Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn lá cây hồng xiêm

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



BÙI HỒNG TÀI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN LÁ CÂY
HỒNG XIÊM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI HỒNG TÀI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN LÁ CÂY
HỒNG XIÊM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Vũ Văn Điền
2.ThS. Chử Thị Thanh Huyền
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược cổ truyền
2. Bộ môn Vi sinh-Sinh học


HÀ NỘI – 2014



LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Vũ Văn Điền –
Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Chử Thị Thanh Huyền đã tận tình hướng
dẫn tôi thực hiện khóa luận.
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Cao Văn Thu đã giúp đỡ tôi thực hiện thử tác dụng kháng khuẩn.
TS. Nguyễn Quốc Huy đã giúp đỡ tôi xác định tên khoa học của mẫu cây
nghiên cứu.
Các thầy cô giáo trong bộ môn Dược Cổ Truyền, Đại học Dược Hà Nội.
Cảm ơn nhà trường đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài.
Cảm ơn gia đình bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014

Sinh viên


Bùi Hồng Tài






MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 2
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Manilkara 2
1.1.2. Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae) 2
1.1.3. Đặc điểm chi Manilkara 2
1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây hồng xiêm 3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY HỒNG XIÊM 4
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC 5
1.4. TÍNH VỊ, CÔNG NĂNG 6
1.5. CÔNG DỤNG 7
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8
2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 8
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 8
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 8
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10

2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10
2.2.2. Nghiên cứu về hóa học 10
2.2.3. Thử tác dụng kháng khuẩn 10
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
2.3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học 10
2.3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn 11
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA 12
3.1. NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 12
3.1.1. Đặc điểm dược liệu lá cây hồng xiêm 12
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá 12
3.1.3. Đặc điểm bột lá 13


3.2. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 14
3.2.1. Định tính các nhóm chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 14
3.2.2. Chiết xuất 21
3.2.3. Định tính các phân đoạn bằng SKLM 25
3.2.4. Phân lập chất từ cắn phân đoạn Ethyl acetat 31
3.3. THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN 39
3.3.1. Chuẩn bị 39
3.3.2. Tiến hành 40
3.4. BÀN LUẬN 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây hồng xiêm có nguồn gốc từ Nam Mỹ, chủ yếu ở Mêhicô. Hiện nay được di
thực vào nhiều nước nhiệt đới. Ở châu Á, hồng xiêm được trồng nhiều nhất tại Thái
Lan, Philippin, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Campuchia, Việt Nam [14]. Ở Việt
Nam, chủ yếu được trồng ở miền Nam, nhưng ở miền Bắc cũng được trồng ở nhiều
nơi. Cây trồng chủ yếu để lấy quả. Nhựa chiết từ vỏ và quả hồng xiêm sử dụng
trong thực phẩm và dược phẩm, lá cây hầu như không được sử dụng [14], [11].
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về cây hồng xiêm rất hạn chế đặc biệt
nghiên cứu về lá cây hầu như chưa có. Tuy nhiên ở nước ngoài có khá nhiều nghiên
cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của lá cây. Với mục đích
nghiên cứu để tìm hiểu khả năng khai thác và sử dụng lá cây hồng xiêm, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học
và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng xiêm ” được thực hiện với một số mục
tiêu sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu và bột lá cây hồng xiêm.
2. Nghiên cứu các nhóm chất và phân lập chất từ lá cây hồng xiêm.
3. Thử hoạt tính kháng khuẩn lá cây hồng xiêm.
Để thực hiện những mục tiêu đã đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây hồng xiêm thu hái ở Nghệ An: Mô tả
đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá, đặc điểm bột lá.
2. Xác định các nhóm chất có trong lá cây và các phân đoạn dịch chiết bằng
phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
3. Định lượng sơ bộ khối lượng các phân đoạn.
4. Định hướng phân lập chất sạch từ phân đoạn ethyl acetat.
5. Thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết toàn phần.



