Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa lactobacilus acidophilus

BỘ Y TẾ
TRƯNG ĐI HC DƯC H NỘI



NGUYỄN THỊ HOA
KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI
KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG
QUÁ TRÌNH TO NGUYÊN LIỆU
PROBIOTIC CHỨA Lactobacilus
acidophilus

KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S



H NỘI – 2013



BỘ Y TẾ
TRƯNG ĐI HC DƯC H NỘI

NGUYỄN THỊ HOA

KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI
KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG QUÁ
TRÌNH TO NGUYÊN LIỆU
PROBIOTIC CHỨA

L. acidophilus

KHA LUN TT NGHIỆP DƯC S



Ngưi hưng dn:
1. TS. Đàm Thanh Xuân
2. DS. Ninh Thị Kim Thu
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công nghiệp dược


H NỘI - 2013


LI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và long biết ơn sâu sắc tôi xin gi li cm ơn đến TS. Đàm
Thanh Xuân và DS. Ninh Thị Kim Thu, DS. Lê Ngọc Khánh những ngưi thầy đ
tn tnh hướng dn và ch ỉ bo cho tôi t những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn
thin kha lun này.
Đồng thi, tôi xin gi li cm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thut
viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đ tạo mọi điều kin giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hin đề tài, chỉ bo tôi trong thi gian làm thực nghim
.
Nhân dịp này tôi cng xin gi li cm ơn đến Ban gim hiu cng toàn th
cc thầy cô gio trưng Đại học Dưc Hà Nội đ dạy d và tạo mọi điều kin thun
li cho tôi trong thi gian tôi học tp tại trưng.
Và cuối cng là li cm ơn tôi gi tới gia đnh , ngưi thân và bạn b đ
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt qu trnh h ọc tp và hoàn thành khóa lun tốt

nghip.
Do thi gian làm thực nghim cng như kiến thc ca bn thân c hạn, khóa
lun này cn c nhiều thiếu st . Tôi rt mong nhn đưc sự gp  ca cc thầy cô ,
bạn b đ kha lun đưc hoàn thin hơn.
Tôi xin chân thành cm ơn!

Hà Nội, ngày , tháng 5, năm 2013.
Sinh viên

NGUYỄN THỊ HOA




MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN

2
1.1. Đại cương về probiotic 2
1.1.1. Khái niệm 2
1.1.2. Vai trò 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng 4
1.1.4. Một số dạng chế phẩm trên thị trường

5
1.2. Phương pháp đông khô 7

1.2.1. Khái niệm
7
1.2.2. Các giai đoạn của phương pháp đông khô 7
1.2.3. Ưu điểm của phương pháp đông khô 8
1.2.4. Ứng dụng 8
1.2.5. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật. 8
1.3. Alginat

10
1.3.1. Sơ lược về alginat 10
1.3.2. Một số tính chất của natri alginat
10
1.3.3. Ứng dụng 11
1.3.4. Một số hướng nghiên cứu sử dụng alginat trong sản xuất chế phẩm
probiotic thời gian gần đây.
12
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
13
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 13


2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng 13
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 13
2.1.3. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

13
2.1.4. Thiết bị 14
2.2. Nội dung nghiên cứu
14

2.2.1. Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ
trong quá
trình đông khô tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus.

14
2.2.2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá
dược độn
15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phương pháp nhân giống.
15
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối. 15
2.3.3. Phương pháp đông khô. 15
2.3.4. Phương pháp xác định hàm ẩm.

16
2.3.5. Phương pháp xác định số lượng VSV bằng phương pháp pha loãng
liên tục.
16
2.3.6. Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall 18
Chương 3: Kết quả và bàn luận
19
3.1. Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trong quá trình
đông khô tạo nguyên liệu probiotic chứa L. acidophilus ATCC 4653
19
3.1.1.
Đánh giá thể chất của các nguyên liệu chứa vi sinh vật tạo
thành sau khi đông khô
19
3.1.2. Đánh giá hàm ẩm và tốc độ hút ẩm của các mẫu đông khô vi sinh

vật với tá dược bảo vệ là sữa gầy và alginat.
22
3.1.3. Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót sau
24


