Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




BẠC CẦM MY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
CỦA LÁ CÂY HỒNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


BẠC CẦM MY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN
CỦA LÁ CÂY HỒNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS. Vũ Văn Điền
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền
2. Bộ môn Vi sinh – Sinh học


HÀ NỘI - 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Những sự
quan tâm giúp đỡ quý báu đó đã góp phần giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Văn Điền,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và cho tôi nhiều lời khuyên quý báu.
Thầy đã dành nhiều thời gian và công sức tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời
gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn
Dược học cổ truyền đã luôn giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian
nghiên cứu thực nghiệm tại Bộ môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Cao Văn Thu (Bộ môn
Vi sinh – Sinh học) và TS. Nguyễn Quốc Huy (Bộ môn Thực vật), những người đã
nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên tôi,
giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong công việc, đồng thời cũng là nguồn động viên khích lệ tinh
thần giúp tôi cố gắng hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Do hạn chế về thời gian và phạm vi đề tài, kết quả nghiên cứu của tôi mới
chỉ là bước đầu, đồng thời trong quá trình thực hiện khó tránh khỏi thiếu sót, tôi rất
mong nhận được những góp ý của thầy cô và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014
Sinh viên
Bạc Cầm My

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.2. Thành phần hóa học 5
1.3. Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng 8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11
2.2. Nội dung nghiên cứu 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu 14
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng 16
3.1.1. Đặc điểm hình thái 16
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu 17
3.1.3. Đặc điểm bột lá 19
3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng 20
3.2.1. Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 20
3.2.2. Chiết xuất, định tính và định lượng các phân đoạn 28
3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng 42
3.3.1. Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần 42
3.3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn của phân đoạn chloroform và ethyl acetat 45
3.4. Bàn luận 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AST Ánh sáng thường
D. Diospyros
EtOAc Ethyl acetat
EtOH Ethanol
MeOH Methanol
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TT Thuốc thử
VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng Trang

1
Bảng 1.1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kaempferol phân lập
từ lá Hồng đối với một số chủng vi sinh vật
9
2 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Hồng 27
3 Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 31
4 Bảng 3.3. Kết quả định tính cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 32
5
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao lỏng toàn phần
các nồng độ 1:1, 1:2, 1:4
44
6
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 2 phân đoạn
chloroform và ethyl acetat
45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT

Tên hình vẽ, đồ thị Trang
1 Hình 1.1. Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây 4
2 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 14 triterpenoid phân lập từ lá Hồng 6
3 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá Hồng 7
4 Hình 3.1. Cành mang lá cây Hồng 16
5 Hình 3.2. Hình thái lá cây Hồng 16
6 Hình 3.3. Ảnh chụp vi phẫu gân lá Hồng 17
7 Hình 3.4. Ảnh chụp vi phẫu phiến lá Hồng 18
8 Hình 3.5. Đặc điểm bột dược liệu lá Hồng 19
9 Hình 3.6. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Hồng 30
10
Hình 3.7. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng với hệ
dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1)
34

11
Hình 3.8. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng
quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
35
12
Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng với hệ
dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1)
37
13
Hình 3.10. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá
Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
38
14
Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat với hệ dung môi khai
triển Toluen: EtOAc: Acid formic (9:6:1)
40
15
Hình 3.12. Kết quả sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat quan sát dưới
ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
41
16
Hình 3.13. Sơ đồ sắp xếp khoanh giấy lọc các mẫu thử hoạt tính
kháng khuẩn
43
17
Hình 3.15. Vòng vô khuẩn của mẫu thử phân đoạn chloroform và
ethyl acetat với vi khuẩn Bacillus pumilus và Shigella flexneri
46

