo có hoạt tính……………………………………………14
2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………… 14
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật………………….………………………………… 14

2.3.2. Thử hoạt tính sinh học bộ phận trên mặt đất cây Nút ……… …………….15
2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học ………………… 18


Phần 3 – Thực nghiệm, kết quả và bàn luận…………………….……………… 20
3.1. Kết quả thực nghiệm…………………………………………………………20
3.1.1. Nghiên cứu về thực vật…………………………………………… 20
3.1.2. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết các phần trên mặt đất…………… 28
3.1.3. Nghiên cứu thành phần hóa học………………………………………… 32
3.2. Bàn luận ……………………………………………………… 45
3.2.1. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu….……………………… 45
3.2.2. Bàn luận về kết quả nghiên cứu………………………………………… 46
Kết luận và kiến nghị……….…………………………………………………….50
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
Phụ lục 1: Hình ảnh một số loài thuộc chi Spilanthes
Phụ lục 2: Sắc kí khí khối phổ tinh dầu Nút áo
Phụ lục 3: Đường kính vòng vô khuẩn các mẫu thử
Phụ lục 4: Hình ảnh peak SKLM các phân đoạn M, A, B, C
Phụ lục 5: Phổ NMR của A20.4.6.
Phụ lục 6: Bảng so sánh sắc kí NMR của A20.4.6 và β-sitosterol
Phụ lục 7: Phiếu giám định tên khoa học và giấy chứng nhận mã số tiêu bản

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection
DM Dung môi
CC Column Chromagraphy
GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry
HPTLC High performance thin layer chromatography
L. Carl Linnaeus
MBC Minimum Bactericidal Concentration.
MIC Minimum Inhibitory Concentration
NCTC National Collection of Type Cultures
NMR Nuclear magnetic resonance
S. Spilanthes
sp. species
SKLM Sắc kí lớp mỏng
TLTK Tài liệu tham khảo
TT Thuốc thử
VSV Vi sinh vật
UV Ultraviolet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng số Tên bảng Trang
1.1 Các chất chuyển hóa thứ cấp trong chi Spilanthes 7
2.1 Bảng kí hiệu các mẫu thực nghiệm 12
3.1 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn các mẫu thử 28
3.2 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu thử và Gentamycin 31
3.3 Kết quả định tính các nhóm chất trong cụm hoa Nút áo 32
3.4 Hàm lượng các thành phần trong tinh dầu hoa Nút áo 33
3.5 Kết quả định tính các cắn A, B, C bằng phản ứng hóa học 36
3.6 Số peak sắc kí SKLM từng phân đoạn M, A, B, C 37
3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 20.4.6 43
3.8 Bảng so sánh đặc điểm hình thái các mẫu nghiên cứu 46










DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình số
Tên hình
Trang
1.1
Spilanthol
6

1.2
Stigmasterol
6
2.1
Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng vi sinh vật
17
3.1
Ảnh hình thái các mẫu Nút áo
22
3.2
Ảnh hình thái lá các mẫu Nút áo
22
3.3
Hình vẽ hình thái các mẫu Nút áo
22
3.4
Hình thái cụm hoa các mẫu Nút áo
23
3.5
Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp1 (V) chụp qua kính lúp soi
nổi
23
3.6
Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp2 (L) chụp qua kính lúp soi nổi
24
3.7
Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp3 (T) chụp qua kính lúp soi nổi
24
3.8
Hình ảnh vi phẫu rễ Nút áo

27
3.9
Hình ảnh vi phẫu thân Nút áo
27
3.10
Hình ảnh vi phẫu lá Nút áo
28
3.11
Hình ảnh các mẫu có hoạt tính
30
3.12
Hình ảnh đĩa thạch thử VH và Gentamycin
31
3.13
Đường đáp ứng của Gentamycin với Streptococcus mutans
31
3.14
Sơ đồ chiết xuất và chiết phân đoạn
34
3.15
Hình ảnh SKLM cắn M và các phân đoạn A,B,C trong hệ
37


dung môi CHCl
3
– MeOH (9:1)
3.16
Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộp lần 1 với hệ dung môi
n-Hexan – EtOAc (3:1)

40
3.17
Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộp lần 2 với hệ dung môi
n-Hexan - EtOAc (3:1)
40
3.18
Hình ảnh SKLM phân đoạn A20.4.6
41
3.19
Cấu trúc hóa học của hợp chất 20.4.6
42