2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Manilkara
Cây hồng xiêm có tên khoa học là Manilkara zapota (L.) P.Van Royen [5].
Tên đồng nghĩa: Achras zapota L. [5].
Tên nước ngoài: Sapota, sapodilla plum (Anh), sapotier, sapotillier (Pháp) [14],[17].
Chi Manilkara, họ Hồng xiêm (Sapotaceae), bộ Hồng xiêm (Sapotales), phân lớp
Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc lan (Magnolisida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta).
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnolisida)
Phân lớp Sổ (Dilleniidae)
Bộ Hồng xiêm (Sapotales)
Họ Hồng xiêm (Sapotaceae)
Chi Manilkara [5], [1].
1.1.2. Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae)
Họ Hồng xiêm hay còn gọi là họ Xabôchê [8], [1].
Cây gỗ, lá đơn, thường mọc cách, không có lá kèm hay lá kèm nhỏ rụng sớm.
Cây thường có mủ trắng, hoa lưỡng tính, cánh hoa thường có phần phụ ở bên hay ở
lưng, vòng nhị ngoài thường là nhị lép. Hoa thành bó, bộ nhị gồm 2-3 vòng, bộ
nhụy gồm 4-12 lá noãn, quả mọng, hạt có nội nhũ dầu [1], [6].
Ở Việt Nam có 16 chi, trên 40 loài [1].
1.1.3. Đặc điểm chi Manilkara
Chi Manilkara gồm xấp xỉ 79 loài phân bố khắp các vùng nhiệt đới (30 loài ở
Nam và Trung Mỹ, 35 loài ở châu Phi và 14 ở Đông Nam Á) [15].
Cây gỗ, lá đơn, thường mọc cách, không có lá kèm hay lá kèm nhỏ rụng sớm.
Cây thường có mủ trắng, hoa lưỡng tính, cánh hoa có phụ bộ ở lưng, tiểu nhụy bằng
số cánh hoa, có tiểu nhụy lép. Hoa có 6 lá đài, 6 cánh hoa, hột dẹp, dài [8].
3

Chi Manilkara có chứa triterpenes, saponin và flavonoid. Dịch chiết có hoạt tính

kháng sinh, diệt ký sinh trùng, chống côn trùng có hại, kháng cholinesterase [18].
1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây hồng xiêm
1.1.4.1. Đặc điểm thực vật

Ảnh toàn cây Cành mang hoa

Quả Hạt
Hình 1.1. Hình ảnh một số bộ phận cây hồng xiêm
Cây to, cao 10-15m, phân cành nhiều [14], mủ trắng, vỏ xám nâu, lỗ bì tròn [5].
Cành và lá khi còn non được phủ lông tơ. Lá mọc gần nhau ở chót nhánh [5], mọc
so le, dày và dai, hình trứng hoặc trái xoan, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, mặt
trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt, gân phụ nhiều, xếp song song, đều đặn [14], cách
nhau 4-6 mm [5].
Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, lưỡng tính màu vàng nhạt, đài 6 răng, xếp thành hai
hàng, phủ lông màu vàng, tràng 6 cánh, nhị 6, nhị lép nhiều, bầu 10-12 ô [14], [5].
Quả mọng hình trứng, vỏ mỏng màu nâu, rốn kéo dài màu nâu nhạt và nháp, hạt dẹt,
màu đen, nhọn ở hai đầu [14], [11]. Quả có đường kính 4-8 cm, chứa 2-5 hạt [30].
Mùa hoa: Tháng 5-8, mùa quả: Tháng 9-11 [14].
4

1.1.4.2. Phân bố
Cây có nguồn gốc Trung Mỹ và Nam Mỹ, chủ yếu ở Mêhicô [14], [19], [24],
[31]. Hiện nay được di thực vào nhiều nước nhiệt đới. Ở châu Á, hồng xiêm được
trồng nhiều nhất tại Thái Lan, Philippin, Malaysia, Indonesia, Srilanca, Ấn Độ,
Campuchia và Việt Nam [14], [17]. Ở Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh
từ Bắc vào Nam, trừ vùng núi cao trên 1000m. Hồng xiêm là cây ưa khí hậu nhiệt
đới nóng ẩm, với nhiệt độ thích hợp từ 24 đến 30˚C. Cây trồng ở các tỉnh phía Bắc
có thể chịu được nhiệt độ dưới 10˚C về mùa đông. Cây không mọc được ở vùng khô
hạn [14].
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY HỒNG XIÊM