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Hồng (Diospyros kaki L.f.) là một loài cây thuộc họ Thị (Ebenaceae), có
nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, sau đó du nhập vào Việt Nam [10]. Hồng là
một nguồn cung cấp phong phú các acid amin, carotenoid, flavonoid, protein,
vitamin…[29] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chứng minh các chất phân lập
từ lá Hồng có nhiều tác dụng sinh học quan trọng như tác dụng hạ huyết áp [18],
kháng khuẩn, chống ung thư [11], chống viêm, hạ lipid máu [29], chống oxy hóa
[23]… Điều này cho thấy tiềm năng phát triển lớn của dược liệu này.
Ở Việt Nam, cây Hồng được trồng chủ yếu để làm cây ăn quả. Một số bộ
phận của cây được dùng làm thuốc như tai Hồng (Thị đế), nước ép từ quả Hồng
(Thị tất), chất đường từ quả Hồng (Thị sương) [6]… Lá Hồng cũng được sử dụng
làm lá trà để chữa bệnh tăng huyết áp. Tuy nhiên, việc sử dụng lá Hồng làm thuốc
mới chỉ dừng lại ở kinh nghiệm dân gian, chưa có cơ sở khoa học chứng minh tác
dụng và hướng dẫn sử dụng loại dược liệu này. Các tài liệu của Việt Nam về lá
Hồng còn rất hạn chế, chủ yếu là thông tin về đặc điểm hình thái thực vật. Với mục
đích cung cấp cái nhìn tổng quát về thực vật, hóa học và sinh học cho dược liệu lá
Hồng, đặt cơ sở bước đầu cho những nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát huy hết
tiềm năng của dược liệu này, chúng tôi tiến hành xây dựng đề tài “Nghiên cứu đặc
điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng”
với các mục tiêu:
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng.
3. Thử hoạt tính kháng khuẩn của lá cây Hồng.

2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật
1.1.1. Vị trí phân loại chi Diospyros
Cây Hồng có tên khoa học là Diospyros kaki L.f., tên đồng nghĩa: Diospyros
chinensis Blume, là một loài thuộc chi Diospyros. Cây còn có các tên gọi khác như
thị đinh, mác pháp (Tày)… Tên nước ngoài: Kaki – persimmon, Japanese
persimmon (Anh); kakier, plaqueminier kaki, plaqueminier du Japon, coing de
Chine (Pháp) [10], Shi Zi (Trung Quốc) [19].
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 1987 [1],[6], [24], vị trí phân
loại của chi Diospyros được tóm tắt như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Sổ (Dilleniidae)
Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae)
Bộ Thị (Ebenales)
Họ Thị (Ebenaceae)
Chi Diospyros
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Diospyros
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật
Cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường xanh. Lá mọc so le, nguyên [7].
Thỉnh thoảng có các vết mờ rải rác hoặc các vết rỗ lớn [22].
Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi lưỡng tính. Hoa đực
mọc thành xim ở nách lá; nhị từ 4 đến rất nhiều, thường kết hợp thành 2 vòng xoắn.
Hoa cái thường đơn độc, mọc ở nách lá; nhị lép 1-16 hoặc không có; bầu thường có
2 ô. Đài hoa thường có 3-7 thùy. Tràng hoa hình chum, hình chuông, hoặc hình ống,
3-7 thùy, rụng sớm. Quả thịt, mang đài to không rụng. Hạt 1-10 (hoặc hơn), thường
hẹp theo bề ngang [22].