1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Họ Cúc (Asteraceae) được xem như là họ lớn nhất trong ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta) với 1620 chi và 23600 loài phân bố ở khắp nơi trên thế giới(theo
dữ liệu của Vườn thực vật Hoàng gia Kew)[19]. Với đặc điểm đa dạng về loài và
phân bố như vậy, họ Cúc có ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực và đem lại
giá trị thương mại cao.
Nút áo (hay còn gọi là Cúc áo, Nụ áo, Cỏ the, Cuống trầm…[7] [8]) là tên gọi
chung một số loài thuộc chi Spilanthes của họ Cúc. Cây Nút áo từ lâu đã được các
thầy lang, các nhà khoa học, thực vật học nghiên cứu rất nhiều và cho thấy tác dụng
hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh như: đau răng, viêm miệng, đau họng, bại lưỡi,
sốt rét, viêm phế quản, hen suyễn, các bệnh ngoài da, phong thấp, đau xương, bệnh

scorbut…Tuy nhiên, công dụng phổ biến nhất của cây Nút áo là chữa đau nhức
răng, sâu răng bằng các giã nhỏ, ngâm rượu để ngậm hoặc đặt trực tiếp vào chỗ
răng đau [13].Với nhiều tác dụng như vậy, Nút áo được xem là một dược liệu rất
đáng để khai thác, đặc biệt là hướng đến việc điều trị các bệnh liên quan tới nhiễm
khuẩn răng miệng. Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu về cây Nút áo đã được
tiến hành rất nhiều. Tuy nhiên, về thực vật, trong khi số lượng loài trong chi
Spilanthes khá lớn và phân bố hầu như rộng khắp trong cả nước nhưng vẫn chưa có
nghiên cứu nào thực hiện việc so sánh đặc điểm hình thái của các loài để tránh
nhầm lẫn khi giám định tên khoa học các loài đó. Ở Việt Nam, các đề tài nghiên
cứu về hóa học, thực vật cũng như hoạt tính sinh học của cây Nút áo còn hạn chế.
Những đề tài nghiên cứu về mặt hóa học chủ yếu dừng lại ở việc định tính các
nhóm hợp chất trong hoa Nút áo. Còn về mặt nghiên cứu tác dụng sinh học của cây
thì hoàn toàn chưa được thực hiện.
Xuất phát từ những lí do trên, nhằm tìm hiểu sâu hơn về nguồn gốc và đặc
điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nút áo, chúng tôi
tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học của cây Nút áo” với các mục tiêu sau:
2

1. Mô tả đặc điểm thực vật của các mẫu cây Nút áo, giám định được tên khoa học
của các mẫu này.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học của cụm hoa cây Nút áo.
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của cây Nút áo bằng việc xác định mức độ ức chế
vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans của dịch chiết phần trên mặt đất, so
sánh hoạt tính sinh học của dịch chiết với Gentamycin.

3

PHẦN 1-
TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN LOẠI CHI SPILANTHES
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Spilanthes [1], [6], [9], [10], [13], [14]
Chi Spilanthes thuộc họ Cúc (Asteraceae), bộ Cúc (Asterales), phân lớp Cúc
(Asteridae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Spilanthes và một số loài thuộc chi
này
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Spilanthes
Cây cỏ, mọc hàng năm, cao trung bình từ 40 đến 60 cm [52]. Lá mọc đối. Cụm
hoa đầu ở ngọn hay ở nách lá, thường có cuống dài; tổng bao lá bắc xếp 1-2 dãy. Đế
hoa lồi. Hoa vàng hay trắng, hoa hình lưỡi nhỏ là hoa cái, tràng ngắn; hoa hình ống
là hoa lưỡng tính, có 4-5 thùy; nhị 5, bao phấn có mũi bởi một phần phụ hình tam
giác cứng, có tai ở gốc hay không; bầu thường có lông mi, vòi có 2 nhánh cụt. Quả

đóng dẹp [6].
1.1.2.2. Đặc điểm một số loài thuộc chi Spilanthes
Chi Spilanthes có khoảng 60 loài [32], phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới.
Ở nước ta có khoảng 5-6 loài. Trong khuôn khổ của khóa luận này chỉ đề cập đến
đặc điểm thực vật của các loài sau:
a. S. oleracea L.
Cây cỏ, thân nằm rồi đứng, cao 20-50cm, màu tía. Lá hình tam giác, mép
nguyên hay có răng cưa, gân chính 3, gân phụ 5 cặp; cuống lá 1-1,5cm. Cụm hoa
đầu mọc đơn độc ở ngọn cành, cuống ngắn 1,5-2cm, tổng bao lá bắc có 2 hàng lá,
hoa đầu rộng 8mm (không kể hoa). Quả đóng, đường kính 2mm, màu đen, không
lông [6], [7], [10].
4