Lá và vỏ thân chứa terpenoid, flavonoid, glycosid [21], [28].
 Lá cây hồng xiêm chứa steroid, triterpenoid, terpenoid, phenol, coumarin,
tanin, glycosid tim, saponin, anthraquinon [26], flavonoid (apigenin-7-O-α-L-
rhamnosid, myricetin-3-O-α-L-rhamnosid [24]), acid béo trong đó acid béo không
no chiếm 32,32% (thành phần chính là: acid oleic 13,95%, acid linoleidic 10,18%
và acid linoleic 5,96%) [17], [24], acid oleanolic, lupeol acetat [17]), acid béo no
chiếm 59,95% (acid palmitic 48,01%, acid stearic 8,3%), hydrocarbon chiếm
89,303% các hợp chất không xà phòng hóa, thành phần chính n-Triacontan 49,50%
và n-octacosan 23,83%, 2 sterol (sitosterol 3,40%, stigmasterol 2,61%) [24].
 Vỏ cây chứa 11,8% chất tanin [14], [17], [20], saponin và một lượng nhỏ
alkaloid kết tinh gọi là sapotin [5] và chất nhựa mủ. Nhựa mủ khi cô đặc, khối
lượng giảm còn 30-33%, có màu trắng sau chuyển thành màu đỏ hồng. Nhựa mủ
chứa 44,8% chất nhựa, 17,2% carbohydrat, 3,4% chất gôm và 9% đường. Khi tinh
chế chất nhựa mủ bằng cách rửa nhiều lần với kiềm mạnh, sau đó trung hòa và sấy
khô, sẽ thu được một chất bột vô định hình, không tan trong nước [14].
 Quả chứa carbohydrat, protein, chất béo, canxi, phosphor, sắt, acid ascorbic,
fructose 4,47-7,13%, sucrose 1,48-8,75%, tổng số đường 11,14-20,43%, tinh bột
2,98%, tanin 3,16-6,45% [17], [24], [29], polyphenols (methyl chlorogentat,
5

dihydromyricetin, quercitrin, myricitrin, catechin, epicatechin, gallocatechin, gallic
acid) [22].
 Qủa hồng xiêm còn xanh và vỏ thân chứa chất dịch sữa, trong đó gôm chiếm
20-25% và nhiều tanin [14], [17]. Quả chín chứa 14% đường mà thành phần chủ
yếu là sacharose, dextrose và levulose [17].
 Hạt chứa 1% saponin và 0,08% sapotinin [14], [17], dầu béo và acid
cyanhydric [14], alkaloid, phenol (Quercitol [20], [21]), flavonoid [27].
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC
 Hoạt tính kháng khuẩn:
 Vỏ thân và lá: Dịch chiết ethanol, methanol và nước có hoạt tính kháng

khuẩn với 4 gram (+) (Bacillus subtilis BTCC19, Bacillus megaterium BTCC18,
Bacillus cereus ATCC258 and Sarcina lutea ATCC27803), 5 gram (-) (Escherichia
coli ATCC25922, Shigella sonnei ATTC8992, Shigella shiga ATCC27853, Shigella
dysenteriae ATCC561 and Salmonella typhi ATCC14228 và 5 chủng nấm
(Aspergillus flavus ACCT10558, Aspergillus fumigatus ATTC10231, Candida
albicans ATTC25889, Vasianfactum sp ATTC235561, Fusarium sp ACCT56390)
[21], [25], [28].
Dịch chiết methanol, ethanol có hoạt tính mạnh hơn dịch chiết nước [25], [28].
 Hạt: Dịch chiết aceton có hoạt tính kháng khuẩn với Vibrio cholerae MTCC
3906, Salmonella paratyphi A, Shigella flexneri MTCC 1457, Staphylococcus
epidermidis MTCC 435 [25], [28].
 Hạ đường huyết:
Dịch chiết nước và cồn của lá cây hồng xiêm giảm đáng kể nồng độ đường
trong máu so với tác dụng của metformin. Tuy nhiên dịch chiết không thay đổi đáng
kể nồng độ đường trong máu của những con chuột bình thường. Cơ chế hoạt động
có thể tương tự của biguanid (metformin) [24], [28].
 Hạ cholesterol:
Dịch chiết nước và dịch chiết cồn lá làm giảm đáng kể mức độ cholesterol trong
máu chuột gần với atorvastatin [24].
6

