Nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ streptomyces 183 221

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TẠ THỊ KHUYÊN

NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC
SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES
183.221

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI- 201




BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




TẠ THỊ KHUYÊN


NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ĐƯỢC

SINH TỔNG HỢP TỪ STREPTOMYCES
183.221
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học





HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo, PGS.TS
Cao Văn Thu- người đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu tiên nghiên cứu
khoa học tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng
dạy công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược trường Đại
học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học
tự nhiên Hà Nội; Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô
giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện khóa luận này.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa

luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ thầy
cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!


Hà Nội, tháng 05 năm 2014.
Sinh viên

TẠ THỊ KHUYÊN






MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3
1.1.4 . Ứng dụng của kháng sinh 3
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN ( Actinomycetes) 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước 4
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn 4
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 5
1.2.4. Phân loại Streptomyces 6
1.2.5. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 6

1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT 7
1.3.1. Mục đích 7
1.3.2. Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 7
1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 9
1.4.1. Khái niệm lên men 9
1.4.2. Phương pháp lên men 9
1.5. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ 10
1.5.1. Chiết xuất kháng sinh ( Chiết lỏng- lỏng) 10


1.5.2. Tách và tinh chế kháng sinh 11
1.6. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH 12
1.6.1. Phổ hồng ngoại 12
1.6.2. Phổ UV-VIS 12
1.6.3. Phổ khối 12
1.7. Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến kháng sinh, Streptomyces sp. 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. ĐỐI TƯỢNG 15
2.1.1. Giống vi sinh vật 15
2.1.2. Các môi trường nuôi cấy 15
2.1.3. Dụng cụ và hóa chất 18
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 19
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống 19
2.2.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 20
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21
2.2.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 22
2.2.5 . Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên 22
2.2.6. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 22
2.2.7. Lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men 23
2.2.8. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 24

2.2.9. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào 24
2.2.10. Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh 24
2.2.11. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 25
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 27


3.1 NGHIÊN CỨU TÊN KHOA HỌC CỦA STREPTOMYCES 183.221 27
3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES
183.221 TRÊN MT PHÂN LẬP- MT 2 28
3.3. KẾT QUẢ CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 28
3.4. KẾT QUẢ CẢI TẠO GIỐNG 29
3.4.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 29
3.4.2. Kết quả đột biến 30
3.5. KẾT QUẢ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 31
3.5.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất 31
3.5.2. Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất 32
3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN ĐỘ BỀN VỮNG KHÁNG
SINH 33
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 33
3.6.2. Ảnh hưởng của pH 33
3.7. KẾT QUẢ CHỌN DUNG MÔI VÀ pH CHIẾT 34
3.8. KẾT QUẢ TÁCH KHÁNG SINH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 35
3.9. KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ CỘT 36
3.10. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM 39
3.11. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA KHÁNG SINH 40
3.11.1. Nhiệt độ nóng chảy của K1 40
3.11.2. Phổ UV của chất K1 40
3.11.3. Phổ IR 40
3.11.4. Phổ MS 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN Acid 2’-deoxyribonucleic
CW Thành tế bào - Cell wall
D

Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn, vô nấm
DD Dung dịch
DMHC Dung môi hữu cơ
G(+) Gram dương
G(-) Gram âm
IR Infrared ( hồng ngoại )
ISP International Streptomyces Project ( Chương trình Streptomyces Quốc
tế )
KS Kháng sinh
L-DAP L – diaminopimelat
MS Mass Spectrometry (phổ khối )
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
NST Nhiễm sắc thể
RF Rectiflexibile ( thẳng hơi cong)
s Sai số thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh

SKLM Sắc ký lớp mỏng
UV Utra Violet ( tử ngoại )
VSV Vi sinh vật
V Thể tích
VL Vi lượng
B. subtilis Bacillus subtilis
P. mirabilis Proteus mirabilis