Phân bố ở châu Mỹ, châu Phi và cả châu Á. Ở nước ta phân bố ở khắp nơi,
khắp các độ cao [6], [7].
b. S. acmella L.Murr.
Cây cỏ, mọc hàng năm, cao khoảng 30-60cm, mọc đứng, có khi mọc bò lan
trên mặt đất, phân thành nhiều cành. Lá mọc đối, phiến tam giác hoặc bầu, dài 3-7
cm, rộng 1-3cm, gốc hơi thuôn, ngọn lá nhọn, mép có răng cưa hoặc hơi lượn sóng,
gân chính 3, cuống dài. Cụm hoa đầu, mọc ở ngọn cành hay nách lá. Đế hoa có hình
nón nhọn; mào lông có 2 răng cứng. Hoa màu vàng, hoa hình lưỡi nhỏ có tràng rất
nhỏ, nhìn không rõ, hoa hình ống có tràng hình bầu dục; bao phấn có phần phụ hình
tam giác, có tai ở gốc; bầu hình bầu dục, có lông. Quả bế, dẹp màu nâu, mép có gờ
nhỏ, 2 răng gai ở ngọn [7], [9], [10], [13], [62].
Mùa hoa từ tháng 1 đến tháng 5 trở đi [7], [13].
S. acmella mọc hoang ở khắp các nơi đất ẩm. Có ở Việt Nam, Lào,
Campuchia, Ấn Độ, Malaixia, Philipin… Cây có nguồn gốc ở Nam Mỹ [9].
c. S. paniculata Wall. ex DC
Cây cỏ, mọc hàng năm, cao 20-60cm, thân tròn, bò hay đứng lúc non có lông
mịn. Lá có phiến hình tam giác, gốc lá tù hay tròn, dài 2,5-4cm, rộng 1,5-2cm, gân

chính 3, gân phụ 3 cặp, có lông rồi không lông, cuống dài. Cụm hoa đầu, 1-3 đầu ở
nách lá, cuống dài đến 12cm, tổng bao lá bắc 1-2 hàng. Hoa hình lưỡi nhỏ ít, 3-5
hoa, hoa hình ống nhiều. Quả đóng, dẹp, mép mỏng, lông dài, ở đầu quả có 2 răng
gai cao [6], [7], [10]. Ra hoa từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [6], [7].
Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Malaixia [6]. Ở nước ta mọc ở nơi
đất khô, đất hoang từ vùng thấp tới vùng cao 1700 m [6], [7], [10].
d. S. iabadacensis A. H. Moore
Cây cỏ, hàng năm, cao 60-80cm. Lá có phiến bầu dục, đầu tù hay hơi nhọn,
mép nguyên hay có răng. Cụm hoa đầu, nhiều, tập hợp thành ngù, cuống dài 12cm.
5

Lá bắc 5-7, cùng một cỡ, đế hoa sau dài 4-5mm. Quả đóng có rìa lông cao 1,5mm
[6], [10]. Ra hoa vào tháng 1 [6].
Phân bố ở Việt Nam, Thái Lan, Campuchia, Indonexia. Ở nước ta có gặp từ
Nghệ An vào Quảng Trị và Kon Tum [6].
Mọc ở ven hồ và các bãi ẩm, ở độ cao từ 400 đến 1200m [6], [10].
e. S. grandifllora Turcz.
Cây cỏ, cao 1m. Lá có phiến thon, gốc lá tù, ngọn lá nhọn, mép có răng nằm,
gân phụ 5 cặp, cuống lá dài. Cụm hoa đầu, tận cùng cành, cuống dài 5-10cm; tổng
bao lá bắc có 3 hàng, không lông hoặc có lông. Quả đóng, dẹp, trụi, không lông
[10].
f. S. calimorpha A.H.Moore
Cây cỏ, hàng năm, cao 40-80 cm. Thân hình trụ, hơi có màu tía, không lông,
phân nhánh ở phần trên, trên các đốt có rễ. Lá đơn, mọc đối, hình ngọn giáo rộng,
dài 3-7cm, rộng 1,5-2,5 cm, đầu có mũi nhọn, gốc hình nêm, mặt trên màu lục, mặt
dưới màu lục tro, mép có răng thô hoặc lượn sóng; gân bên 2-4 đôi. Cụm hoa đầu,
màu vàng, ở nách lá hoặc ở ngọn thân; lá bắc 2, cuống hoa dài 5-9cm; hoa ở mép
hình lưỡi nhỏ là hoa cái; hoa hình ống là hoa lưỡng tính. Quả đóng [6].
Phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Thái Lan và Indonexia. Ở nước ta gặp
tại Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng và Lạng Sơn [6].