 Tác dụng chống oxy hóa:
 Dịch chiết ethanol, methanol, aceton và nước từ lá có tác dụng chống oxy
hóa trên chuột. Trong đó dịch chiết methanol tác dụng yếu, dịch chiết aceton có tác
dụng chống oxy hóa mạnh [16].
 Dịch chiết methanol, aceton, ethanol, ethyl acetat, nước của hạt hồng xiêm
có tác dụng chống oxy hóa, trong đó dịch chiết cồn có tác dụng mạnh hơn ở cùng
nồng độ [19]. Tác dụng chống oxy hóa của cây hồng xiêm chủ yếu do polyphenolic
[16] (gallocatechin, catechin) [28].
 Tác dụng diệt giun sán:

Dịch chiết ethanol và chloroform phôi hạt hồng xiêm có tác dụng làm tê liệt và
diệt giun sán (sau 8 và 23 phút với dịch chiết chloroform, sau 3,3 và 7 phút với dịch
chiết ethanol (12,5 mg/ml) [24].
 Tác dụng giảm đau :
Dịch chiết methanol và ether dầu hỏa lá cây hồng xiêm với liều 200mg/kg có tác
dụng giảm đau 96,82% và 94,27% trên chuột [28], có ý nghĩa thống kê (p˂0,001) so
với nhóm chứng [23].
 Độc tính
LD50 của dịch chiết nước và cồn lá hồng xiêm là 8g/kg [24].
Liều hiệu quả tối thiểu 8mg/kg cân nặng theo đường tiêm dưới da và 16mg/kg
cân nặng theo đường uống [24].
1.4. TÍNH VỊ, CÔNG NĂNG
Quả hồng xiêm chín có vị ngọt, tính mát, có tác dụng bổ, mát, sinh tân dịch, giải
khát, nhuận tràng [14].
Quả xanh có vị chát, tính bình, có tác dụng làm săn [14].





7

1.5. CÔNG DỤNG
Hồng xiêm hiện nay chủ yếu được trồng để lấy quả ăn. Những công dụng khác
hầu như chưa được chú ý.
 Quả hồng xiêm chín trị táo bón, mỗi lần ăn 3-5 qủa. Quả xanh và vỏ cây trị
tiêu chảy, kiết lỵ [14], [17] với liều 15-20g, sắc uống [14]. Hạt là thuốc lợi tiểu [16],
hạ sốt, mỗi lần 6 hạt nghiền thành bột, uống với rượu [14], [19], [25], chữa mất ngủ
[17]. Liều cao gây độc và khó đái [14].
 Vỏ cây có tác dụng kháng khuẩn, làm se, giải nhiệt và chữa tiêu chảy [25],

[11], [19], [28], [16], ngày uống 6 đến 12g [11].
 Nhựa chiết từ cây hồng xiêm có tên là chicle được dùng nhiều trong công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Nhựa lấy từ vỏ cây được gọi là chicle covent,
nhựa thu từ quả gọi là chicle blanco hay chicle vergen. Nhựa này tiêu thụ rất nhiều
ở Mỹ, Canada để chế tạo cao su [14], [17], dùng trong phẫu thuật nha khoa [28].
Chất nhựa được dùng làm kẹo bạc hà, kẹo hồi [11] có khi được thêm chất pepsin
với tên chewing gum, dùng làm thuốc chữa ho, giúp tiêu hóa hoặc làm thơm miệng
[11], [28].
 Lá sắc uống hàng ngày để giảm huyết áp [17], chữa ho, cảm lạnh, tiêu chảy
[16].