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. 1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 7
Bảng 2. 1. Các chủng vi khuẩn kiểm định 15
Bảng 2. 2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 15
Bảng 2. 3. Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 17
Bảng 2. 4. Môi trường phân loại xạ khuẩn theo ISP 17
Bảng 2. 5. Các dung môi sử dụng 18
Bảng 3. 1. Đặc điểm theo ISP của Streptomyces 183.221 và Streptomyces
flavescens 27
Bảng 3. 2. Kết quả hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.221 trên MT2. 28
Bảng 3. 3. Kết quả lựa chọn MT nuôi cấy 28
Bảng 3. 4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên. 29
Bảng 3. 5. Kết quả đột biến lần 1 30
Bảng 3. 6. Kết quả đột biến lần2 31
Bảng 3. 7. Kết quả chọn dạng chủng, biến chủng lên men 32
Bảng 3. 8. Độ bền vững của kháng sinh với nhiệt độ 33
Bảng 3. 9. Ảnh hưởng của pH tới độ bền vững kháng sinh 33
Bảng 3. 10. Kết quả lựa chọn dung môi và pH chiết kháng sinh. 34
Bảng 3. 11. Chiết kháng sinh bằng Ethylacetat ở pH= 7, chiết lặp 2 lần 35

Bảng 3. 12. Kết quả SKLM lựa chọn hệ dung môi 36
Bảng 3. 13. Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1 37
Bảng 3.14. Kết quả SKLM các phân đoạn 1- 12 37
Bảng 3. 15. Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy cột lần 2 38
Bảng 3. 16. SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2 38
Bảng 3.17. Kết quả chạy cột lần 3 39
Bảng 3. 18. Kết quả R
f
của các chất thu được 39
Bảng 3. 19. Khối lượng và hiệu suất kết tinh 39




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Kết quả chọn MT lên men.
Hình P1: Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn.
Hình P2: Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn.
Hình P3: Đường cong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
Hình P4: Hình ảnh chuỗi bào tử Streptomyces 183.221.
Hình P5: Hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử Streptomyces 183.221.
Hình P6: Kết quả đột biến lần 1.
Hình P7: Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến 2.
Hình P8: Kết quả lựa chọn MTdt lên men.
Hình P9: Hình ảnh bình nhân giống cấp 1 trong lên men chọn chủng.
Hình P10: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn chạy cột sắc ký lần 1.
Hình P11: Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn chạy cột sắc ký lần 2.
Hình P12: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh.
Hình P13: Phổ UV.

Hình P14: Phổ khối.
HìnhP15: Phổ I
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm
Penicilium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Năm 1938,
Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị.
Thị trường chất kháng sinh trên thế giới phát triển và tăng mạnh trong những
năm gần đây cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh trong nền
kinh tế quốc dân. Đồng thời sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng
thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt
với “kỷ nguyên hậu kháng sinh” (post antibiotic era). Chính vì thế nhiệm vụ đặt
ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các kháng sinh
cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển
(R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn toàn. Vì
vậy Công nghiệp kháng sinh đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học
thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.
Để góp phần vào công cuộc tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề tài :
“Nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183.221”
với mục tiêu:
 Phân loại định tên khoa học Streptomyces 183.221 theo ISP.
 Cải tạo giống nâng cao khả năng tổng hợp KS của Streptomyces 183.221.
 Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS do Streptomyces 183.221 tổng
hợp.
 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh chế.



2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [1], [4] [7]
Có nhiều định nghĩa khác nhau về KS. Hiện nay, giới y học quan niệm rằng:
KS là những chất tạo thành do chuyển hóa sinh học, có tác dụng kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) ở nồng độ
thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các KS tự nhiên.
1.1.2. Phân loại kháng sinh [1], [4], [7], [12]
a. Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Có thể phân các KS thành: KS diệt khuẩn, KS kìm khuẩn…
b. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh
Dựa vào cơ chế tác dụng, chia thành các nhóm:
 Thuốc ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: β – lactam, vancomycin,…
 Thuốc ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của VK: cloramphenicol,
tetracycllin, macrolid,…
 Thuốc ức chế tổng hợp acid nhân: quinolon, rifampicin.
 Thuốc ức chế chuyển hoá: Co-trimoxazol
 Thuốc làm thay đổi tính thấm của màng tế bào: polymycin, amphotericin.
c. Dựa vào cấu trúc hóa học
Dựa vào cấu trúc hóa học, kháng sinh chia thành các nhóm chính sau:
 Nhóm β – lactam
- Penicillin: Benzylpenicillin, oxacilin, ampicillin…
- Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor,…
- Các β–lactam khác: carbapenem, chất ức chế β – lactamase.
 Nhóm aminoglycosid ( aminosid ): streptomycin, gentamicin…
 Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin,…
 Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin,…
 Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol,…
3

