Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







NGUYỄN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT
LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG
QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU
PROBIOTIC CHỨA
Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT
LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG
QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU
PROBIOTIC CHỨA
Lactobacillus acidophilus


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
DS. Lê Ngọc Khánh
DS. Trần Văn Thái
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp dược




HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh và DS.
Trần Văn Thái, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều
kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và
đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài.
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo,
các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá trình
làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn.

Nhân dịp này, em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ
trong thời gian em học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp
đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!


Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Mai Hương



MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
2
1.1. Vi khuẩn lactic
2
1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic 2
1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus 3
1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic
5

1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic

5
1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa

6
1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ 7
1.2.4. Alginat 9
1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa 11
1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật
11
1.3.1. Lý thuyết đông khô 11
1.3.2. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 12
1.3.3. Tinh bột 13
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
15
2.1.1. Chủng vi sinh vật 15
2.1.2. Hóa chất 15
2.1.3. Môi trường 15
2.1.4. Máy móc, dụng cụ 15
2.2. Nội dung nghiên cứu
16
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của
nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau
đông khô
16
2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên

liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản
17
2.3. Phương pháp nghiên cứu
17
2.3.1. Phương pháp nhân giống

17
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17
2.3.3. Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha

đông tụ
17
2.3.4. Phương pháp đông khô 18
2.3.5. Phương pháp xác định hàm ẩm 19
2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
21
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của
nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus
sau đông khô
21
3.1.1. Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi
thay đổi nồng độ alginat
21
3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi
nang sau đông khô
25
3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của
nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình
bảo quản

29
3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên
liệu đông khô probiotic
29
3.2.2. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu
đông khô probiotic dạng vi nang
33
3.2.3. Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa 36
tinh bột trong quá trình bảo quản
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
40
1. Kết luận 40
2. Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Am : Amylose
Ap : Amylopectin
ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
B. infantis : Bifidobacterium infantis
Bifidobacterium spp. : Các loài thuộc chi Bifidobacterium
C (Cytosine)

: Xitozin
Cfu (Colony-Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc
ĐK : Đông khô
E. faecium : Enterococcus faecium
G (Guanine) : Guanin
IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn Sữa thế giới
Kl/tt : Khối lượng/thể tích
LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn Lactic
L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus
L. amylophilus : Lactobacillus amylophilus
L. amylovorus : Lactobacillus amylovorus
L. brevis : Lactobacillus brevis
L. kefir : Lactobacillus kefir
MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS
MT : Môi trường
PE (Polyethylene) : Polyetylen
TB : Tinh bột
VK : Vi khuẩn
VSV : Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15
2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu 16
3.1 Thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus
ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat
22
3.2 Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa
Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng
độ tinh bột
26
3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô 31
3.4 Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô

34
3.5 Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 37
3.6 Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 38











DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT Tên hình Trang
1.1 Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 5
1.2 Cấu trúc của acid alginic 10
1.3 Cấu trúc phân tử Ca-alginat 10
3.1 Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô 23
3.2 Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô 23
3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào
nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô
27
3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông
khô
31
3.5 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu sau
đông khô
35
3.6 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên
liệu trong thời gian bảo quản
39

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi
ích cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng
dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch… [33] Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị
ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… [58]
Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật… là các yếu tố
làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột. Ngoài ra, các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến
khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [46].
Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng
mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật
phù hợp và có thể chất thích hợp. Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra
những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều kiện bất lợi
trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong những phương pháp phổ biến để
bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp bảo
vệ chế phẩm khỏi độ ẩm chứ không bảo vệ chúng khỏi các yếu tố khác của môi
trường [40]. Vì vậy, phương pháp vi nang hóa đã được nghiên cứu, ứng dụng giúp
cách ly tế bào vi khuẩn với môi trường bất lợi nhằm giảm lượng vi sinh vật mất đi.
Ngoài ra, sử dụng các tá dược bảo vệ cũng là một trong những phương pháp khả thi
và đang được áp dụng rộng rãi. Việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng
khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện thể chất của nguyên liệu probiotic
sau đông khô ở dạng vi nang là một hướng nghiên cứu đáng chú ý.
Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong
quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” được thực
hiện với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic
dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô.
2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô

dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn lactic
1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) có thể được định nghĩa là một
nhóm vi khuẩn Gram dương, gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử,
không ưa khí (non-aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản
phẩm chính khi lên men carbohydrat [26]. Năm 1857, Louis Pasteur đã tìm ra từ sữa
bị chua các VSV lên men lactic thuộc họ Lactobacteriaceae (ngày nay gọi là
Lactobacterium). Năm 1873, J. Lister lần đầu tiên phân lập được một loài vi khuẩn
đặt tên là Bacterium lactis (hay còn gọi là Lactococcus lactis) và ngành công nghiệp
lên men nhờ VK lactic đã được hình thành từ năm 1881. Những nghiên cứu quan
trọng trong sự phân loại VK lactic đã cho thấy có nét tương tự giữa VK lactic từ sữa
chua và VK lactic trong các sản phẩm chứa acid lactic khác như rượu vang, các sản
phẩm muối chua và các loại VK lactic có ích trong đường ruột [60].
LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [26]. Có 2 cách chính để phân loại
LAB. Cách phân loại thứ nhất dựa trên hình thái, chia LAB làm 2 nhóm chính là
trực khuẩn và cầu khuẩn. Cách phân loại thứ 2 dựa trên kiểu lên men lactic, chia
LAB làm 2 nhóm chính là nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình
(homofermentative LAB) và nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình
(heterofermentative LAB) [26].
 Lên men đồng hình
Trong lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu
là acid lactic, chiếm khoảng 90 - 98%, các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng
vết rất nhỏ. Quá trình phân giải glucose, acid lactic được tạo ra theo con đường
EMP (con đường Embden - Mayerhoff - Parnas) [5]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn
lactic lên men đồng hình là các chi Streptococcus và Lactococcus [30].

 Lên men dị hình:
Trong lên men dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau được tạo thành, bên cạnh
3

acid lactic còn có một lượng đáng kể các sản phẩm khác như acid acetic, acid
formic, acid succinic, ethanol, CO
2
[26] [30] [52]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn
lactic lên men dị hình là chi Leuconostoc và một số loài thuộc chi Lactobacillus như
các loài L. brevis, L. kefir… [5] [30]
Vi khuẩn lactic có thể tồn tại ở dạng các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo
chuỗi. Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic khá đa dạng: có thể là hình cầu
hoặc hình que, đường kính các loại cầu khuẩn lactic thường từ 0,5 - 1,5µm, trực
khuẩn 1 - 8µm. LAB hầu hết không di động, catalase âm tính, tỉ lệ G+C thấp dưới
50% [52]. LAB là các vi khuẩn ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy
từng loài dao động từ 28 đến 45
o
C [5]. Nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng
trong điều kiện pH thấp từ 4,5 - 6,8; pH tối ưu của chúng là từ 3,5 - 5. LAB có nhu
cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn.
Nguồn carbon là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn
có thể sử dụng tinh bột như L. amylophilus và L. amylovorus [5].
LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong
thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt lên men, rau quả…), thực vật, trong đường
tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [52].
LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men. Các vi khuẩn
lactic sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra acid lactic và các loại acid hữu cơ khác
làm giảm pH, chống lại hiện tượng thối rữa rau quả, thịt cá, sữa; đồng thời làm tăng
hương vị, tăng thời gian bảo quản và thời gian sử dụng sản phẩm được lâu hơn [26].
Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng

cao sức khỏe với rất nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn
đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu,
giảm nguy cơ mắc ung thư… [52]
1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ
phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. L. acidophilus nằm trong chi Lactobacillus,
4