8

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
 Mẫu nghiên cứu
Mẫu tươi: Lá cây tươi rửa sạch, dùng làm vi phẫu và nghiên cứu đặc điểm thực vật.
Mẫu khô: Lá cây hồng xiêm sau khi làm sạch, được sấy khô ở nhiệt độ dưới 60˚C:

- Tán thành bột mịn dùng để soi bột.
- Xay thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo dùng để nghiên
cứu hóa học và thử tác dụng kháng khuẩn.
 Nơi thu hái: Thanh Chương – Nghệ An.
 Thời điểm thu hái: 11/2013.
 Mẫu dược liệu được TS. Nguyễn Quốc Huy – Bộ môn thực vật – Trường ĐH
Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Manilkara zapota (L.) P. Royen, họ
Hồng xiêm (Sapotaceae).
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
 Tủ sấy dược liệu SHELLAB.
 Máy xác định độ ẩm SATORIUS.
 Cân kỹ thuật Satorious.
 Cân phân tích Precisa.
 Máy đo phổ tử ngoại UV-VIS Spectrophotometer carry.
 Kính hiển vi Labomed.
 Hệ thống máy chấm sắc ký: thiết bị bơm mẫu tự động (CAMAG-
LIMONAT5), máy nén khí, phần mềm winCATS, videoSCAN.
 Máy ảnh Sony 12.1.
 Máy sấy Blustone.
 Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI Rotavapor R-200.
9

 Hóa chất và dụng cụ
 Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu được mua tại Hà Nội, đạt
tiêu chuẩn tinh khiết phân tích theo Dược Điển Việt Nam IV [9].
 Hóa chất: Javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ carmin…
 Dung môi hữu cơ: Chloroform, methanol, ethanol, ethyl acetat, n-hexan,
toluen, acid formic…
 Thuốc thử: Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký.

 Bản mỏng tráng sẵn silica gel GF
254
của Merck.
 Dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh và các bộ dụng cụ khác dùng trong phòng thí
nghiệm như: cốc có mỏ, bình nón, đũa thủy tinh, chày, cối, lam kính, ống nghiệm
…
 Môi trường dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn
 MT canh thang nuôi cấy VSV kiểm định: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt
0,3%, nước vđ 100ml.
 MT thạch thường: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt, thạch 1,6%, nước vđ
100ml.
 Chủng vi sinh vật
10 chủng vi sinh vật (5 gram (+), 5 gram (-)) đạt tiêu chuẩn được lấy ở bộ môn Vi
sinh-Sinh học trường đại học Dược Hà Nội.
Nhóm gram (+):
- Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)
- Bacillus subtilis ACTT 6633 (Bs)
- Bacillus cereus ACTT 9341 (Bc)
- Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)
- Sarcina lutea ATCC 9341 (SL)
Nhóm gram (-):
- Escherichia coli ATCC 25922 (EC)
- Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu)
- Salmonella typhi DT 220 (Sal)
10

- Shighella flexneri DT 112 (Shi)
- Proteus mirabilis BV 108 (Pro)
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

 Nghiên cứu đặc điểm bột và vi phẫu lá hồng xiêm.
 Mô tả đặc điểm dược liệu lá hồng xiêm.
2.2.2. Nghiên cứu về hóa học
 Định tính các nhóm chất chính trong lá cây hồng xiêm bằng phản ứng hóa
học.
 Chiết phân đoạn, xác định hàm lượng các phân đoạn và định tính các phân
đoạn dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng.
 Định hướng phân lập chất sạch bằng sắc ký cột.
2.2.3. Thử tác dụng kháng khuẩn
 Thử tác dụng kháng khuẩn của 3 loại cao lỏng cồn ở 3 nồng độ 1:1, 1:2, 1:4.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
 Nghiên cứu đặc điểm hình thái:
Quan sát, chụp ảnh, mô tả đặc điểm lá.
 Nghiên cứu đặc điểm vi học:
- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và bột lá theo tài liệu: [3], [4], [12].
- Quan sát cấu tạo vi phẫu lá và bột lá bằng kính hiển vi.
- Chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh.
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu bằng các phản ứng
hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng theo tài liệu: [2], [3], [7], [10].
- Phân lập các chất bằng sắc ký cột theo tài liệu [3].



11

2.3.3. Thử tác dụng kháng khuẩn
Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng cồn 1:1, 1:2, 1:4 với các
chủng vi khuẩn Gram (+), Gram (-) theo phương pháp khuếch tán trong môi trường

thạch (dùng khoanh giấy tẩm dd thử) [13].
 Nguyên tắc: Mẫu thử được tẩm vào khoanh giấy lọc vô trùng, đặt lên trên
lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp.
Hoạt chất từ trong mẫu thử khuếch tán vào MT thạch và ức chế sự phát triển
của VSV kiểm định, tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh mẫu thử. Đo
đường kình vòng vô khuẩn (nếu có) để đánh giá kết quả.
 Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá
theo công thức :


=





SD=

 








Trong đó: 

: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn.