 Nhóm tetracycllin: tetracyclin, doxycyclin,…
 Nhóm peptid:
- Glucopeptid: Vancomycin.
- Polypeptid: polymycin, bacitracin.
 Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin,…
 Nhóm co-trimoxazol: Co-trimoxazol.
Ngoài ra KS có thể được phân loại theo dược động học – dược lực học và
theo nguồn gốc.
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [1], [4], [5]
 Ức chế tổng hợp vách tế bào VK.
 Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK.
 Ức chế tổng hợp acid nucleic.
 Thay đổi tính thấm của màng sinh chất.
 Kháng chuyển hóa ( ức chế tổng hợp acid folic).
1.1.4 . Ứng dụng của kháng sinh [10], [12], [14]
1.1.4.1. Trong y học
Ngày nay có nhiều KS được phát hiện và được ứng dụng có hiệu quả trong y
học. KS không chỉ sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ( nhiễm
khuẩn hô hấp, tiết niệu,…) mà còn được dùng để điều trị các loại bệnh phổ biến do
nấm gây ra ( nấm da, nấm tóc,…), bệnh ung thư ( ung thư vú, phổi, dạ dày,…).
1.1.4.2. Trong nông nghiệp
 Trong chăn nuôi
KS được sử dụng để phòng, điều trị các bệnh cho động vật (bệnh viêm phổi
cấp tính, viêm vú của trâu bò,…) và được dùng như một chất kích thích tăng trọng
đàn gia súc, gia cầm. Ngoài ra, KS còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác
dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của VK, đặc biệt là VK gây bệnh đường tiêu
hóa và hô hấp.

4

 Trong trồng trọt
Việc sử dụng KS để bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả kinh tế cao, khắc phục
được nhược điểm của các thuốc hóa học ( hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, ô
nhiễm MT, chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể gây độc cho con người,…).
1.1.4.3. Trong công nghiệp thực phẩm
Một số KS là những chất bảo quản thực phẩm tươi và đóng hộp lý tưởng,
như: nisin, subtilin, clotetracyclin,…với ưu điểm: Thời gian khử trùng bằng nhiệt
ngắn đi, nhiệt độ khử trùng giảm. Nồng độ KS rất thấp, bảo quản được lâu dài, chất
lượng tốt hơn, vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi.
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN

( Actinomycetes) [5]
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, là các VK Gr(+), có tỷ lệ G+C >55%.
Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước [5], [6], [11]
 Khuẩn ty: Khuẩn ty của xạ khuẩn thường không có vách ngăn và không
tự đứt đoạn, đường kính 0,3 –2 µm. Màu sắc của khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú:
màu trắng, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen, Hệ sợi của VK chia thành khuẩn ty cơ chất
và khuẩn ty khí sinh (Hình P1- phụ lục ).
 Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm
nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường,
sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh.
 Khuẩn ty khí sinh: Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì
dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh.
Sự phát triển của khuẩn ty ở xạ khuẩn được giới thiệu ở hình P2- phụ lục.
 Khuẩn lạc xạ khuẩn:
Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn.
Đặc điểm: Không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp, dạng phấn,
không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc đường tròn đồng

tâm,… Kích thước khuẩn lạc khác nhau tùy thuộc từng loài và điều kiện nuôi cấy.
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn [5], [16]
5

 Thành tế bào xạ khuẩn: Có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20nm. Có
chức năng bảo vệ tế bào và giữ hình dáng của khuẩn ty. Ngoài ra thành tế bào xạ
khuẩn có thể cho nhiều chất ( kháng sinh, acid amin,…) đi qua dễ dàng. Các chất
dinh dưỡng từ MT cũng được thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào.
Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào chia làm 4 loại: Nhóm CW I
(chứa L-DAP ( L-diaminopimelat), glycin), chi Streptomyces thuộc nhóm này;
nhóm CW II (chứa meso- DAP, glycin); nhóm CW III (chứa meso- DAP); nhóm
CW IV (chứa meso- DAP, arabinose và galactose).
 Màng tế bào chất: Dày khoảng 7,5-10nm. Thành phần chính là protein và
phospholipid. Chức năng: Là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan trong nước, là
nơi mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp.
 Vùng nhân: Chưa có nhân điển hình, nhiễm sắc thể có quy mô lớn nhất
trong các Prokaryote (1,3
.
10
7
bp).
 Mesosom: Nằm phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng,…
 Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất gồm: hạt phosphat, hạt
polysarcharid.
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces [5], [6], [8], [22]
 Đặc điểm hình thái
Đối với các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, sau một thời gian phát triển,
trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể mọc
đơn, mọc vòng và có nhiều hình thái cơ bản: thẳng, uốn cong, xoắn lò xo,…Bào tử
trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn, có nhiều hình dạng như: hình cầu,