là chi lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và
ứng dụng trong sản xuất [24].
L. acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 - 0,9µm, dài 1,5 -
6,0µm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, kỵ khí
không bắt buộc, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic.
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC
hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48ºC [2] [12] [51].
L. acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật,
8 ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [8]. L.
acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng như tổng hợp các vitamin. Ngoài ra,
chúng có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin,
Bacteriocin [8]. L. acidophilus ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi
khuẩn gây bệnh [8] [12]. Chúng giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột,
ngăn ngừa tiêu chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh. Hơn nữa, L. acidophilus
còn có tác dụng ngăn ngừa ung thư nhất là ung thư ruột kết và có ảnh hưởng nhất
định đến sự lão hóa [8] [12].
L. acidophilus tạo ra môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ vi sinh
vật lên men đường ruột và ngược lại ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh
Gram âm. Ngoài ra, L. acidophilus cũng có tác dụng hoạt hóa đại thực bào nhưng
mức độ yếu hơn Bifidobacterium bifidum [38].
Tuy nhiên, khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men (trong bảo quản), nồng độ oxy hòa tan (oxy

khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ (trong bảo
quản), độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô Trong đó, nồng độ oxy hòa tan
đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự sống sót của L. acidophilus. Do đó,
sau thời gian bảo quản, lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [32].
Hiện nay, L. acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu
hóa như Antibio, Lacbio pro, Kidlac… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa
5

do dùng kháng sinh dài ngày, hoặc các trường hợp tiêu chảy, đầy bụng, khó tiêu, trẻ
kém ăn, chậm lớn

Hình 1.1: Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus
1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic
1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic
a. Khái niệm
Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng
rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có
nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc
nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl
pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào,
cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [6].
b. Đặc điểm
Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp
thành bảo vệ vững chắc. Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ
màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng [32] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và
mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều
kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian…
Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào. Vi
nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [59]. Độ bền cơ học của lớp màng
bao vi nang là một đặc điểm quan trọng. Màng phải có độ bền tương đối để có thể

bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế
sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết. Kích thước hạt vi nang
6

cũng là đặc điểm cần lưu ý. Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng
phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau. Kích thước hạt càng lớn thì độ bền
vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng
phóng thích tế bào càng khó. Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng
thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ
dàng hơn. Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của
các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt…
[6] [32].
1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa
a. Ưu điểm
Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định
lượng lớn tế bào sống. Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi
trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào,
bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt
như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định
hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các
chất ức chế trong môi trường lên men. Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài
khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [16] [59].
Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm
thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá
trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại. Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo
vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm
soát giải phóng vi khuẩn [16] [59].
Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm,
nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường
khác nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau. Vi

nang hóa cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử
dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng
dừng phản ứng nhanh [6] [59].
7

Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan
đến probiotic, thì việc vi nang hóa tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, giúp tăng độ ổn
định, thời gian bảo quản, kiểm soát giải phóng và cải thiện về mặt cảm quan cho sản
phẩm. Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu…
thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử
dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu
quả hơn [16] [32].
b. Nhược điểm
Mặc dù có nhiều ưu điểm đáng chú ý, song vi nang hóa tế bào vi sinh vật
cũng có một số nhược điểm. Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sản
sinh ra nhiều enzym trong đó có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng
không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào. Để giải
quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp không tạo ra các enzym
không mong muốn mà vẫn đảm bảo hoạt tính của các enzym mong muốn [6] [59].
Đa số các vật liệu vi nang như gelatin, thạch… đều là các nguồn dinh dưỡng
mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được. Điều này khá nghiêm trọng vì như thế vi sinh
vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa
làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống
đáng kể. Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử
dụng chính vật liệu vi nang. Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật
liệu vi nang phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó.
1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ
a. Nguyên tắc
Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm
một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang. Từ dung dịch keo trong một dung môi

thích hợp, tiến hành các tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng
đáng kể keo được tách ra thành pha mới. Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có
nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ
8