D
i
: Đường kính vòng vô khuẩn.
SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
n: Số thí nghiệm làm song song (n=3).

Hình 2.1. Sơ đồ đặt khoanh giấy tẩm mẫu thử trên thạch.
Chú thích: 1: Mẫu cao lỏng 1:1
2: Mẫu cao lỏng 1:2
3: Mẫu cao lỏng 1:4
C: Kháng sinh chuẩn
12

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA

3.1. NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT
3.1.1. Đặc điểm dược liệu lá cây hồng xiêm

Hình 3.1. Ảnh chụp lá cây hồng xiêm
Lá hình trái xoan, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài từ 5 cm đến 13 cm. Phiến
lá nguyên, dày, mép nguyên. Mặt trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt. Cuống lá nhẵn,
dài 4-15 mm. Gân phụ nhiều, xếp song song, đều đặn, cách nhau 4-5 mm. Thể chất
dai. Không mùi, vị chát, hơi đắng.
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá
- Phần gân lá: Gân lá hai mặt lồi, mặt trên lồi ít, mặt dưới lồi nhiều. Biểu bì trên
(11) và biểu bì dưới (1) gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn, hóa cutin. Mô
dày (2) gồm 5-6 hàng tế bào hình trứng, thành dày. Mô mềm vỏ (3) gồm các tế bào
thành mỏng, hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Vòng bó sợi chứa
các tinh thể canxi oxalat (4) hình khối, bao quanh bó libe-gỗ. Libe-gỗ tạo thành bó
hình cung, libe (5) ở ngoài, gỗ (6) ở trong, các mạch gỗ xếp thành hàng đều đặn.

Mô mềm ruột (7) gồm các tế bào thành mỏng, không đều, xếp lộn xộn bên trong bó
libe-gỗ (Hình 3.2.b).
- Phần phiến lá: Biểu bì trên (11), biểu bì dưới (8) gồm các tế bào nhỏ xếp đều
đặn thành 1-2 hàng. Mô dậu (10) gồm 1-2 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vuông
góc với các hàng tế bào biểu bì. Mô khuyết nằm rải rác trong phiến lá (9) (Hình
3.2.a).

13

3.1.3. Đặc điểm bột lá
Bột màu xanh lục, không mùi, vị đắng. Soi dưới kính hiển vi (Hình 3.3) thấy có
các đặc điểm:
Tinh thể canxi oxalat hình khối (1), mảnh biểu bì (2), mảnh mạch dẫn (3), bó sợi
(4), mảnh mô mềm (5), mảnh mang màu (6), mảnh biểu bì mang lỗ khí kiểu song
bào (7), mảnh mạch dẫn chứa tinh thể canxi oxalat (8) .


Hình 3.2. Ảnh chụp vi phẫu lá cây hồng xiêm dưới KHV
Ghi chú : a. Phiến lá: 8. Biểu bì dưới 10. Mô dậu
9. Mô khuyết 11. Biểu bì trên
b. Gân lá: 1. Biểu bì dưới 5. Libe
2. Mô dày 6. Gỗ
3. Mô mềm vỏ 7. Mô mềm ruột
4. Bó sợi chứa tinh thể


14


Hình 3.3. Ảnh chụp một số đặc điểm bột lá cây hồng xiêm

Ghi chú: 1. Tinh thể canxi oxalat hình khối 5. Mảnh mô mềm
2. Mảnh biểu bì 6. Mảnh mang màu
3. Mảnh mạch dẫn 7. Mảnh biểu bì mang lỗ khí
4. Bó sợi 8. Bó sợi chứa tinh thể canxi oxalat
3.2. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC
3.2.1. Định tính các nhóm chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học
3.2.1.1. Định tính flavonoid
Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50ml ethanol 90˚. Đun
cách thủy 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Cô dịch lọc tới cắn (1), hòa tan cắn vào
nước nóng, lọc nóng. Cô dịch nước tới cắn (2), hòa tan cắn vào cồn 90˚ lấy dịch làm
các phản ứng sau:
 Phản ứng Cyanidin
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử. Thêm một ít bột magnesi kim loại
(khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút. Quan sát
thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ thẫm → Phản ứng dương tính.