hình bầu dục, hình trụ,…Bề mặt của bào tử trần có thể là trơn nhẵn (sm), sần sùi
da cóc (wa) , có gai (sp) hoặc có tóc (ha).
Bào tử trần được hình thành theo hai phương thức khác nhau:
- Vách ngăn được hình thành từ bên trong của CM và tiến dần vào trong
tạo thành những vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó chuỗi bào tử mới được phân
cách thành các bào tử trần.
6

- Thành tế bào và CM đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào phía
trong, làm cho sợi tiền chuỗi bào tử phân cách tạo thành chuỗi bào tử trần.
Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố
của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh và sắc tố melanoid.
 Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng
Streptomyces lthuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tối thích
22- 32
o
C, một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn ( xạ khuẩn ưa nhiệt hoặc
ưa lạnh); pH tối thích 6,5- 7,5.
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và nguồn năng
lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột. Ngoài ra
chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit.
1.2.4. Phân loại Streptomyces [5], [8]
Tại hội nghị “Vi sinh vật thế giới lần X” tổ chức tại Mexico năm 1970 chọn
khóa phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khóa phân loại chính để phân loại
chi Streptomyces và đặt tên quốc tế là International Streptomyces Project ( ISP).
Khóa phân loại dựa vào các đặc điểm:
 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: Màu sắc của khuẩn ty cơ chất,
khuẩn ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
 Đặc điểm sinh lý học: Khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và

khả năng sử dụng các nguồn đường.
1.2.5. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn [6], [11]
Đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành KS, 60-70% xạ
khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh KS. KS là sản phẩm trao đổi thứ cấp
của VSV. Có nhiều giả thiết khác nhau về sự hình thành chất KS từ xạ khuẩn. Có 3
con đường sinh tổng hợp KS ở xạ khuẩn:
 KS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, qua 1 chuỗi phản ứng
enzym.
 KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.
7

 KS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I, sau đó
tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều KS có
cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau. Bảng 1.1 giới thiệu một số
chất KS có nguồn gốc từ xạ khuẩn.
Bảng 1. 1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Kháng sinh Nguồn gốc Phổ tác dụng
Streptomycin S. griceus Gr (+) , Gr(-)
Tetracyclin
S. aureofaciens Gr(+) , Gr(-)
Erythromycin
S. erythraea Gr(+)
Gentamycin
M. purpurea Gr(+) , Gr(-)
Cloramphenicol
S. venezuelae Gr(+) , Gr(-)
Daunorubicin
Str. peucetius Ung thư
Nystatin

S. noursei Nấm

1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT
1.3.1. Mục đích [7], [13]
Để áp dụng trong sản xuất công nghiệp, việc cải tạo giống VSV bằng nhiều
biện pháp khác nhau là rất cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm với các mục đích
như:
 Lựa chọn được chủng có hoạt tính cao, ổn định.
 Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp KS.
 Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt hơn,
rút ngắn thời gian lên men, …
 VSV chỉ tổng hợp một sản phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
tách chiết và tinh chế.
 Sinh tổng hợp được các chất mới với tác dụng mới.
1.3.2. Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật [7], [13], [14], [15]
1.3.2.1. Phương pháp cải tạo
A. Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên
8

Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10
-10
– 10
-5
trong ống
giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau. Trong đó có biến chủng có hoạt
tính KS mạnh hơn 20-30% những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính
cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
B. Đột biến nhân tạo
Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột biến.
Các tác nhân khi được sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các