Cây mọc trên các trảng cây bụi và ven rừng thưa, ở độ cao từ 300 đến 1300 m
[6].
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO
Theo các tài liệu cho thấy thành phần hóa học trong cây Nút áo (Spilanthes
spp.) bao gồm các chất sau: Spilanten (trong tinh dầu từ cụm hoa cũng như toàn
cây) [7], [9] Spilanthol hay N-isobutyl-2E, 6Z, 8E-decatrienamide (cao nhất ở hoa
[52]) [9], [10], [16], [29], [32], [36], [41], [49], [54], [60].
6

Trong lá và đọt non có chứa: Nước 86,8 %, protid 7,8 % , glucid 8,3 %, xơ 1,6
%, tro 1,5 %, caroten 5,6mg%, vitamin C 22,5mg % [7].
Trong cây và hoa có chứa: Sterol [7] (như stigmasterol [32]), 1 polysaccharid
không khử [7], Limonene, β-caryophyllen, Z-β-ocimene, γ-cadienen, thymol,
germacrene-D, myrcene (trong tinh dầu từ hoa) [20], [50], [62].

Hình 1.1 Spilanthol. Hình 1.2. Stigmasterol
Trong các dịch chiết bằng dung môi hữu cơ của hoa hoặc toàn cây có chứa
các chất: N-isobutyl-2E,4Z,8Z,10E-dodecatetraenamide [54], butylated
hydroxytoluene [54], n-hexandecanoic acid (Palmitic acid) [50], [54],
tetradecanoic acid (Myristic acid) [54], polygodial, eudesmanolide [54], 3-
acetylleuritolic acid, vanillic acid, sitostenone [53], [64], (2E)-N-isobutyl undeca-
2-en-8, 10-diynamide [36], [49], (R,E)-N-(2-methylbutyl) undeca-2-en-8, 10-
diynamid [41], [49], (2E, 4Z)-N-isobutyl-2, 4- undecadiene-8, 10 – diynamide
[32], (2Z)-N-isobutyl-2-nonene-6, 8-diynamide [32] [29], (Z)-dec-2-en-6, 8-
diynoic acid isobutylamide [29], (2E, 7Z)-N-isobutyl-2, 7- tridecadiene-10, 12-
diynamide [36] [41], 7Z-N-isobutyl-7-tridecene-10, 12- diynamide [41], undeca-
2E, 7Z, 9E-trienoic acid [41], [32], [50], isobutylamide [41], (2E, 7Z)-N-isobutyl-
2,7-decadienamid [52], myricyl alcohol [23], scopoletin [53], trans-ferulic acid
[53], trans-isoferulic acid [53], hỗn hợp stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside và
β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside [53].

7

Bảng 1.1. Các thành phần hóa học trong chi Spilanthes [32]
STT
Tên loài
Tên chất
1
S. acmella
- N-butylamide: spilanthol [41] ; undeca-2E, 7Z,
9E-trienoic acid isobutylamide [41]; undeca-2E-
en-8, 10-diyonic acid isobutylamide [41]; 2E-N-
(2-methylbutyl)-2-undecene-8, 10-diynamide [36];
2E, 7Z-N-isobutyl-2, 7-tridecadiene-10, 12-
diynamide [36]; 7Z-N-isobutyl-7-tridecene-10, 12-
diynamide [36].
- Phytosterol: β-sitosterol [33], stigmasterol [56],
[33], α và β-amyrins [33].
- Tinh dầu: limonene, β-caryophyllen, (Z)-β-
ocimene, germacrene D, myrcene [17].
- Hydrocarbon: hỗn hợp của các hydrocarbon thong
thường từ C22 đến C35 [18].
- Alcohol: myricyl alcohol [33], [56]
2
S.alba
N-isobutylamide: spilanthol; undeca-2E, 7Z, 9E-
trienoic acid isobutylamide; acetylenic amides;
acetylenes [62]
3