đông khô
3.1.4. So sánh khả năng sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông
khô có và không có kết hợp alginat và sữa gầy
28
3.2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá
dược độn
31
3.2.1. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của bột nguyên liệu probiotic
có alginat trong môi trường acid dạ dày
31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
35

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B. subtilis
:
Bacillus subtilis
Cfu (Colony- Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc
FAO (Food and Agriculture Organization) : Tổ chức nông lương thế giới
Glass : một trạng thái nhiệt động quá bão hòa không bền với độ nhớt cao
HDL (High density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng cao
HDSK : Hỗn dịch sinh khối
IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn bơ sữa thế giới
Kl/kl : Khối lượng/khối lượng
Kl/tt : Khối lượng/thể tích
L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus
LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn lactic
LDL (Low density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng thấp

MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

MT : Môi trường

PPI (Proton Pump Inhibitor) : Ức chế bơm proton
S. boulardii : Saccharomyces boulardii
Tt/kl : Thể tích/khối lượng
VSV : Vi sinh vật
WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế thế giới






DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
Bảng 2.1 Bảng các hóa chất dùng trong nghiên cứu. 13
Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 14
Bảng 3.1 Thể chất của các mẫu đông khô L. acidophilus vớ
i các tá
dược bảo vệ tại thời điểm ngay sau khi đông khô
20
Bảng 3.2 Kết quả đo hàm ẩm (%) của một số mẫu đông khô L.
acidophilus với tá dược bảo vệ khác nhau theo thời gian
23
Bảng 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 4 mẫu sau đông khô 26
Bảng 3.4 Kết quả đo hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ
là hỗn hợp sữa gầy với alginat các nồng độ
29
Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô
trong các mẫu đông khô sử dụng kêt hợp alginat và sữa gầy.
30

Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột đông khô sau
thời gian được ngâm trong môi trường acid HCl pH 1,2.
33













DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Hình 1.1 Chế phẩm probiotic cốm 6
Hình 1.2 Chế phẩm probiotic dạng viên nang 6
Hình 1.3 Chế phẩm dạng lỏng 6
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-
mannuronic
10
Hình 3.1 Hình ảnh mẫu đông khô với nước cất. 21
Hình 3.2 Đồ thị biểu thị hàm ẩm của 3 mẫu ngay sau đông khô và sau
thời gian bảo quản.
23
Hình 3.3 Hình ảnh mẫu đông khô với alginat ngay sau khi tháo khỏi
máy và sau 3 phút trong điều kiện không được bảo quản.
24

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ vi khuẩnL. acidophilus sống sót trong các
mẫu sau đông khô
27
Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện số lượng vi sinh vật sống sót sau khi thử trong
môi trường acid HCl pH 1,2
33








1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn probiotic được biết đến như một nhóm vi sinh vật manglại rất
nhiều lợi ích cho con người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, cải thiện khả
năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch…[20]. Tuy nhiên hầu hết cácvi sinh
vật này có một nhược điểm lớn là độ ổn định. Chúng dễ bị ảnh hưởng bởi các điều
kiện của môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm [35]. Khi sử dụng theo
đường uống pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật là các yếu tố làm suy giảm số
lượng sống sót ngăn cản việc thiết lập hệ vi sinh vật ở niêm mạc ruột. Ngoài ra các
thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng làm ảnh hưởng đến khả năng sống
sót của vi khuẩn probiotic [29].
Do đó muốn đem lại tác dụng cho vật chủ cần phải tìm những phương pháp gia
tăng tỉ lệ sống sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều
kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Chính vì vậy mà đã có nhiều

nghiên cứu nhằm tìm các chất có tác dụng bảo vệ vi sinh vật probiotic và một trong
các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong thời gian gần đây là sử dụng alginat như
một tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn probiotic.
Từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tác dụng bảo vệ vi
khuẩn của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa L.
acidophilus” nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô
Lactobacillus acidophilus.
2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá dược độn
cho dạng thuốc rắn.