VSV, những cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi NST, gây đột biến gen, làm thay đổi
một hay nhiều nucleotid trong trình tự mã hóa gen gọi là đột biến điểm.
Các tác nhân đột biến có thể là: vật lý, hóa học, sinh học.
Phương pháp đột biến nhân tạo có ý nghĩa trong công nghiệp KS, làm thay
đổi tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng sinh KS ( đột biến âm), hoặc làm tăng
hiệu suất sinh tổng hợp KS ( đột biến dương).
 Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém, với tế bào VSV có kích
thước nhỏ ( 0,3-3μm) thì nó có thể xuyên thấu tới vùng nhân, gây đột biến mạnh, vì
vậy ánh sáng UV được sử dụng phổ biến trong cải tạo giống VSV.
* Cơ chế: Ánh sáng UV tác dụng lên ADN mạnh nhất ở vùng 260nm làm đứt
các liên kết hydro trong mạch kép ADN của tế bào VSV (dime hóa thymin).
Thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C
5
, C
6
. Hậu quả là sao chép bị sai
lầm vì ADN polymerase dễ lắp 1 nucleotid không chính xác vào vị trí trên. Đồng
thời trên sợi AND xuất hiện một dimepyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. Ở
đây C
6
của 5’ ( thymin hoặc cytozin) được liên kết với C
4
của 3’ ( thường là
cytozin).
Các dimer này làm ngăn chặn sự phiên mã và sao chép
ADN
và gây
chết nếu không sửa chúng.

* Các yếu tố ảnh hưởng tới phương pháp đột biến bằng UV

 Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi các yếu tố: Khoảng cách chiếu,
thời gian chiếu, độ pha loãng bào tử. Thực nghiệm cho thấy đột biến dương thường
xuất hiện ở liều lượng sống sót bào tử từ 0,1- 1%.
9

 Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng ánh sáng UV, hỗn dịch bào tử
được để yên trong bóng tối, nếu đem chiếu ánh sáng thường (λ= 320-480nm), có
khoảng 50-80% tế bào được phục hồi, mất đi tính đột biến do tác dụng của enzyme
photolyase. Hiện tượng này gọi là hiện tượng quang phục hoạt.
1.3.3. Bảo quản giống
 Mục tiêu: Bảo quản VSV một cách khoa học, đúng kỹ thuật để giữ
được quần thể các tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao, ổn định và giữ được các đặc
tính ban đầu, không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.
 Các phương pháp bảo quản: Phương pháp bảo quản lạnh; giữ giống trên
môi trường đất, cát và trên hạt ngũ cốc; phương pháp lạnh sâu; phương pháp đông
khô.
Để giữ giống, bảo quản xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng
phương pháp trên môi trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 2
0
C.
1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH
1.4.1. Khái niệm lên men [14]
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm
tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần
tế bào.
1.4.2. Phương pháp lên men [13], [14]
A. Lên men bề mặt
VSV được nuôi cấy trên bề mặt dịch thể hoặc bán rắn. VSV hấp thu các chất
dinh dưỡng của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT dinh
dưỡng.

Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.
Nhược điểm: Hiệu suất sử dụng thấp, khó giữ vô trùng, khó cơ giới hóa, tự
động hóa, tốn diện tích, nhân công.
B. Phương pháp lên men chìm
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong không
gian 3 chiều của MT lỏng.
10

Ưu điểm: Sử dụng MT dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng nhu cầu sinh lý và dinh
dưỡng của VSV; hiệu suất quá trình lên men cao; giữ vô trùng, dễ kiểm soát toàn
bộ, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp.
Nhược điểm: Kinh phí cho trang thiết bị lớn ( trang thiết bị chuyên dụng,
chịu áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối), cần cán bộ chuyên môn hóa, có kinh
nghiệm. Không thể xử lý cục bộ.
Các kiểu lên men chìm:
 Lên men mẻ ( gián đoạn) : Thể tích MT nuôi cấy không thay đổi
trong suốt quá trình lên men. Thu sản phẩm cuối quá trình. Các điều kiện lên men
được đảm bảo, VSV phát triển theo 4 pha: pha tiềm tàng, pha log ( lũy thừa), pha
dừng (pha cân bằng), pha suy tàn ( Hình P3- Phụ lục).
 Lên men có bổ sung: Bổ sung MT nuôi cấy trong quá trình lên
men, nên thể tích MT nuôi cấy thay đổi.
 Lên men liên tục: Liên tục cung cấp chất dinh dưỡng và thu sản
phẩm, nên thể tích MT nuôi cấy không thay đổi có thể coi là cân bằng động. Khi
đảm bảo các điều kiện, VSV sẽ kéo dài pha dừng.
 Lên men bán liên tục: Định kỳ bổ sung chất dinh dưỡng và định
kỳ thu sản phẩm.
1.5. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ [2], [14], [16]
Trong nhiều trường hợp thì KS có nồng độ không cao trong dịch lên men.
Kết thúc quá trình lên men KS có thể nằm trong sinh khối hoặc nằm trong dịch lọc.
Vì vậy việc tách chiết KS phải phụ thuộc vào bản chất của KS.