(coacervat). Sau đó, các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ trên bề
mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [4] [15].
b. Phân loại
Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha
đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách
pha đông tụ phức hợp [4] [15].
Tách pha đông tụ đơn giản là quá trình loại nước của các chất keo thân
nước dùng trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Phương pháp này thường
chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose).
Quá trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một
dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…), thêm vào một
muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [55].
Tách pha đông tụ phức hợp là quá trình tương tác giữa phân tử tích điện
âm và tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay
đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH. Các polyme càng có sự khác
nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4] [15] [55].
Tách pha còn có thể được thực hiện do thêm vào một polyme khác không
tương đồng, do thêm vào một dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông
thường), hoặc do tương tác giữa các polyme… [4].
Tách pha do sự hóa muối (đông tụ thông thường)
Tách pha do sự hóa muối được thực hiện theo nguyên tắc sau: khi thêm dung
dịch đậm đặc hoặc muối điện ly mạnh (muối vô cơ) vào hệ chế tạo vi nang sẽ tạo
thành hai pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo.
Kỹ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định
gel, ion hóa tạo gel (ionic gelation method, ionotropic gelation techniques) để tạo ra

các hạt gel không tan (hydrogel). Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme
có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm
gellan… Trong phương pháp này, các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa
hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược
9

chất hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel
alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn. Hydrogel
được bào chế bằng hai kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ
[45].
1.2.4. Alginat
a. Cấu tạo, nguồn gốc
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một
heteropolyme saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic
và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid.
Alginat được sản xuất từ tảo nâu Phaeophyta, trong tảo các acid chủ yếu ở
dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca) [42].
b. Tính chất
Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung
dịch và khả năng tạo gel [42].
Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử
alginat. Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH
và sự có mặt của ion kim loại [18] [29].
Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa
trị II, III; sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng. Bình thường trong dung
dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có
mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca
2+
, Ba

2+
, Sr
2+
) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel
xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành
khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion Ca
2+
khớp vào các khoảng
trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu trúc gel này, khi sử dụng
làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi
của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát
được [42].
10


Hình 1.2: Cấu trúc của acid alginic Hình 1.3: Cấu trúc phân tử Ca-alginat
c. Ưu, nhược điểm của vật liệu bao vi nang alginat
Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm. Alginat là vật
liệu an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với Calci clorid
[32]. Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn
định cao. Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản,
có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo
thành có tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành
đẹp và tương đối đồng đều [18] [29].
Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số
nhược điểm. Độ bền của gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị một và các chất tạo
phức với ion Calci. Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như
lactat có thể làm giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài.
Ngoài ra, trong quá trình vi nang hóa, cần phải khuấy để phân phối đều tế bào được
vi gói nên khá tốn kém [18] [29].

d. Ứng dụng của alginat
Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào vi sinh vật sống. Muối Natri
của alginat tan trong nước được phối hợp với các tế bào vi sinh vật sống, sau đó nhỏ
giọt vào dung dịch Calci clorid sẽ tạo thành hạt gel Ca-alginat bao bọc tế bào sống
bên trong. Ngoài ra, alginat cũng được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào và cố
định enzym [22] [37].
11

Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã,
tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong viên giải phóng kéo
dài, tá dược độn trong viên nang. Ngoài ra, Natri alginat còn được sử dụng làm tá
dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất của nhũ tương, hỗn dịch trong các chế phẩm
dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ… [42]
1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa
Vi nang hóa là một trong những phương pháp mới và hiệu quả nhất đang
được nghiên cứu và áp dụng để cải thiện khả năng tồn tại của vi sinh vật trong chế
phẩm probiotic. Sheu và Marshall (1993) đã nghiên cứu quá trình đông lạnh sữa, vi
khuẩn lactobacilli trong sữa được vi gói trong nang Calci alginat cho thấy khả năng
sống sót tăng hơn 40% so với khi ở dạng tự do [53]. Kebary và cộng sự (1998) cũng
báo cáo rằng vi nang hóa Bifidobacterium bifidum và B. infantis sử dụng alginat
hoặc kappa-carrageenan đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của VSV trong sữa
đông lạnh trong suốt thời gian lưu trữ (-20ºC trong 10 tuần) [35]. Khalida và cộng
sự (2000) đã báo cáo, vi nang hóa L. acidophilus và Bifidobacterium spp. trong
nang Calci alginat phối hợp tinh bột cải thiện khả năng sống sót của VSV trong sữa
chua sau khi bảo quản trong 8 tuần ở 4ºC [36].
Tại Việt Nam, Đỗ Quốc Cường (2009) đã tiến hành vi gói L. acidophilus
trong nang gelatin – alginat và cho thấy khả năng tồn tại của của VK ở dạng vi nang
trong môi trường dạ dày nhân tạo tốt hơn dạng tự do [1]. Quách Thu Trang (2010)
đã báo cáo, L. acidophilus trong hạt vi nang Calci alginat có sử dụng sữa gầy làm tá
dược bảo vệ cho tỉ lệ sống sót sau đông khô và sau 4 tuần bảo quản ở 4ºC cao hơn