S.oleracea
N-isobutylamide: spilanthol; 2-methyl butylamide;
(Z)-non-2-en-6, 8-diynoic acid isobutylamide.; (Z)-
dec-2-en-6, 8-diynoic acid isobutylamide [29]
4
S.ocumifolia
Phenylethylamide: N-2-phenylethylcinnamamide
[56]
5
S.calva
Flavonoid glucoside: tetrahydroxdihydrochalcone
3’-O-glucoside [42]
6
S.leiocarpa
Eudesmanolide [20]
7
S.americana
- Sesquiterpene: α và β-bisabolenes, caryophyllen,
cadinenes. [52]
- N-isobutylamide: N-(isobutyl)-2E, 6Z, 8E-
decatrienamide; N-(isobutyl)-6Z, 8E-
8

decadienamide [52].
- Phenylethylamide: N-(2-phenelethyl)-2E, 6Z, 8E-
decatrienamide [52]

1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC, CÔNG DỤNG CỦA CÂY NÚT ÁO
1.3.1. Tác dụng sinh học của cây Nút áo
- Dịch chiết cây Nút áo có tác dụng ức chế và gây độc cho ấu trùng Plutella

xylostera – là sâu tơ phá hoại rau màu. Ngoài ra, Spilanthol có trong hoa Nút áo
được xem là chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất [16].
- Dịch chiết cồn của Spilanthes oleracea thể hiện hoạt tính mạnh (83% tỉ lệ
gây chết) với Tuta absoluta – là một loại sâu phá hoại cà chua [49].
- Dịch chiết chloroform và methanol cũng có thể ức chế sự phát triển của
nhiều vi khuẩn như Corynebacterium diptheriae NCTC 10356 với MIC nằm
trong khoảng 64-256 g/mL và Bacillus subtilis ATCC 6633 với MIC trong
khoảng 128-256 g/mL [44], [50].
- Một số hợp chất trong dịch chiết Nút áo (S. acmella) cho thấy khả năng ức
chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus, Samonela typhimurium và
ấu trùng cái của Onchocerca gutturosa [44], [53].
- Dịch chiết ether dầu hỏa của S. acmella có tác dụng ức chế sự phát triển của
vi khuẩn Bacillus spharicus, Pseudomonas aeruginosa, Klebesiella aerogenes,
Chromobacterium violaceum [44].
- Bột dược liệu của S. calva có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Streptococcus mutans (vi khuẩn gây bệnh răng miệng) [26].
1.3.2. Công dụng, cách sử dụng của cây Nút áo
Từ lâu, Nút áo đã được sử dụng trong rất nhiều các bài thuốc dân gian cũng
như nghiên cứu để bào chế ra các sản phẩm điều trị nhiều bệnh. Ở Ấn Độ, người ta
dùng hạt chế cồn thuốc trị đau răng, cồn này có tác dụng mạnh đối với ấu trùng
muỗi. Hạt nhai làm tiết nước bọt. Ở Malaysia, lá nấu lên dùng chữa mày đay [7].
9

Trong thử nghiệm in vitro thành phần Spilanthol từ dịch chiết Nút áo có tác
dụng như một chất chống oxy hóa (antioxidant) [54]. Spilanthol có vị cay tê mạnh,
có tác dụng làm se, gây tê [32]. Chính điều này đóng vai trò quan trọng trong việc
làm giảm tình trạng đau ở những bệnh nhân đau răng.
Toàn bộ cây Nút áo từ rễ, thân, lá đến hoa đều có rất nhiều công dụng. Một số
công dụng cũng khá tương đồng giữa các bộ phận.
Hoa là bộ phận được sử dụng nhiều nhất với các mục đích: Chữa đau răng