Một số phương pháp tách chiết được sử dụng: Chiết bằng DMHC; phương
pháp tạo phức kết tủa, trao đổi ion, … Trong công nghiệp thường áp dụng các
phương pháp tinh chế như: sắc ký, sắc ký ion, sắc ký sàng phân tử, kết tinh phân
đoạn,…
1.5.1. Chiết xuất kháng sinh ( Chiết lỏng- lỏng)
Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để
tách một số chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp chất cần nghiên cứu bằng cách
11

chuyển từ pha này sang pha khác. Thực tế thường dùng cân bằng nước - dung môi
hữu cơ không tan trong nước hoặc cân bằng lỏng – rắn để tách và tinh chế KS.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với
nhau.
Các phương pháp chiết lỏng – lỏng:
 Chiết 1 lần (chiết đơn): Đơn giản, tốn ít thời gian và dung môi.
 Chiết nhiều lần (chiết lặp): Hiệu suất chiết cao hơn, nhưng tốn thời gian,
công sức, dung môi.
 Chiết ngược dòng: Nguyên tắc cơ bản là dung môi chiết và mẫu chiết đi
ngược dòng nhau. Kỹ thuật chiết ngược dòng cho kết quả tốt hơn, thường được áp
dụng trong công nghiệp để tách các chất.
1.5.2. Tách và tinh chế kháng sinh
 Sắc ký lớp mỏng
Ưu điểm chính của kỹ thuật này là thực hiện nhanh, chi phí thấp nên được sử
dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc trong phòng thí nghiệm.
Nguyên tắc:
Pha tĩnh: là một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dính
trên một giá đỡ bằng nhôm, thủy tinh hay chất dẻo. Các hạt trong pha tĩnh tách theo
cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,…
Pha động: là một hệ thống dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi. Pha động di
chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu
giữ R
f
.
R
f =






d
v
: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
d
dm
:Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm).
Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng: Xác định trực tiếp chất khi dùng
ánh sáng kích thích; đưa thêm vào các chất phát huỳnh quang và dùng ánh sáng UV
12

chiếu vào để ghi nhận mẫu hoặc hiện hình bằng các thuốc thử đặc hiệu: Ninhydrin,
VSV, …
 Sắc ký cột:
Pha tĩnh: là cột chứa chất nhồi như: Silicagel, cellulose, nhôm oxyd,…
Pha động: dung môi đơn hoặc hỗn hợp, thường sử dụng hỗn hợp dung môi để
làm tăng sức rửa giải. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực.
1.6. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH
1.6.1. Phổ hồng ngoại [2]

Phổ hồng ngoại là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ bức
xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau.
1.6.2. Phổ UV-VIS [2]
Phổ UV_VIS là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV-
VIS vào bước sóng hay số sóng.
1.6.3. Phổ khối [2]
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion được
thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ
khối (MS).
1.7. Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến kháng sinh, Streptomyces
sp.
1.7.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm chuyển hóa của
Streptomyces AP-123 và hiệu ứng độc tế bào. [17]
Streptomyces AP-123 có dạng sợi, có nguồn gốc từ khu vực biển của Andra
Pradesh, Ấn Độ. Streptomyces AP-123 có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với tất cả
các VK thử nghiệm so với các chủng Streptomyces khác. Sự có mặt của glycin và
acid L-diaminopimelic trong thành tế bào chỉ ra các chủng thuộc về chi
Streptomyces sp. Giải trình tự gen 16S rADN của Streptomyces AP-123 cho thấy
13