15

 Phản ứng với kiềm loãng
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử. Thêm vài giọt dung dịch NaOH
10%. Quan sát thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng
của dung dịch sẽ được tăng thêm → Phản ứng dương tính.
 Phản ứng với hơi amoniac (NH
3
)
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac lỏng đã
được mở nút, quan sát thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một
giọt khác làm chứng → Phản ứng dương tính.
 Phản ứng với FeCl

3
5%
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dung dịch thử. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%,
quan sát thấy xuất hiện tủa màu xanh đen → Phản ứng dương tính.
 Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dung dịch thử vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%,
thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng nhẹ. Quan sát thấy xuất
hiện màu vàng cam → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa flavonoid.
3.2.1.2. Định tính coumarin
 Vi thăng hoa
Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng nhôm. Đặt lên bếp điện có lưới amian,
cho bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính,
trên đó có đặt ít bông tẩm nước lạnh. Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy phiến
kính ra, để nguội, đặt lam kính lên, soi dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim
không màu. Nhỏ thêm 1 giọt dd KI 10% lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi thấy
tinh thể hình kim màu tím → Phản ứng dương tính.
 Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol
90%. Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc thu được dùng để tiến
hành các phản ứng sau:
 Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1-2 ml dịch chiết ethanol.
16

+ Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%.
+ Ống 2: Để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm trên nồi cách thủy vài phút, quan sát thấy:
+ Ống 1: Xuất hiện tủa đục.
+ Ống 2: Trong suốt.
Thêm vào 2 ống nghiệm 2ml nước cất, lắc đều thấy:

+ Ống 1: Trở lại trong suốt.
+ Ống 2: Thấy xuất hiện tủa đục.
Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đặc thấy ống 1 đục trở lại → Phản ứng dương tính.
 Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans:
Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, nhỏ tiếp 1 giọt dung dịch NaOH 10%, sấy
nhẹ cho đến khô. Che 1 nửa diện tích bằng một mảnh kim loại, soi dưới đèn tử
ngoại trong vài phút, bỏ mảnh kim loại ra. Quan sát thấy phần không bị che sáng
hơn phần bị che → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa coumarin.
3.2.1.3. Định tính Glycosid tim
Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 25%,
lắc đều, ngâm qua đêm. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc
qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu
tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc,
thêm 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại. Tiếp tục thử đến khi
dịch chiết không còn tủa với chì acetat nữa. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn
125 ml. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp chloroform - ethanol (4:1), mỗi lần 8ml. Gạn lớp
chloroform vào một cốc có mỏ dung tích 100ml đã được sấy khô. Gộp dịch chiết
chloroform lại. Cho dịch chiết vào 3 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách
thủy đến cắn. Cắn thu được để làm các phản ứng:



17

 Phản ứng Liebermann – Burchard
Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn, để ống
nghiêng 45
0
, cho từ từ theo thành ống 0,5ml H

2
SO
4
đặc, để dịch trong ống nghiệm
chia thành 2 lớp.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, chất
lỏng phía dưới màu hồng, phía trên màu xanh lá → Phản ứng dương tính.
 Phản ứng Baljet
Chuẩn bị thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm 1 phần dd acid picric 1% và 9
phần dd NaOH 10%, lắc đều.
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ
từng giọt TT Baljet mới pha.
Kết quả: Thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ cam → Phản ứng dương tính.
 Phản ứng Keller – Kiliani
Cho vào ống nghiệm 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, thêm vài giọt
dd FeCl
3
5% trong acid acetic, lắc đều, nghiêng ống 45
0
, thêm từ từ theo thành ống
0,5ml H
2
SO
4
đặc.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp
chất lỏng trên có màu xanh lá → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu chứa glycosid tim.
3.2.1.4. Định tính Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm

5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng. Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước,
lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm. Để yên 15 phút, quan sát thấy bọt
bền vững sau hơn 15 phút → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa saponin.
3.2.1.5. Định tính Alcaloid
Cho khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu
bằng dd NH
3
6M. Đậy kín bình trong vòng 30 phút. Chiết hồi lưu chloroform trong
30 phút, lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Lắc dịch chiết 2 lần với dd H
2
SO
4
1N
18