3

1.1.2.2. Phân bố
Chi Diospyros là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 loài, phân
bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (ở châu Á có tới 200 loài) và một số nơi thuộc khu
vực ôn đới, trong đó đa dạng nhất ở khu vực Đông và Đông Nam Á, chỉ có một số
loài ở Tây Á, Nhật Bản và Đông Nam nước Mỹ [24]. Trung Quốc có 60 loài, nhiều
nhất ở Đông Nam và Tây Nam Trung Quốc [22]. Ở nước ta, đã thống kê được 70
loài [7], 9 loài cho gỗ có giá trị sử dụng, 2 loài có quả ăn được là Hồng (D.kaki) và
Cậy (D.lotus) [10].
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Diospyros kaki L.f.
1.1.3.1. Đặc điểm thực vật
Cây gỗ lớn cao tới 15m. Lá mọc so le; có cuống ngắn, dài không quá 1 cm.
Phiến lá thuôn hình trứng hoặc trái xoan, dài 6 – 18 cm, rộng 3 – 9 cm, đầu có mũi
lồi ngắn, gốc lá nhọn dần, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có lông tơ, mép
nguyên hay hơi lượn sóng.
Cụm hoa mọc ở kẽ lá, màu vàng nhạt. Cây đực, cây cái riêng biệt hoặc có khi
hoa đực, hoa cái có trên cùng một cây. Hoa đực tụ họp thành xim 3 hoa ở nách lá,
có 2 lá bắc, 14-24 nhị thường là 16. Hoa cái mọc đơn độc, đài xẻ 5 thùy, bầu có 4
vòi nhụy và 4 ô, thường có vách giả chia làm 8 ngăn [8], [10], [22].
Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, nhẵn, phẳng hoặc có sống dọc, mang
đài tồn tại cong lên, khi chín màu vàng hoặc đỏ. Hạt dẹt, màu nâu vàng hoặc nâu
đen. (Hình 1.1)
Mùa hoa: tháng 3 – 7, mùa quả: tháng 8 – 10 [10].
1.1.3.2. Phân bố
Diospyros kaki L.f. loài nguyên sản ở Nhật Bản và Trung Quốc, sau được du
nhập sang các nước Đông Nam Á khác như ở vùng Bắc Thái Lan, đảo Java,
Sumatra (Indonesia); Malaysia. Ở Italia, Israel, Brazil, Mỹ (California) cũng có
trồng loài hồng này.

Ở Việt Nam, D. kaki là loài hồng được trồng phổ biến. Đây là cây ăn quả lâu
đời ở các tỉnh phía Bắc từ Thanh Hóa trở ra. Cây thường trồng ở vườn nhà, vườn
4

trang trại từ độ cao 500m trở xuống. Ở miền Nam, hồng mới được phát triển ở Đà
Lạt (Lâm Đồng). Các giống hồng đang được trồng hiện nay vô cùng phong phú như
hồng Hạc, hồng Lạng, hồng vuông, hồng trứng… [10]

Hình 1.1. Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây
Chú thích:
1. Toàn cây
2. Cây mang quả
3. Cành mang lá
4. Cành mang hoa
5. Quả hồng
6. Tai hồng
5

1.2. Thành phần hóa học
Trên thế giới, nhiều hợp chất đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của
cây Hồng, chủ yếu thuộc các nhóm chất glycoside, flavonoid, tanin, saponin, sterol
và triterpenoid [20], [21].
Quả hồng chứa 79,6% nước, 0,8% protein, 0,2% chất béo, 0,4% chất
khoáng, 19% carbonhydrat, calci, phosphor, sắt, caroten, vitamin A, thiamin,
riboflavin, niacin và vitamin C. Đã tìm thấy trong quả các hợp chất như citrulin,
isodiospyrin, bisisodiospyrin, 2,3-butylen glycol, manitol, phytofluen, neodiospyrin,
zeaxanthin và lyeopin. Quả còn có tanin, pectin và polysaccharid. Tanin khi thủy
phân với kiềm thu được phloroglucinol và pyrocatechol [10]. Tanin có trong quả
hồng xanh khiến quả có vị rất chát, khi chín vị chát này hầu như mất đi, khi đó
lượng đường khoảng 13 – 19% dưới dạng glucose, saccharose và fructose [8].

Hạt hồng chứa 0,8% acid citric, 4,76% đường khử và 5,9% đường tự do
[10].
Tai hồng chứa acid oleanolic, acid ursolic, acid betulic, acid syringic, acid
vanillic, β-sitosteryl- β-glucoside, trifolin, hyperin và kaempferol. [6]
Lá Hồng có chứa nhiều hợp chất hữu cơ, chủ yếu thuộc các nhóm chất:
pectic polysaccharid, flavonoid, triterpenoid, đường, protein, các acid amin,
vitamin… [12], [17], [29].
 Triterpenoid
Năm 2008, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc (tại Hàn Quốc) đã phân
lập và xác định cấu trúc của 14 triterpenoid từ lá cây Hồng (dịch chiết methanol,
phân đoạn ethyl acetat). Trong đó có 2 triterpenoid mới và 12 triterpenoid đã biết.
Cấu trúc của 2 triterpenoid mới được xác định là 3R,19R-dihydroxyurs-
12,20(30)-dien-24,28-dioic acid (1) và 3R,19R-dihydroxyurs-12-en-24,28-dioic
acid (2).
12 triterpenoid đã biết được nhận diện là: coussaric acid (3), barbinervic acid
(4), 24-hydroxy-3-epi-ursolic acid (5), rotungenic acid (6), pomolic acid (7), 24-
hydroxyursolic acid (8), ursolic acid (9), 24-dihydroxyurs-12-en-3-on-28-oic acid
6

(10),oleanolic acid (13), 24-hydroxy-3-epi-oleanolic acid (11), và spathodic acid
(14). [25]
Công thức hóa học của 14 triterpenoid được trình bày trong Hình 1.2.


Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 14 triterpenoid phân lập từ lá Hồng

 Flavonoid
Năm 2010, một nghiên cứu tổng quan của các nhà khoa học Trung Quốc cho
thấy lá của loài Diospyros kaki L.f. có các hợp chất flavonoid chính tương tự như lá
của loài Ginkgo biloba, gồm các chất sau: myricetin, quercetin, kaempferol,

astragalin, hyperin, isoquercitrin, rutin [29].
Cấu trúc của các flavonoid này được trình bày trong Hình 1.3.

7



Myricetin Quercetin Kaempferol

Astragalin Hyperin Isoquercitrin

Rutin
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá cây Hồng

Ngoài ra, nhiều hợp chất khác cũng được phân lập từ lá Hồng: gamnamoside
[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol β-D-apiofuranosyl (1
→
6) β-D-
glucopyranoside] (2009) [26]; 8-C-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→4)]-α-D-
glucopyranosylapigenin (2009) [13]; một số pectic polysaccharid (2003, 2004,
2010) [15], [16], [14]; kaempferol 3-O-beta-D-galactopyranoside (TR),
8

isorhamnetin 3-O-beta-D-glucopyranoside (IS) (2011) [28]; hyperoside, trifolin,
chrysontemin, quercetin-3-O-(200-O-β-alloyl-D-glucopyranoside) (QOG),
kaempferol-3-O-(200-O-β-alloyl-D-glucopyranoside) (KOG) (2011); lupeol, β-
sitosterol (2014) [11].
Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố về thành phần hóa học của
lá cây Hồng.
1.3. Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng

1.3.1. Tác dụng hạ huyết áp
Lá Hồng đã được sử dụng như một bài thuốc dân gian để điều trị bệnh tăng
huyết áp tại nhiều nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam…[29].
Flavonoid từ lá Hồng có tác dụng ức chế men chuyển angiotensin theo cách phụ
thuộc vào liều [10].
Tại Nhật Bản, tác dụng ức chế men chuyển angiotensin đã được nghiên cứu
trên bốn flavonoid phân lập từ lá Hồng: astragalin (1), kaempferol -3 -O- (2" -O-
alloyl ) -glucoside (2), isoquercitrin (3) , và quercetin -3 -O- (2 " -O- alloyl )-
glucoside (4). Thử nghiệm được tiến hành trên enzym chuyển angiotensin phân lập
từ phổi chuột. Các hợp chất (1) – (4) có khả năng ức chế lần lượt là 67%, 53%,
33%, và 48% ở nồng độ 300 µg/ml. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của (1) và (2) đối
với men chuyển tương ứng là 180 µg/ml và 280 µg/ml. Mặt khác, (2) và (4) đã
được chứng minh là có hoạt tính của tanin, nhưng (1) và (3) không có hoạt tính
tanin. Những kết quả này cho thấy không có mối quan hệ giữa sự ức chế men
chuyển với hoạt tính của tanin trong bốn hợp chất [18].
1.3.2. Tác dụng ức chế vi sinh vật
Khả năng ức chế VSV của kaempferol phân lập từ dịch chiết EtOAc của lá
Hồng đã được khảo sát trên nhiều chủng VSV. Các thử nghiệm được tiến hành theo
phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch Saboroud, mẫu chuẩn Amphotericin
B đối với nấm; môi trường thạch dinh dưỡng, mẫu chuẩn Penicillin G đối với vi
khuẩn Gram (+) và Gentamycin đối với vi khuẩn Gram (-). Kết quả được ghi trong
Bảng 1.1.
9