2

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về probiotic
1.1.1. Khái niệm
Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, trong đó “biotic” nghĩa là
“sự sống” và “probiotic”là “dành cho sự sống”. Probiotic là những vi khuẩn sống có
thể cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh và giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật
đường tiêu hóa [20], [28]. Trong lịch sử probiotic được định nghĩa theo nhiều cách
khác nhau, tùy thuộc vào cách hiểu của chúng ta về cơ chế tác động và ảnh hưởng
của chúng tới sức khỏe và sức sống của con người. Một trong những định nghĩa
được sử dụng nhiều nhất là định nghĩa của Fuller: “Probiotic là thực phẩm bổ sung
các vi sinh vật sống tạo ra các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân
bằng hệ vi sinh vật đường ruột” [29].
Năm 2001, tổ chức Nông Lương Thế Giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn

gọn và đầy đủ: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một
lượng đủ lớn sẽ đem lại tác dụng có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Theo FAO để có
được hiệu quả thực sự, thì vi sinh vật trong các chế phẩm probiotic cần phải đến
được vị trí tác dụng của nó trong đường tiêu hóa. Do trong quá trình sử dụng vi
khuẩn probiotic phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để
đem lại tác dụngbất cứ sản phẩm chứa probiotic nào cũng phải chứa ít nhất 10
6

cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng vì liều điều trị tối thiểu
mỗi ngày được đề xuất là từ 10
8
÷ 10
9
tế bào [20].
1.1.2. Vai trò
Các tác dụng chính có thể kể đến của probiotic là:
• Ngăn chặncc bnh nhiễm trng đưng ruột
Lactobacillus acidophilus và bifidobacterialà 2 vi khuẩn được sử dụng nhiều
nhất trong các chế phẩm probiotic, có khả năng ngăn chặn sự phát triển của cácnhân
gây bệnh như:Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,
Yersiniaenterocolitica và Clostridium perfringens nhờ cạnh tranh vị trí bám trên
3

niêm mạc ruột và sinh ra các chất có tác dụng kháng khuẩn làm cho vi khuẩn có hại
không phát triển được như: các barteriocine (như: nisin, lactobrevin, acidophilin,
acidolin, lactobacillin,lactocidin và lactolin), acid lactic, acid acetic, hydrogen
peroxid, carbon dioxid, diacetyl… [8], [20], [27].
• Tăng cưng miễn dịch.
Một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn
dịch: miễn dịch đặc hiệu (ví dụ: sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào

lympho) và miễn dịch không đặc hiệu- miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng
của đại thực bào, hoạt động của tế bào diệt tự nhiên). Sự bám dính của các vi khuẩn
probiotic và các sản phẩm của chúng trên các mô lympho tại ruột sẽ kích hoạt tác
động bảo vệ của hệ miễn dịch [8], [20], [28].
• Ngăn chặn bnh tiêu chy.
Đánh giá các bằng chứng khi sử dụng chế phẩm probiotic trong các trường
hợp tiêu chảy cho thấy giảm đáng kể các trường hợp tiêu chảy liên quan đến kháng
sinh 52%, tiêu chảy cấp do nguyên nhân khác nhau 34% trong đó giảm 57% nguy
cơ liên quan tiêu chảy cấp ở trẻ em, và 26% ở người lớn. Hiệu quả bảo vệ không
khác nhau đáng kể giữa các chế phẩm chứa các chủng vi khuẩn probiotic khác nhau
như:Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus bulgaricus và các chế phẩm khác sử dụng một mình
hoặc kết hợp của hai hay nhiều chủng[20],[33].
• Chống lại tc nhân gây ung thư
Những thử nghiệmin-vitro và in-vivo gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn
probiotic có thể làm giảm nguy cơ, tỷ lệ và số lượng các khối u đại tràng, gan và
bàng quang. Hiệu quả bảo vệ chống lại sự phát triển ung thư có thể do liên kết của
chất gây đột biến với vi khuẩn đường ruột, hoặc do khả năng ức chế sự tăng trưởng
của vi khuẩn chuyển đổi procarcinogens thành chất gây ung thư, do đó làm giảm
lượng chất gây ung thư trong ruột, hoặc chỉ đơn thuần là ức chế sự phát triển của
các khối u bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ…
[8], [20],[26].
4