[7] [9], [13], [23], [30], [40], [50], [51], trị các chứng viêm miệng [23], [30] và đau
họng [7], [10], [13], [23], [30], [50], chữa bại lưỡi [10], [13], [16], [26], [51],
phương thuốc chữa nói lắp ở trẻ em [13], [61], dùng như gia vị [48], tăng tiết nước
bọt [9], [10], [13], cảm sốt đau đầu [7], [13], [22], [30], [25], sốt rét cơn [7]; viêm
phế quản, ho gà [7] [13]; ho lao, hen suyễn [7], [30]; phong thấp, nhức xương, tê
bại [7], [13], [22], [25], [50]; dùng ngoài trị nhọt độc [7], [9], [13], [40], lở ngứa
[7], [13], [38], vẩy nến [38], rắn độc cắn [7], vết thương tụ máu sưng tấy[7], [9],
đau mắt [7], [9], [13], chữa gai đâm [13]; trị bọ gậy muỗi anophen (cao chiết với
ether dưới dạng nhũ dịch với xà phòng và hòa loãng với nước), diệt sâu bọ [13],
[50]; gây tê tại chỗ [13], trị nôn mửa [13], trục thai chết [13], trị bệnh nhiễm trùng
[13], [30], trị bệnh dại [30], lợi tiểu [60], trị bệnh scorbut [38]
Lá được sử dụng với các mục đích như: trị đau răng, viêm họng [30], [50],
làm chất kích thích [10], [55], thuốc lợi nước bọt [6], [10], [48] (thành phần trong lá
có tác dụng tăng tiết nước bọt), chất gây tê tại chỗ [55], sử dụng trong các bệnh về
nấm và vi khuẩn ở da (lở ghẻ, mẩn ngứa) [9], [13], [24], [50], có tác dụng lợi tiểu
[9], [10], [13], [50], [51], [69] và tiêu sỏi [9], [13], [47], [50], [51], trị nhức đầu [9],
[10], [13], làm rau ăn [7], [9], [10], chữa bệnh scorbut (chảy máu chân răng) [6],
[7], [9], [13], [47], chữa nói lắp cho trẻ [6], [7], làm thuốc tẩy [13]; cảm cúm [30],
bệnh dại [30].
Rễ được sử dụng với mục đích: trị đau răng [50], [51], làm thuốc tẩy, xổ [9],
[13], [46] và thuốc nhuận tràng [46], chữa cảm lạnh và cúm [13], [46], [50], chữa
10

đau đầu [46], đau bụng [13], chữa hen [56], bệnh thấp khớp [13], [50], [56], trị
bệnh tả [50]; trị ghẻ lở, vẩy nến, bệnh nhiễm trùng, bệnh scorbut [38].
Hạt có tác dụng: trị đau răng (cồn thuốc) [10], tăng tiết nước bọt [13].
Có thể sử dụng toàn cây Nút áo với mục đích như: trị đau răng [6], trị lỵ
(luộc ăn) [13]; lợi tiểu, tiêu sỏi (nước sắc) [6], [13], nấu nước tắm trị thấp khớp [6],
[13]; ghẻ lở, vảy nến. [13], nước ép tươi làm thuốc đắp và bó vết thương [13]; làm
thuốc bả cá (Ấn Độ) [13]; diệt bọ gậy [13], sâu bọ [15], [41], [57], vi khuẩn [27],

[44], [58], nấm [35], [39], [45], [59], giun tròn [60]; trị gãy xương, ngã tổn thương,
bế kinh, trị đau dạ dày và trị ngoại thương xuất huyết [6], trị nhức đầu (nước sắc)
[6]; giải độc, tiêu viêm, chỉ thống, trị cảm mạo, rắn độc cắn, [6], làm hạ đường
huyết [13], [50].
Trong dân gian, Nút áo đã được sử dụng từ rất lâu để trị đau răng, viêm
họng: hoa Nút áo tán nhỏ, ngâm rượu ngậm hoặc ngậm tươi nuốt sống [7]; sưng
họng: lá nút áo giã nhỏ với ít muối, bọc vào mảnh vải rồi ngậm [13].
Như vậy, có thể nhận thấy công dụng trị đau răng, trị các bệnh răng miệng là
một công dụng nổi bật và rất quan trọng của Nút áo. Đây cũng là lí do tại sao chúng
tôi thực hiện đề tài này với mục đích tìm hiểu sâu hơn về công dụng trị đau răng. Từ
đó ứng dụng phát triển nguồn dược liệu đã có từ lâu đời trong dân gian này, mà
dường như ngày nay đang bị lãng quên.
1.4. MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG
Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành acid lactic tồn tại trong
khoang miệng là nguyên nhân gây sâu răng. Chúng chủ yếu thuộc 3 chi:
Streptococcus (Streptococcus mutans (S. mutans), Streptococcus sorbrinus,
Streptococcus milleri v.v…), Lactobacillus (Lactobacillus axitophilus,
Lactobacillus casei v.v…) và Actinomyces. Trong số những vi khuẩn này, S. mutans
được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi khuẩn này luôn được phát
hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có số lượng rất cao ở những vùng
răng bị sâu, bệnh sâu răng giảm hoặc mất hẳn khi không có mặt S. mutans [11].
11