Bảng 1.1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kaempferol phân lập từ lá Hồng
đối với một số chủng VSV [11]
Chủng VSV thử
MIC (µg/mL)
Kaempferol Mẫu chuẩn
Nấm:

Trichophyton mentagrophytes
Aspergillus fumigates
Candida albicans
Geotricum candidum
Penicillium marneffei
Syncephalastrum racemosum

3,9
15,3
31,25
0,98
3,9
31,25
Amphotericin B
3,9
0,98
0,06
0,12
0,98
0,007
Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus pyogenes
Bacillus subtilis
Enterococcus faecalis

0,98
0,24
15,63

0,12
62,5
Penicillin G
0,015
0,12
0,06
0,007
0,98
Vi khuẩn Gram (-):
Neisseria gonorrhoeae
Proteus vulgaris
Klebsiella pneumoniae
Shigella flexneri
Pseudomonas aeruginosa

125
0,98
0,12
1,95
62,5
Gentamycin
3,9
0,49
0,06
0,12
31,25

Nghiên cứu trên cho thấy, kaempferol phân lập từ lá hồng có hoạt tính kháng
VSV đối với cả nấm và vi khuẩn, trong đó tác dụng mạnh trên nhiều vi khuẩn Gram
(+) và Gram (-).

10

1.3.3. Tác dụng chống ung thư
Lupeol phân lập từ lá Hồng cho kết quả rõ ràng về khả năng chống ung thư
thử nghiệm trên tế bào MCF-7 và tế bào HeLa với nồng độ ức chế 50% (IC50) lần
lượt là 20,7 và 23,4 μg/mL.
Uvaol, α-amyrin và kampferol cũng cho thấy tác dụng kháng tế bào MCF-7
với IC50 tương ứng là 46,2, 47,1 và 43,4 μg/mL [11].
1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá Hồng trên tế bào MC3T3-E1
với chất chống oxy hóa chuẩn rutin cho thấy dịch chiết flavonoid toàn phần có tác
dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng dọn các superoxide anion và các gốc
hydroxyl tự do ở mức độ vượt trội so với rutin, khả năng dọn các gốc 1,1-diphenyl-
2-picrylhydrazyl kém hơn so với rutin [23].

11

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là lá cây Hồng trơn được thu hái tại xã Yên Mỹ, huyện
Thanh Trì, Hà Nội vào tháng 10 năm 2013 và tháng 5 năm 2014.
Mẫu được thu hái và xử lý như sau:
 Mẫu cành mang lá và quả tươi dùng để giám định tên khoa học.
 Mẫu lá tươi được rửa sạch, dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái và vi phẫu.
 Mẫu lá khô: Lá được rửa sạch, phơi se, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60
o
C đến khô.
- Một phần mẫu được tán mịn, dùng để nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu.
- Phần mẫu còn lại được xay thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô
ráo, thoáng mát, dùng để chiết xuất nghiên cứu thành phần hóa học và thử
tác dụng kháng khuẩn.
Mẫu nghiên cứu được TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, trường Đại học
Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Diospyros kaki Thunb., họ Thị
(Ebenaceae). (Phụ lục 1)
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Thuốc thử, dung môi, hóa chất
 Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật
Nước cất
Nước tẩy Javen
Acid acetic 5%
Xanh methylen

Đỏ carmin
Glycerin
 Thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa
học
- Dung môi: Ethanol, nước cất, n-hexan, chloroform, ethyl acetat, ether dầu hỏa,
toluen, aceton, acid formic, acid acetic…
- Hóa chất: NaOH, NH3 đặc, HCl, anhydrid acetic, H
2
SO
4
đặc, FeCl
3
, chì acetat,
bột Magnesi, gelatin, KOH…
12

- Thuốc thử: các thuốc thử thường dùng để định tính các nhóm chất hữu cơ trong
dược liệu như thuốc thử Mayer, Dragendorff, FeCl
3
5%, Lugol…
- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF
254
của hãng MERCK (Đức).
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt tiêu chuẩn hóa chất kiểm nghiệm, có xuất
xứ từ Trung Quốc.
 Thuốc thử, hóa chất sử dụng trong thử tác dụng kháng khuẩn
- Các chủng vi khuẩn kiểm định:
Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922
Proteus mirabilis BV 108