(mỗi lần 5ml). Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ,
mỗi ống 1ml, để tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng với TT Mayer: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất
hiện tủa trắng → Phản ứng âm tính.
 Phản ứng với TT Dragendroff: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendroff, không
thấy xuất hiện tủa da cam → Phản ứng âm tính.
 Phản ứng với TT Bouchardat: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không
thấy xuất hiện tủa nâu đỏ → Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có alcaloid.
3.2.1.6. Định tính tanin
Chuẩn bị mẫu thử: Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 2g bột dược liệu,
thêm 20ml nước cất, đun sôi trên bếp qua lưới amian trong khoảng 10 phút. Lọc
nóng qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc làm các phản ứng.

Tiến hành phản ứng: Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch lọc.
+ Ống 1: Thêm 2 giọt FeCl
3
5%, xuất hiện tủa màu xanh đen → Phản ứng dương
tính.
+ Ống 2: Thêm 2 giọt chì acetat 10%, không xuất hiện tủa bông → Phản ứng âm
tính.
+ Ống 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%, xuất hiện tủa trắng đục → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có tanin.
3.2.1.7. Định tính đường khử
Chuẩn bị mẫu thử: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước
cất, đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc tiến hành phản
ứng.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc, 3 ml dd Fehling A (TT) và 3 ml
dd Fehling B (TT), lắc kỹ, đun cách thủy vài phút thấy xuất hiện kết tủa đỏ gạch →
Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu chứa đường khử.

19

3.2.1.8. Định tính anthranoid
 Phản ứng Borntrager:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml dd H
2
SO
4
10%.
Đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lọc nóng vào bình gạn. Để nguội, lắc với 5ml
chloroform, để yên phân lớp, gạn lấy lớp chloroform để tiến hành phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1ml NaOH 10% vào lắc nhẹ,

không thấy lớp nước có màu hồng → Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có anthranoid.
3.2.1.9. Định tính acid hữu cơ
Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực
tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc. Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống
nghiệm to. Thêm một ít Na
2
CO
3
vào dịch lọc, lắc nhẹ, không có bọt khí → Phản
ứng âm tính
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không chứa acid hữu cơ.
3.2.1.10. Định tính polysaccharid
Lấy 2g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 10ml nước cất, đun sôi cách thủy
trong 5 phút, lọc nóng lấy dịch lọc. Cho vào 2 ống nghiệm:
 Ống 1: 2ml dịch lọc và 2 giọt TT Lugol.
 Ống 2: 2ml nước cất và 2 giọt TT Lugol.
Quan sát thấy hai ống có màu như nhau → Phản ứng âm tính
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có polysaccharid.
3.2.1.11. Định tính acid amin
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực
tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc. Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc
và 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 10 phút, xuất hiện màu tím →
Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có acid amin.


20

3.2.1.12. Định tính chất béo, caroten, sterol

Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, đun
cách thủy 15 phút. Lọc lấy dịch lọc làm phản ứng.
 Định tính chất béo
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi, thấy để lại
vết mờ trên giấy lọc → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chất béo.
 Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết trên, bốc hơi dung môi đến khô, thêm vào
ống nghiệm 1ml anhydrid acetic. Lắc kỹ rồi để nghiêng ống nghiệm 45
0
, thêm 1 ml
H
2
SO
4
đặc theo thành ống nghiệm, mặt phân cách có màu đỏ nâu → Phản ứng
dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có sterol.
 Định tính caroten:
Cho vào ống nghiệm to 2ml dịch chiết trên, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn,
thêm vài giọt H
2
SO
4
đặc vào cắn, dịch lỏng có màu xanh → Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có caroten.
Kết quả định tính các nhóm chất trong dịch chiết toàn phần lá cây hồng xiêm được
trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây hồng xiêm.
STT

Nhóm chất
Phản ứng định tính
Kết
quả
Kết luận
1
Flavonoid
- Phản ứng cyanidin
- Phản ứng với FeCl
3
5%
- Phản ứng với NaOH 10%
- Phản ứng với hơi NH
3

- Phản ứng diazo hóa
+
+
+
+
+
Có
2
Coumarin
- Phản ứng mở đóng vòng lacton
- PU chuyển dạng đồng phân cis - trans
+
+
Có