• Ngăn nga chng tăng cholesterol mu. (ngăn cn hp thu cholesterol và ti hp
thu acid mt)
Các nghiên cứu sử dùng kết hợp các chế phẩm probiotic và chế độ ăn giàu
cholesterol trên chuột đã cho thấy nhóm chuột trong chế độ ăn có bổ sung VSV
probiotic có nồng độ cholesterol huyết tương, LDL thấp hơn đáng kể so với nhóm
không dùng, trong khi đó nồng độ triglycerid, HDL-cholesterol huyết tương giữa 2

nhóm không có sự khác biệt đáng kể [10], [36], [37].
Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy sử dụng probiotic hằng ngày giúp
cải thiện tình trạng gan nhiễm mỡ ở người nghiện rượu và bình thường người
thường.
• Tc dụng trên H. pylori
Helicobacter pylori đóng vai trong chủ yếu trong nguyên nhân và bệnh sinh
loét dạ dày tá tràng và là yếu tố nguy cơ của một số bệnh lí dạ dày ác tính khác như:
ung thư hay u dạ dày. Đây là một xoắn khuẩn Gram âm, sống ở lớp niêm mạc và
dưới niêm mạc dạ dày- tá tràng, chúng làm tổn thương niêm mạc tại chỗ [5].Các
nghiên cứu dùng kết hợp phương pháp điều trị bằng PPI và kháng sinh với chế
phẩm probiotic đã cho thấy phương pháp này làm giảm đáng kể tác dụng không
mong muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa. Do vậy sử dụng
probiotic để phòng ngừa các bệnh lí liên quan viêm loét dạ dày tá tràng là 1 hướng
điều trị viêm loét dạ dày được chú ý trong những năm gần đây [12], [15],[19],[35],
[36].
Ngoài những tác dụng kể trên, probiotic còn được biết đến với khả năng “cải
thiện dung nạp lactose”, “ổn định hàng rào niêm mạc ruột”, “giảm các triệu chứng
dị ứng thực phẩm”… Viên đặt probiotic có tác dụng tốt trong phòng ngừa và điều
trị nấm âm đạo, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng âm đạo do vi khuẩn [20], [36].
1.1.3. Cơ chế tác dụng
• Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám.
Khả năng bám vào bề mặt đường tiêu hóa tạo nên mối tương tác giữa probiotic
và bề mặt niêm mạc ruột nơi có chứa nhiều tế bào lympho, việc này sẽ làm kích
5

thích miễn dịch tại chỗ và toàn bộ cơ thể. Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên
khả năng cạnh tranh gắn vào biểu mô giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic
[5], [8]. Một số nghiên cứu invitro cho thấy rằng cả 2 dạng vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus còn sống hoặc đã bị chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự bám dính
của các vi khuẩn gây bệnh [8]. Mặt khác khi các vi khuẩn probiotic phát triển trong

đường tiêu hóa sẽ cạnh tranh năng lượng với các vi khuẩn gây hại từ đó hạn chế sự
sinh trưởng và phát triển của chúng.
Ngoài ra một số cơ chế khác có thể kể đến như: “Tăng cường khả năng
chống đỡ của niêm mạc ruột”, “Sản sinh ra chất có tác dụng kháng khuẩn”, “Kích
thích đáp ứng miễn dịch”, “Tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa”[8], [20], [36].
1.1.4. Một số sản phẩm chứa probiotic trên thị trường
Các chế phẩm probiotics trên thi trường hiện nay chủ yếu là dạng khô (bột,
cốm, viên nén, viên nang…) mà ít thấy các chế phẩm probiotic dạng lỏng. Nguyên
nhân là do ưu điểm độ ổn định, tiện sử dụng, vận chuyển của dạng thuốc rắnso với
dạng thuốc lỏng. Các chế phẩm probiotic dạng lỏng hiện có trên thị trường hiện nay
đều có thành phần là dạng bào tử của vi khuẩn do dạng này có khả năng chống chịu
với các điều kiện bất lợi và tồn tại trong môi trường lâu hơn. Trong khi đó hầu hết
các vi khuẩn probiotic đều thuộc nhóm không có khả năng sing bào tử ngoại trừ chi
Bacillus.
Về nguyên liệu để sản xuất dạng thuốc rắn thì hầu hết trên thị trường hiện
giờ đều là bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống ngay cả trong quá
trình bảo quản thời gian dài. Ngoài ra bột đông khô còn là dạng nguyên liệu tốt nhất
để sản xuất chế phẩm probiotic dạng rắn như bột, cốm hoặc viên nén và viên nang
[3].