Shigella flexneri DT 112
Salmonella typhi DT 220
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus ATCC 1128
Bacillus pumilus ATCC 10241
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus cereus ATCC 9946
Sarcina lutea ATCC 9341
- Các mẫu chuẩn :
Streptomycin sulfat: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gram (-)
Benzathin penicillin: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gram (+)
- Môi trường thử nghiệm:
 Môi trường canh thang để nuôi cấy vi khuẩn kiểm định
NaCl 0,5%
Pepton 0,5%
Cao thịt 0,3%
Nước vđ 100 ml
 Môi trường thạch thường
NaCl 0,5%
Pepton 0,5%
Cao thịt 0,3%
Thạch 1,6%
Nước vđ 100 ml
13

Các chủng vi khuẩn, mẫu chuẩn và hóa chất thuộc bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ:

Lưỡi dao lam, phiến kính, lá kính …và các dụng cụ làm tiêu bản vi phẫu khác.
Thước đo đường kính vòng vô khuẩn.
Thuyền tán, cối, rây, bộ dụng cụ chiết hồi lưu (bình cầu, ống sinh hàn), bình chiết,
bình nón, cốc có mỏ và các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Thiết bị:
Kính hiển vi LABOMED (Mỹ) Serial No. 070918442
Máy ảnh kỹ thuật số Sony Cybershot W370
Tủ sấy Memmert (Đức)
Máy soi đèn tử ngoại VILBER LOURMAT CN-6.T (Pháp) Serial No.12 101537
Máy soi đèn tử ngoại CAMAG (Thụy Sỹ) Serial No.t 022.9120
Tủ hốt UNI-LAB
Máy cất quay BÜCHI Rotavapor R-200 (Thụy Sỹ) Serial 803894010002
Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức) serial 23808521
Cân kỹ thuật Precisa XB 320C (Thụy Sỹ)
Máy ly tâm K Universal Centrifuge PLC-012E (Đài Loan) serial 717902
Bể cách thủy HHS4 (Trung Quốc) Serial No. 211121618
Bếp điện Wisd Heating Mantle WHM12014 (Hàn Quốc) Serial No.0406452128
Máy đo độ ẩm Precisa XM120
Hệ thống máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5, máy chụp sắc ký CAMAG TLC
VISUALIZE (Thụy Sỹ) được kết nối với máy vi tính có cài đặt phần mềm
WinCATS, VideoScan.
Các dụng cụ, thiết bị thuộc bộ môn Dược học cổ truyền và một số bộ môn khác,
trường Đại học Dược Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây Hồng
14

 Mô tả đặc điểm hình thái lá nghiên cứu.
 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột lá Hồng.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Hồng

 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học.
 Chiết xuất, định tính và định lượng một số phân đoạn.
2.2.3. Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng
 Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần đối với 5 chủng vi khuẩn
Gram (-) và 5 chủng vi khuẩn Gram (+).
 Thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết các phân đoạn chloroform và ethyl
acetat đối với các chủng vi khuẩn trên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
 Mô tả hình thái thực vật
Quan sát trực tiếp mẫu nghiên cứu bằng mắt thường, mô tả các đặc điểm hình
thái của lá theo phương pháp ghi trong các tài liệu [1], [4].
 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Cắt tiêu bản vi phẫu bằng lưỡi dao lam, tẩy nhuộm bằng phương pháp nhuộm
kép theo phương pháp vi phẫu thực vật thường quy [4]. Làm nhiều tiêu bản, lựa
chọn tiêu bản mỏng, nhìn rõ để quan sát và chụp ảnh qua kính hiển vi.
Nhận biết các đặc điểm theo tài liệu [4].
 Nghiên cứu đặc điểm bột lá
Soi bột lá dưới kính hiển vi, quan sát các đặc điểm. Làm nhiều tiêu bản bột,
chụp ảnh ghi lại đầy đủ các đặc điểm của bột lá.
Nhận biết các đặc điểm theo hướng dẫn trong tài liệu [2].
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học
 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học
Tiến hành theo các phương pháp hóa thực vật thường quy [2], [3], [9].
15