99% trình tự tương đồng với Streptomyces flavogriseus. Các chất KS được chiết
xuất bằng hexan và ethylacetat.
Một hợp chất thu được bằng cách chiết xuất sử dụng dầu thô với các nồng
độ khác nhau của dung môi sau đó được tinh chế bằng sắc ký. Hợp chất thể hiện
hoạt tính kháng khuẩn cao đối với VK Gr (+), Gr (-), đồng thời thực nghiệm cho
thấy khả năng gây độc tế bào mạnh với các dòng tế bào ác tính - tế bào Vero ( thận
khỉ xanh ) và HEP2 (tế bào ung thư thanh quản) trong ống nghiệm. Nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) của hợp chất chống lại VK B. subtilis và S. aureus tương ứng là 25
và 37,5 μg/ mL; chống lại VK E. coli và P. aeruginosa tương ứng là 50 và 37,58
μg/ mL. Với Candida albicans và Aspergillus niger tương ứng các giá trị MIC là
12,5 và 25 μg/ mL.
1.7.2. Phương pháp làm tăng sản lượng kháng sinh [21]
Một yếu tố quan trọng trong việc sản xuất thương mại các thuốc KS là tăng
hiệu suất sinh tổng hợp KS. GS. Bibb và các cộng sự đã nghiên cứu áp dụng
phương pháp tái tổ hợp ADN, đồng thời khuếch đại các cụm gen cụ thể chịu trách
nhiệm trong sản xuất KS, góp phần nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS.
Nghiên cứu chứng minh rằng các yếu tố di truyền được xác định trong
S.kanamyceticus có thể khuếch đại từ 4 đến 12 lần một phân đoạn cụ thể của ADN
trong S. coelicolor có chứa các cụm gen chịu trách nhiệm sản xuất KS dẫn đến tăng
hơn 20 lần trong sản xuất actinorhodin.
1.7.3. Phương pháp làm tăng khả năng chống nấm của Nystatin mới được tổng hợp
từ Streptomyces noursei [18]
Kháng sinh nhóm macrolid, bao gồm nystatin và amphotericin B đang được sử
dụng để điều trị nhiễm nấm. Tuy nhiên, do độc tính và đặc điểm hấp thu của
Nystatin, các ứng dụng lâm sàng là tương đối hạn chế .Các chỉ số điều trị của các
thuốc thế hệ mới macrolid được cải thiện bằng cách thêm vào hoặc /và loại bỏ
nhóm hydroxyl ở C
9
-C
10
của heptaen nystatin. Kỹ thuật thay đổi này liên quan đến
khả năng bất hoạt P450 monooxygenase của NysL. Sau đó, các thay đổi được kết
hợp với sự thay thế của exocyclic C
16
- carboxyl bằng nhóm methyl thông qua bất
14

hoạt P450 monooxygenase của NysL . Sử dụng kỹ thuật di truyền, thu được bốn
macrolid mới tương tự nystatin với hiệu suất sản xuất tương đối cao (lên đến 0,51
g / lít ), tinh chế, xác định cấu trúc đặc trưng , xét nghiệm invitro cho thấy có khả
năng kháng nấm và tan huyết của chúng. Nếu thay thế C
16
-carboxyl với một
nhóm methyl vào các phân tử với một sửa đổi ở C
9
-C
10
sẽ làm gia tăng hoạt tính
kháng nấm trong khi giảm các hoạt động tan huyết.








15

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
2.1.1. Giống vi sinh vật
* Chủng xạ khuẩn
Giống xạ khuẩn Streptomyces 183.221 được phân lập từ mẫu đất Quận 9
Tp. HCM tại bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, có khả năng
sinh tổng hợp KS, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định.

*Chủng vi sinh vật kểm định
Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược
Hà Nội cung cấp:
 Vi khuẩn: Các chủng VK được giới thiệu ở bảng 2.1.
Bảng 2. 1. Các chủng vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gr(+) Vi khuẩn Gr(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 10241 Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201
Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonella typhi DT 220
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112

 Vi nấm: Aspergillus sp. 514, Microsporum sp. 014.
2.1.2. Các môi trường nuôi cấy
 Các MT phân lập, nuôi cấy, khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
Thành phần các môi trường được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2. 2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7
Tinh bột 2

2 2,4
Lactose 3