6

 Một số hnh nh cc chế phẩm probiotic trên thị trưng:


Cốm vi sinh Bio King

Thành phần:
Lactobacilus acidophilus: 10
8
Cfu
Bifidobacterium: 10
8
Cfu
Streptococcus thermophilus TH:
10
8
Cfu
Một số vitamin B1, B2, B5, B6,
B9.
tá dược vđ: 3g
Hình 1.1. Chế phẩm probiotic dạng cốm
Dạng viên nang:
Hình 1.2. Chế phẩm probiotic dạng
viên nang



Biolac 500mg (Hộp 10 vỉ x 10 viên)
Thành phần:
Lactobacillus acidophilus 10
6
-10
7

cfu
Lactobacillus sporogenes 10

6
– 10
7

cfu
Lactobacillus kefir 10
6
– 10
7
cfu

Dạng thuốc lỏng

Hình 1.3. Chế phẩm dạng lỏng
Enterogermina(hộp 20 ống hỗn
dịch. Mỗi ống 5ml.)
Thành phần: bào tửBacillus
clausiiđa kháng kháng sinh
7

1.2. Phương pháp đông khô
Đông khô từ nhiều năm nay đã được sử dụng để ổn định khả năng sống sót của
vi sinh vậttrong thời gian bảo quản. Trong ngành công nghiệp sinh học, đông khô
làm cho tế bào vi sinh vật được bảo vệ trong hàng thập kỉ mà không suy giảm số
lượng sống sót. Ưu điểm lớn nhất của đông khô vi sinh vật là ổn định khả năng sống
sót của vi sinh vật và làm quá trình vận chuyển, bảo quản trở nên thuận tiện và dễ
dàng hơn [13], [25].
1.2.1. Khái niệm
Đông khô đươc định nghĩa như là một quy trình tạo sự ổn định mà trong đó vật
cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có trong vật

(dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau đó là quá trình
khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị mà sẽ không thể khiến VSV phát triển hoặc xúc
tác các phản ứng hóa học [13], [24].
1.2.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô
 Giai đoạn lạnh đông.
Có thể làm lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc có trong buồng lạnh đông
riêng bên ngoài buồng sấy.Mục đích của giai đoạn này là làm ẩm trong chế phẩm,
nguyên liệu chuyển trạng thái từ lỏng sang rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống
dưới nhiệt độ của điểm ba nhiệt độ đóng băng t
b
của ẩm [13], [9].
 Giai đoạn thăng hoa
Ở giai đoạn này vật được đặt trong buồng sấy, tiến hành hút chân không. Ẩm
trong vật chuyển trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua giai
đoạn lỏng. Trong giai đoạn này nhiệt độ và áp bên trong buồng sấy được duy trì ở
mức dưới nhiệt độ đóng băng [13], [9].
 Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại.
Ở giai đoạn này nhiệt độ tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết và ở trạng thái
lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị
sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao
hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [9].
8

1.2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô
 Ưu đim
Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng
rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy
khác như: Giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; Giữ được hoạt tính sinh học;
Bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin…
Giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ

nước để trở lại trạng thái ban đầu [9].
 Nhưc đim
Tuy có khá nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác nhưng đông khô
cũng có những nhược điểm riêng khiến nó hiện chưa được sử dụng rộng rãi:
Giá thành thiết bị cao; Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình
độ kĩ thuật cao. Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao [9].
1.2.4. Ứng dụng
Do những ưu nhược điểm ở trên nên đông khô chỉ được áp dụng trên các sản
phẩm có yêu cầu chất lượng cao, đồng thời kém bền với nhiệt độ cao. Trong ngành
Dược được ứng dụng để sản xuất các bột đông khô để pha tiêm (ví dụ: kháng sinh
như penicillin, cephalexin…), làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh
vật. Ngoài ra đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong
ngành công nghiệp thực phẩm để bảo quản 1 số sản phẩm khác.
1.2.5. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật
Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng nó cũng là 1
trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo
nguyên liệu và chế phẩm probiotic. Đặc biệt giai đoạn tiền đông là nguyên nhân gây
lên áp lực cho thành tế bào vi khuẩn. Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ bị
tổn thương. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay đổi hình thái tự nhiên của
lipid màng và sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm là nguyên nhân chính
gây ra sự suy giảm số lượng tế bào trong quá trình đông khô [21]. Một số tài liệu lại
cho rằng chính việc hình thành tinh thế đá nội phân tử có thể là nguyên nhân gây
9