đáng kể so với không vi nang hóa [9].
Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang lưu hành trên thị trường: Probiocap
(chứa L. acidophilus) của viện Rosell/Lallemand The Americas, Canada; Cernivet
(chứa E. faecium SF 68) của Cerbios-Pharma; Geneflora (chứa Lactobacillus
sporogenes) của công ty America’s Bio-Plus… [32]
1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật
1.3.1. Lý thuyết đông khô
12

Đông khô được định nghĩa là một quy trình tạo sự ổn định mà trong đó vật
cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có trong vật
(dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau đó là quá trình
khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị ngăn cản vi sinh vật phát triển hoặc xúc tác các
phản ứng hóa học [39] [41].
Đông khô từ nhiều năm nay đã được sử dụng để ổn định khả năng sống sót
của vi sinh vật trong thời gian bảo quản. Nhờ đông khô, tế bào vi sinh vật được bảo
vệ trong hàng thập kỷ mà không suy giảm số lượng sống sót. Ưu điểm lớn nhất của
đông khô vi sinh vật là ổn định khả năng sống sót của vi sinh vật và làm quá trình
vận chuyển, bảo quản trở nên dễ dàng hơn [14] [41].
Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng cũng là một
trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo
nguyên liệu và chế phẩm probiotic. Đặc biệt, giai đoạn tiền đông là nguyên nhân
gây áp lực cho thành tế bào vi khuẩn. Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ
bị tổn thương. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay đổi hình thái tự nhiên của
lipid màng và sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm là nguyên nhân chính
gây ra sự suy giảm số lượng tế bào trong quá trình đông khô [25]. Cũng có tài liệu
cho rằng việc hình thành phân tử đá nội phân tử có thể là nguyên nhân gây phá vỡ
màng tế bào [39].
1.3.2. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật
Một trong những phương pháp để tăng số lượng vi sinh vật sống sót sau

đông khô là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tá dược bảo vệ. Các tá dược này
được thêm vào nhằm mục đích bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và tăng khả
năng chống chịu của vi sinh vật trong quá trình làm khô. Khả năng bảo vệ phụ
thuộc vào bản chất của tá dược. Ngoài ra, nồng độ tá dược cũng đóng vai trò quan
trọng giúp tăng khả năng sống sót của VSV [31] [39].
Các tá dược thường dùng trong đông khô vi sinh vật gồm: nhóm carbohydrat
(sucrose, trehalose…), nhóm polyme (gelatin, polyethylen glycol, tinh bột…), nhóm
protein (sữa gầy, trypsin…), nhóm polyol/alcohol (mannitol, glycerol…), nhóm
13

amino acid (natri glutamat, proline…), các chất chống oxy hóa (ascorbic acid, natri
thiosulfat…), và một số chất khác (natri acetat…) [41].
1.3.3. Tinh bột
a. Cấu tạo, nguồn gốc
Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng
sau cellulose. Người ta thấy tinh bột có trong cây xanh, rễ, cành, hạt, củ và quả.
Walton đã sưu tầm trên 300 nghiên cứu về tinh bột, tất cả đều cho thấy tinh
bột của mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin
(Ap) [11] [27]. Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose. Các gốc glucose
trong Am kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng
500-2.000 đơn vị glucose, phân tử lượng trung bình 10.000-300.000. Ap có cấu trúc
phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm
phân nhánh [10]. Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát
ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, phân tử lượng Ap
khoảng 5×10
5
- 1×10
6
. Trong những nguyên liệu khác nhau thì hàm lượng Am và
Ap cũng không giống nhau, nhưng thường tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4.