S. mutans hay còn gọi là Mutans streptococci được tìm thấy trong khoang
miệng của tất cả các quần thể thu mẫu, qua đó chỉ ra rằng các loài vi khuẩn này có
sự phân bố toàn cầu.
S. mutans có khả năng gây sâu răng là do vi khuẩn này có khả năng sinh acid
mạnh và chịu acid tốt. S. mutans là vi khẩn Gram (+), có thể sinh trưởng hiếu khí
hay kị khí. S. mutans trong điều kiện kị khí (đáy mảng bám răng) thiếu oxy chúng
lên men kị khí, tạo axit lactic gây ăn mòn men răng và gây sâu răng [11]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về S. mutans và nhiều chủng
đã được công bố. Các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp cả ở mức độ
hóa sinh và sinh học phân tử để phát hiện nhanh, chính xác sự có mặt và số lượng S.
mutans trong nước bọt cũng như trên bề mặt răng góp phần chẩn đoán và điều trị
bệnh sâu răng. Nhiều loại môi trường khác nhau cũng đã được các nhà nghiên cứu
sử dụng trong việc phân lập, nhận dạng các chủng vi khuẩn này trong các điều kiện
khác nhau [11].
Cùng với S. mutans. S. sobrinus cũng được nhận định là nhân tố chính gây
sâu răng ở người. Trong khi S. mutans có mặt ở hầu như các đối tượng mắc bệnh
sâu răng thì S. sobrinus chỉ có mặt với tỉ lệ phát hiện thấp từ 8- 35% ở người ở các
nước khác nhau. Đây là 2 loài có độ tương đồng rất cao. Các nghiên cứu vào thập kỉ
80 về mối quan hệ của các loài vi khuẩn liên quan đến sâu răng đều gộp 2 loài này
với nhau do khi đó S. sobrinus chưa được nhận dạng chính thức. Mặc dù S. mutans
và S. sobrinus có thể được phân biệt bởi các kiểm tra sinh lý, hóa sinh thích hợp
trong phòng thí nghiệm nhưng các thí nghiệm thường tốn kém, mất nhiều thời gian
nên không phải lúc nào cũng khả thi để nhận dạng ở mức loài với phạm vi nghiên
cứu [11].



12

PHẦN 2-
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
- Các mẫu Nút áo được thu hái tại huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa từ tháng 7 năm
2011 đến tháng 2 năm 2013 với kí hiệu mẫu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bảng kí hiệu các mẫu thực nghiệm
Mẫu

Kí hiệu mẫu cây
Bộ phận
Kí hiệu mẫu
Spilanthes sp1
V
Rễ
VR
Thân
VT
Lá
VL
Hoa
VH
Spilanthes sp2
L
Rễ
LR
Thân
LT
Lá
LL
Hoa
LH
Spilanthes sp3
T
Rễ
TR
Thân
TT
Lá

TL
Hoa
TH

- Mẫu tươi gồm toàn cây mang hoa dùng để nghiên cứu đặc điểm thực vật. Tiêu
bản mẫu khô được lưu giữ tại Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật với mã số tiêu bản
lần lượt là HNIP/17857/13, HNIP/17858/13, HNIP/17859/13.
13

- Mẫu tươi gồm các bộ phận trên mặt đất (thân, lá, hoa) của 2 loài V và L dùng để
làm nguyên liệu thử hoạt tính sinh học.
- Cụm hoa loài V tươi phơi cho se rồi sấy khô ở 60
o
C, bảo quản trong túi nilon kín,
để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học.
2.1.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
 Thuốc thử, dung môi, hóa chất:
- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất thông dụng đủ tiêu chuẩn sử dụng trong phân
tích của các hãng như Merck, Fisher, Prolabo…
- Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans ATCC 700610 ở Khoa Sinh, trường Đại
học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
 Máy móc, thiết bị:
- Tủ sấy
- Tủ ấm
- Buồng nuôi cấy
- Hệ thống máy móc HPTLC Camag
- Cân kĩ thuật
- Máy cất quay BUCHI ROTAVAPOR R-210
- Kính hiển vi
- Kính lúp soi nổi