phá vỡ màng tế bào. Các tá dược bảo vệ được thêm vào trong thành phần nguyên
liệu đem đông khô nhằm: bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức
chịu đựng của vi sinh vật trong quá trình làm khô [24].
Một trong những phương pháp được sử dụng để gia tăng sự sống sót của vi
sinh vật trong quá trình này là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tác nhân bảo
vệ. Các tác nhân này nhằm bảo vệ tế bào vi sinh vật trước các điều kiện bất lợi của

quá trình cũng như trong thời gian bảo quản. Các tá dược được dùng để bảo vệ VSV
như: Sữa gầy, nước sữa, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose, glucose,
lactose và các polymer như dextran, polyethylene glycol [13], [21], [25]. Các tác
nhân bảo vệ có thể thêm vào trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật hoặc ngay
trước khi làm khô.
 Sữa gầy
Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần có
chứa không quá 0,5 % chất béo (trong khi sữa nguyên chất chứa hàm lượng chất
béo khoảng 3,5%, sữa tách bơ- butter milk chứa khoảng 1% chất béo).
Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt
probiotic trong quá trình đông khô. Theo nhiều tổng kết nhiều nghiên cứu trong và
ngoài nước từ trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ
sống sót cao nhất. Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ dinh protein và
carbohydrat- những chất mà có khả năng bảo vệ tế bào. Thành phần dinh dưỡng
chính trong sữa gầy:
32- 35,7 % protein.
48,4- 54,1 % lactose.
Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể
thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường- protein.
Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi. Protein
giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi
trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở
mức thấp nhất [13].
10

Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo
vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong
nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [24].
Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước
dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh

nếu không được bảo quản tốt.
1.3. Alginat
1.3.1. Sơ lược về alginat
Alginat có nguồn gốc chủ yếu là từ tảo nâu, rong mơ.Alginat là tên chỉ chung
alginic và 1 số muối của nó như natri alginat, kali alginat,…
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc
uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M).


Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-
mannuronic
Tùy theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ
dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều
này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng.
1.3.2. Một số tính chất của Natri alginat
Là muối natri của acid alginic, là một vật liệu hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu
được bảo quản trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp. Dung dịch Natri
alginat ổn định nhất ở pH 4÷10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại. Hấp tiệt khuẩn
có thể làm giảm độ nhớt của dung dịch [17], [31], [34].
11

 Độ tan:
Thực tế không tan trong ethanol (95%), ether, chloroform, và hỗn hợp ethanol
nước có chứa hơn 30% ethanol. Không tan trong các dung môi hữu cơ khác và
trong dung dịch acid có pH<3. Tan chậm trong nước, tạo dung dịch keo nhớt [31],
[14].
 Độ nhớt:
Các dung dịch natri alginat của các chế phẩm khác nhau cũng có giá trị tương
đối khác nhau. Thông thường độ nhớt của dung dịch 1% (kl/tt) có độ nhớt khoảng

20-400 mPas, độ nhớt thay đổi theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của các ion
kim loại[31].
 pH: 7,2 (dung dịch 1% trong nước) [31].
1.3.3. Ứng dụng
Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã,
tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong bào chế viên giải
phóng kéo dài.Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược độn trong dạng viên
nang,tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột
nhão dùng tại chỗ. Chất phân ổn định thể chất trong nhũ tương, hỗn dịch. Trong
thời gian gần đây natri alginat được sử dụng để bào chế dạng vi nang và siêu vi
nang chứa dược chất, hay được sử dụng trong một số dạng chế phẩm tác dụng tại
chỗ khác như thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi [31].Trong công nghệ vi sinh, alginat được sử
dụng trong kĩ thuật bất động tế bào và bất động enzym, ngoài ra hiện nay nó đang
được nghiên cứu ứng dụng để tạo vi nang chứa vi sinh vật để tăng khả năng sống
của chúng trong các điều kiện bất lợi[16], [23], [29].
Trong ngành y tế, loại vải sợi sản xuất từ natri và calci alginat được sử dụng
để băng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn. Ngoài ra, do tính
trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong nước, natrialginat
được sử dụng trong một số thuốc dùng để ngăn cản trào ngược dạ dày- thực quản,
giảm chứng ợ hơi… [31].