Sử dụng dung môi thích hợp để chiết dịch chiết toàn phần của mỗi nhóm chất,
dùng thuốc thử đặc hiệu của mỗi nhóm chất để định tính, có đối chiếu với mẫu trắng
để nhận xét kết quả.
 Chiết xuất, định lượng các phân đoạn dịch chiết từ dược liệu

Sử dụng dung môi ethanol 70%, chiết theo phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng
cứ 24h rút dịch chiết 1 lần, chiết 3 lần, gộp các dịch chiết, thu hồi dung môi thu
được cao lỏng nước. Loại tạp. Dùng cao lỏng này chiết lần lượt với các dung môi có
độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, sau đó bốc hơi dung môi
thu được cắn các phân đoạn tương ứng. Cân và tính hàm lượng các cắn.
 Định tính các phân đoạn dịch chiết bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp
mỏng
Định tính cắn các phân đoạn theo định hướng các nhóm chất chính và phân tích
bằng sắc ký lớp mỏng theo các phương pháp hóa thực vật thường quy [2], [3], [9],
[27].
2.3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn
Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng cồn toàn phần, 2 phân
đoạn dịch chiết chloroform và ethyl acetat đối với các chủng vi khuẩn Gram (+),
Gram (-) theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch [5].
Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh
dưỡng đã cấy VSV kiểm định. Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường
thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước Panmer có độ chính xác
0,02 mm, so sánh với mẫu chuẩn để đánh giá kết quả. Mỗi mẫu là 6 lần để lấy kết
quả trung bình.





16

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng
3.1.1. Đặc điểm hình thái

Lá Hồng mọc so le, đơn. Cuống lá dài 0,5 – 1,5 cm. Phiến lá hình bầu dục
hoặc hình trứng, dài 6 – 20 cm, rộng 3 – 9 cm; ngọn lá có mũi lồi nhọn, gốc lá
thuôn dần; mép lá nguyên hoặc hơi lượn sóng; mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu
nhạt, có lông. Gân lá hình lông chim.


Hình 3.1. Cành mang lá cây Hồng


Hình 3.2. Hình thái lá cây Hồng
17

3.1.2. Đặc điểm vi phẫu
Phần gân lá: Gân lá phía trên lồi ít, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì trên (1) và
biểu bì dưới (7) là một lớp tế bào hình tròn hay hình bầu dục, nhỏ, xếp đều đặn,
mang lông che chở đơn bào (4), thỉnh thoảng có lông tiết (8). Sát lớp biểu bì là lớp
mô dày (5) cấu tạo bởi 3 – 4 lớp tế bào hình tròn hoặc hình trứng, thành dày. Mô
mềm (6) gồm các tế bào hình tròn hoặc hình trứng, thành mỏng, kích thước tương
đối lớn, sắp xếp lộn xộn. Một bó libe – gỗ xếp thành hình cung; libe (3) ở dưới, bắt
màu đỏ; gỗ (2) ở trên, gồm nhiều mạch gỗ hình tròn, bắt màu xanh. (Hình 3.3)

Hình 3.3. Ảnh chụp vi phẫu gân lá Hồng
Chú thích:
1. Biểu bì trên
2. Gỗ
3. Libe
4. Lông che chở đơn bào
5. Mô dày
6. Mô mềm
7. Biểu bì dưới

8. Lông tiết
18

Phần phiến lá: Phiến lá có cấu tạo dị thể bất đối xứng. Biểu bì trên (1) và
biểu bì dưới (4) là một hàng tế bào hình chữ nhật, kích thước lớn hơn nhiều so với
tế bào biểu bì ở gân lá, mang lông che chở đơn bào (5). Dưới lớp biểu bì trên là mô
giậu (2) gồm một lớp tế bào dài xếp sát nhau, thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá.
Mô khuyết (3) được cấu tạo bới các tế bào thành mỏng, kích thước không đều, sắp
xếp lộn xộn tạo thành các khoảng trống. (Hình 3.4)


Hình 3.4. Ảnh chụp vi phẫu phiến lá Hồng

Chú thích:
1. Biểu bì trên
2. Mô giậu
3. Mô khuyết
4. Biểu bì dưới
5. Lông che chở đơn bào