- Máy ảnh
- Bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF
254
của hãng Merck (Đức)
- Cột sắc kí
- Bộ dụng cụ cất tinh dầu.
- Ống nghiệm, đĩa petri, pipet…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái các bộ phận sinh sản và sinh dưỡng của các mẫu thu
hái được.
14

- So sánh đặc điểm hình thái giữa các mẫu thu hái được với đặc điểm trong khóa
phân loại [14] và các tài liệu chính thống khác như Cây cỏ Việt Nam [10], Từ điển
thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc [9], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở
Việt Nam [13]. Từ đó giám định tên khoa học các mẫu thu hái được.
- Làm vi phẫu rễ, thân, lá, mô tả đặc điểm giải phẫu của mẫu nghiên cứu.
2.2.2. Thử hoạt tính sinh học
- Mẫu tươi các bộ phận trên mặt đất của 2 mẫu cây Nút áo mọc phổ biến được thu
hái tại huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa để thử hoạt tính sinh học (V, L).
- Thử tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus mutans của các dịch chiết mẫu
nghiên cứu trên. Lựa chọn mẫu cây có hoạt tính cao để nghiên cứu thành phần hóa
học.
2.2.3. Định tính các thành phần hóa học và phân lập một các thành phần hóa
học trong mẫu cây Nút áo có hoạt tính
- Định tính các thành phần trong dịch chiết cụm hoa Nút áo mẫu V.
- Chiết xuất tinh dầu trong cụm hoa và sử dụng phương pháp sắc kí khí khối phổ
liên hợp để xác định thành phần của tinh dầu.
- Chiết phân đoạn dịch chiết cồn và sử dụng sắc kí cột để phân lập các thành

phần; đo phổ NMR để xác định cấu trúc hóa học của thành phần đó.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
- Phương pháp: mô tả phân tích và so sánh hình thái.
- Tài liệu khóa phân loại trong Thực vật chí Việt Nam [14] và các tài liệu chuyên
sâu về thực vật như: Cây cỏ Việt Nam [10], Từ điển thực vật thông dụng [6], Từ
điển cây thuốc [9], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [13]… để xác
định tên khoa học.
- Tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu các cơ quan dinh dưỡng của cây: làm tiêu
bản vi học [2], quan sát đặc điểm cấu tạo vi phẫu trên kính hiển vi, chụp ảnh và
mô tả đặc điểm.

15

2.3.3. Thử hoạt tính sinh học dịch chiết bộ phận trên mặt đất cây Nút áo
 Mẫu vật: phần trên mặt đất (thân, lá và hoa) của cây Nút áo thu hái tại huyện
Yên Định, Thanh Hóa.
 Chủng thử: Vi khuẩn Streptococcus mutans ATCC 700610 được phân lập tại
khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
 Phương pháp thử: phương pháp khuếch tán đường ngang trên đĩa thạch đục lỗ
 Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch thường, điều chỉnh pH 7,4 – 7,6.
Công thức môi trường:
- Peptone 10g
- Cao thịt 5g
- NaCl 5g
- Thạch 20g
- Nước cất vừa đủ 1000 ml
 Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy: Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28
o
C trong 24h

 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường:
- Dụng cụ: sấy tiệt trùng ở nhiệt độ 130
o
C trong 2h.
- Môi trường: hấp tiệt trùng ở 121
o
c trong 15 phút.
- Buồng cấy: lau cồn và bật quạt gió một chiều.
 Với mỗi mẫu làm trên 30 giếng thạch và tiến hành thử lặp lại 3 lần. Như vậy
tổng số lần lặp lại trên mẫu là 90 lần.
 Chất chuẩn đối chứng: Gentamycin 80mg/2ml (theo quy định của Dược điển
Việt Nam IV)
 Xử lý kết quả: đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước kẹp có độ chính
xác 0,02 mm và được xử lý như sau:
- Tính đường kính trung bình vòng vô khuẩn:
 =
- Xây dựng đường đáp ứng của Gentamycin với chủng vi sinh vật:
16

y = algS + b
Trong đó:
y: đường kính vòng vô khuẩn (mm)
S: nồng độ kháng sinh (IU/ml)
a: hệ số góc
b: hằng số
 Từ đó tính được hoạt tính kháng khuẩn của chất thử so với Gentamycin.
 Quy trình thử: hoạt tính kháng khuẩn được thử theo quy trình 12 bước