12

1.3.4. Một số nghiên cứu sử dụng alginat trong bào chế probiotic
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu tìm ra phương pháp và tá dược
thích hợp nhằm cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic ngày càng được
quan tâm. Đã có nhiều kĩ thuật khác nhau được thử nghiệm như: bao tan trong ruột,
vi nang hóa, bao 2 lớp…Các kĩ thuật này có cùng 1 mục đích là bảo vệ vi khuẩn
probiotic trong điều kiện acid pH thấp ở dạ dày, các enzym tiêu hóa Tuy nhiên xét
về tính hiệu quả và khả năng triển khai trên quy mô công nghiệp thì kĩ thuậtvi nang

hóa tỏ ra ưu việt hơn. Các nghiên cứu gần của đã cho thấy những bằng chứng thực
nghiệm chứng minh việc vi nang hóa vi sinh vật bằng việc kết hợp dung dịch
alginat 2%, 3% (kl/tt) với dung dịch CaCl
2
ở các nồng độ 0,05M, 0,1M làm gia tăng
số lượng VSV sống sót trong các điều kiện bất lợi như: nhiệt độ cao, acid thấp dạ
dày, muối mật [16], [23], [31]. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu cho thấy việc
trộn trực tiếp các muối alginat của các kim loại hóa trị một (muối Natri alginat hoặc
kali alginat) với probiotic đã được làm khô, sau đó đóng nang cũng cho tác dụng
bảo vệ vi sinh vật. Tỉ lệ alginat đem trộn so với khối lượng toàn công thức một đơn
vị phân liều có thể biến đổi trong khoảng 10 ÷ 99% tuy nhiên tỉ lệ tối ưu là khoảng
từ 20 ÷ 60%. Lượng muối alginat hóa trị một sử dụng trong công thức cũng phụ
thuộc vào lượng vi sinh vật còn sống trong bột probiotic đã được làm khô [30].









13

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng
• Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653.
• Nguyên liệu :
Bảng 2.1: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Glucose
Trung Quốc
Sữa gầy
Trung Quốc
Pepton
Merk-Đức; Ấn Độ
Alginat
Trung Quốc
Cao thịt
Merk- Đức
Triamoni citrat
Trung Quốc
Cao nấm men
Merk- Đức
Acetat natri
Trung Quốc
K
2
HPO
4

Trung Quốc
MnSO
4
.4H
2

O
Trung Quốc
MgSO4.7H2O
Trung Quốc
HCl
Trung Quốc
Calci clorid
Trung Quốc
Tinh bột
Việt Nam

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• MRS lỏng (MT1).
Glucose 20g Acetat natri 5g
Pepton 10g K
2
HPO
4
2g
Cao thịt 10g MgSO
4
.7H
2
O 0,2g
Cao nấm men 5g MnSO
4
.4H
2
O 0,05g
Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1000ml

pH 6,8÷7,0
• Môi trường MRS thạch (MT2).
MT2= MT1 + thạch agar (22g/1000ml môi trường).
2.1.3. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
 Dung dịch sữa gầy 10%, 20%
 Dung dịch alginat1%, 2%, 5%.
14

 Dung dịch HCl pH 1,2 (pha theo DĐVN4)

2.1.4. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Tủ cấy vô trùng.
Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh sâu
Đức
Tủ lạnh LG
Hàn Quốc
Thiết bị đông khô
Đức
Máy li tâm
Đức
Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP - Nhật
Cân phân tích

Đức (Satorious)
Cân kĩ thuật
Đức(Satorious)
Máy đo hàm ẩm
Thụy Điển (Pressica)
Máy khuấy từ
Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (Vortex)
Trung Quốc
Đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, …