Nước ta có nguồn nguyên liệu tinh bột rất đa dạng và phong phú. Trong đó,
sắn là loại cây lương thực có sản lượng cao và tinh bột sắn được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp dược
phẩm, thực phẩm… Vì vậy, ta sử dụng tinh bột sắn làm nguyên liệu trong nghiên
cứu này.
b. Tính chất
Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan. Ở môi
trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose. Trong môi trường
kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn.
Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương
phồng lên, tăng thể tích. Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột.
Trên 55 - 70ºC, các hạt tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl
phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh. Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể
14

gây nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào các phần tử cấu
thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch. Nhiệt độ để phá vỡ
hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái đầu có mức độ oxy hóa khác nhau thành dung dịch
keo gọi là nhiệt hồ hóa [10] [27].
c. Ưu điểm
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân hủy sinh
học. Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [17]. Tinh bột là tá dược
độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được [21]. Tinh bột thường được sử dụng để
ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học và độc
tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi [40].
d. Ứng dụng
Tinh bột là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô. Cơ chế
bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [41]. Trong quá trình
vi nang hóa tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đông tụ hóa muối sử dụng alginat,
tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện tính chất vật lý của

hạt vi nang sau đông khô và giúp tế bào ổn định hơn trong quá trình đông khô và
bảo quản [21]. L. acidophilus không có khả năng tiêu thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có
thể được lựa chọn trong vi nang hóa L. acidophilus.
Tinh bột là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp keo dán vì
những tính chất đặc trưng của nó như tạo hình, tạo dáng, tạo khung, tạo độ dẻo, độ
dai, độ đàn hồi, độ xốp và có khả năng tạo gel, tạo màng cho nhiều sản phẩm.





15

Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 (Viện kiểm
nghiệm thuốc trung ương).
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc
Glucose Trung Quốc Triamoni citrat Trung Quốc

Pepton Ấn Độ Natri acetat Trung Quốc

Cao thịt Merk-Đức Natri citrat Trung Quốc

Cao nấm men Merk-Đức Alginat Ấn Độ

K
2
HPO
4
Trung Quốc Calci clorid Trung Quốc
MgSO
4
.7H
2
O Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam
MnSO
4
.4H
2
O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam
Natri clorid Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
 MRS lỏng (MT1):
Glucose 20g

Natri acetat 5g

Pepton 10g

K
2
HPO
4
2g

Cao thịt 10g

MgSO
4.
7H
2
O 0,2g

Cao nấm men 5g

MnSO
4
.4H
2
O 0,05g

Triamoni citrat 2g

Nước máy vừa đủ 1.000ml



pH 6,8-7,0


 Môi trường MRS thạch (MT2):
MT2=MT1 + thạch (25g thạch/1.000ml môi trường).
2.1.4. Máy móc, dụng cụ
 Máy móc

16

Bảng 2.2. Các máy móc dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Nguồn gốc
Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh sâu Đức
Tủ lạnh LG Hàn Quốc
Thiết bị đông khô Đức
Máy li tâm Đức
Nồi hấp tiệt khuẩn ALP- Nhật
Cân phân tích Đức (Satorious)
Cân kỹ thuật Đức (Satorious)
Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus)
Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (Vortex) Trung Quốc
 Dụng cụ
Bình nón 250, 1.000ml Giá rửa hạt
Cốc có mỏ Ống nghiệm
Ống đong Pipet chia vạch
Ống li tâm Pipet tip ( Đầu côn)
Bơm tiêm Pipetman (Pipet Eppendorf)
Đĩa petri đường kính 9cm
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu
probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô
 Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng
độ alginat.

 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông
khô.