2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trong quá trình đông
khô Lactobacillus acidophilus.
 Đánh giá thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus tạo thành
sau khi đông khô
 Đánh giá độ ẩm và tốc độ hút ẩm của các mẫu đông khô vi sinh vật với tá dược
bảo vệ là sữa gầy và alginat.
 Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót sau đông khô.
15

 So sánh khả năng sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông khô có và
không có kết hợp alginat và sữa gầy
2.2.2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá dược
độn trong dạng thuốc rắn.
 Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của bột nguyên liệu probiotic có alginat
trong môi trường pH dạ dày.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức
nêu trong mục 2.1.2). Hòa tan hết các thành phần. Phân chia môi trường vào các
ống nghiệm sạch bằng phễu thủy tinh, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng. Đậy kín
bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115
o
C / 20 ph
trong nồi hấp tiệt khuẩn. Sau khi tiệt khuẩn để nguội xuống khoảng 37÷ 40
o
C. Cấy
giống vào ống nghiệm trên (thao tác cấy phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống VSV trong tủ ấm 5% CO
2
trong 24h ở 37±1
o
C
[7].
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (theo công
thức nêu trong mục 2.1.2). Hòa tan các thành phần trong công thức trong cốc có
mỏ. Chuyển 100ml môi trường MRS lỏng vào bình nón dung tích thích hợp. Đậy
kín miệng bình bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở 115
o
C /20ph trong nồi hấp tự động.
Lấy ra, để nguội xuống khoảng 37÷ 40
o
C. Cấy giống vào các bình nón trên trong tủ
cấy vô trùng, mỗi bình 1 ống giống 10ml. Ủ trong tủ ấm CO
2
5% trong 24h ở nhiệt
độ 37±1

o
C.
2.3.3. Phương pháp đông khô
 Chuẩn bị mu:
Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS ở điều kiện 37
o
C
trong 24h trong tủ ấm CO
2
5% (như phương pháp nêu trong mục 2.3.3.). Đồng nhất
dịch nuôi cấy bằng cách lắc bình chứa dịch nuôi cấy bằng máy lắc và khuấy từ
16

trong 10 phút, đong vào các ông li tâm mỗi ống 10ml hỗn dịch sinh khối (HDSK)
trên, li tâm các ống này với tốc độ 4000 vòng/ph. Lấy các ống li tâm khỏi máy, loại
bỏ phần dịch trong, giữ lại phần cắn sinh khối phía dưới, cho tá dược độn đã chuẩn
bị sẵn và được hấp tiệt khuẩn, để nguội và ống li tâm, đậy kín nắp, lắc trên máy lắc
(Vortex) cho sinh khối thu được phân tán đều trong dung dịch tá dược độn. Đổ hỗn
dịch các mẫu này ra đĩa petri đã được làm sạch và hấp tiệt khuẩn từ trước, đậy kín
bằng giấy nhôm, để các đĩa này vào trong tủ lạnh sâu -80
o
C cho đông rắn hoàn toàn,
sau đó tiến hành giai đoạn làm khô trong máy đông khô.Tạo các mẫu đông khô với
thành phần như sau:
Mẫu 1: SK + Nước cất.
Mẫu 2: SK + dịch li tâm
Mẫu 3: SK + dung dịch sữa gầy 10%.
Mẫu 4: SK + dung dịch alginat 2%.
 Tiền đông: Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu -80
o

C cho tớikhi mẫu
đông rắn hoàn toàn.
 Làm khô: Các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở
nhiệt độ khoảng -54
o
C, 0.055mbar.
Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị chuyển vào bao polymer
có khóa, mang đi pha loãng để xác định số vi sinh vật sống sót hoặc đậy kín rồi bảo
quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4
o
C.
2.3.4. Phương pháp xác định hàm ẩm
Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Prescisa.
Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm. Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu,
dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy. Chờ máy gia nhiệt trong khoảng 5 phút
hoặc đến khi máy hiện kết quả. Đọc, ghi lại số liệu hiện trên màn hình (a
1
). Hàm ẩm
của mẫu là hiệu số của (100- a
1
)%.
2.3.5. Phương pháp xác định số lượng VSV theo phương pháp pha loãng liên
tục
 Chuẩn bị