Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lumivudin zidovudin và nevirapin trong chế phẩm viên nén bằng MEKC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG LAN HƯƠNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN,
ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG
CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI, 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VƯƠNG LAN HƯƠNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN,
ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG
CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
GV hướng dẫn: Nguyễn Thị Thùy Linh
Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI, 2013

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích -
Độc chất trường Đại học dược Hà Nội.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thị Thùy
Linh, người đã tận tâm dìu dắt, chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật
viên bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong
quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã
hết lòng giúp đỡ và động viên em hoàn thành khóa luận này
Hà Nội, tháng 02 năm 2013
Sinh viên
Vương Lan Hương












MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin 3
1.1.1 Tổng quan chung 3
1.1.2 Dược động học 4
1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV 6
1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản 8
1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản 8
1.2.2 Các kiểu điện di mao quản 10
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di 12
1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC) 12
1.2.5 Ưu - nhược điểm của MEKC 17
1.3 Một số nghiên cứu gần đây về tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT
& NVP 18
1.3.1 Phương pháp HPLC 18
1.3.2 Phương pháp CE 20
PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Điều kiện nghiên cứu 21
2.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu 21
2.1.2 Hóa chất 21
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 23
2.2 Đối tượng nghiên cứu 23
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24
2.3.1 Nội dung nghiên cứu 24
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 24
3.1 Lựa chọn điều kiện điện di tối ưu 27
3.1.1 Lựa chọn bước sóng 27
3.1.2 Điều kiện điện di 28
3.1.3 Lựa chọn phương pháp bơm mẫu 29
3.1.4 Lựa chọn kiểu điện di 30

3.1.5 Lựa chọn dung dịch điện ly nền 31
3.1.6 Khảo sát điều kiện pH của dung dịch điện ly nền 32


3.1.7 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền 35
3.1.8 Khảo sát nồng độ chất tạo micelle SDS 37
3.1.9 Khảo sát thế đặt vào hai đầu mao quản 39
3.1.10 Khảo sát áp suất tiêm mẫu 41
3.1.11 Định tính Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin trong điều kiện điện
di đã được thiết lập 43
3.1.12 Kết luận 45
3.2 Thẩm định phương pháp 45
3.2.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống 45
3.2.2 Tính đặc hiệu 46
3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính 48
3.2.4 Độ lặp lại của phương pháp 52
3.2.5 Độ đúng của phương pháp 54
3.3 Ứng dụng định lượng trong chế phẩm 56
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 58
4.1 Kết luận 58
4.2 Đề xuất 59

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người ( Acquired
immunodeficiency syndrome)
AZT
Zidovudin
C
Nồng độ
CE
Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)
CEC
Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)
CGE
Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)
CZE
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)
C
max

Nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết tương
DAD
Detector mảng diod (Diod Array Detector)
EOF

Dòng điện thẩm (Electro – osmotic Flow)
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HIV
Virus gây bệnh suy giảm miễn dịch ở người ( Human
Immunodeficiency Virus)
NVP
Nevirapin
MEKC
Sắc ký điện động micelle (Micellar Electrokinetic
chromatography)
RSD %
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
S
pic

Diện tích pic
SD
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)


STT
Số thứ tự
T
1/2

Thời gian bán thải
T
max

Thời gian để đạt C
max

T
m

Thời gian di chuyển
T
nc
Nhiệt độ chảy
UV – VIS
Bước sóng tử ngoại - khả kiến (Ultra Violet – Visiable)
WHO
Tổ chức Y tế thế giới (World Heal Organization)
3TC
Lamivudin
ddC
Zalcitabine
ddI
Didanosine

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT bảng
Tên bảng
1
Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin
2
Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin
3
Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng
4
Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của phương pháp
(n=6)
5
Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng
6
Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng
7
Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng
8
Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định
lượng 3TC
9
Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định
lượng AZT
10
Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định
lượng NVP

11
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Lamivudin
12
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Zidovudin
13
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Nevirapin
14
Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N


15
Kết quả định lượng viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin
300mg

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT hình
Tên hình
1
Sơ đồ nguyên tắc hoạt động của CE
2
Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
3
Thứ tự rửa giải trên điện di đồ
4
Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC
5
Micell hình cầu
6
Phổ hấp thụ của Lamivudin
7
Phổ hấp thụ của Zidovudin
8
Phổ hấp thụ của Nevirapin
9
Điện di đồ chuẩn Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin ở ba dung
dịch điện ly nền khác nhau
10
Điện di đồ hỗn hợp ba chuẩn với dung dịch điện ly nền Na
2
B
4

O
7

10mM/ SDS 50mM ở các pH khác nhau
11
Điện di đồ hỗn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền ở các nồng
độ borat khác nhau
12
Điện di đồ hỗn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền ở các nồng
độ SDS khác nhau
13
Điện di đồ hốn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền borat
10mM/SDS 50mM ở các thế khác nhau
14
Điện di đồ hỗn hợp chuẩn với thời gian tiêm mẫu khác nhau
15
Điện di đồ hỗn hợp thử


16
Điện di đồ mẫu thử thêm Lamivudin chuẩn
17
Điện di đồ mẫu thử thêm Zidovudin chuẩn
18
Điện di đồ mẫu thử thêm Nevirapin chuẩn
19
Điện di đồ hỗn hợp chuẩn ở diều kiện điện di tối ưu
20
Điện di đồ mẫu trắng
21

Điện di đồ hỗn hợp chuẩn Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin
22
Điện di đồ hỗn hợp chế phẩm làm việc
23
Điện di đồ hỗn hợp chế phẩm thêm chuẩn
24
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ 3TC
tương ứng
25
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ AZT
tương ứng
26
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ NVP
tương ứng
27
Điện di đồ chế phẩm viên nén Avocomb-N
28
Điện di đồ chế phẩm viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin
300mg



1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vào tháng 6 năm 2011, tại Hội nghị cấp cao về HIV/AIDS ở New
York, Mỹ, Việt Nam đã khẳng định lại quyết tâm của mình trong công cuộc
phòng, chống HIV/AIDS và cam kết thực hiện những mục tiêu mới thông qua
việc ký Tuyên bố Chính trị năm 2011 về HIV/AIDS: Tăng cường nỗ lực để
loại trừ HIV/AIDS. Để có thể thực hiện mục tiêu đó, ngoài những biện pháp
xã hội cần được thực hiện thì việc kiểm soát chất lượng thuốc dùng trong điều

trị cũng góp phần quan trọng không kém. [10]
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều thuốc dùng để điều trị HIV. Tuy
nhiên, theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới WHO, để điều trị HIV nên
dùng phối hợp hai thuốc NRTIs hoặc cùng phối hợp với một thuốc NNRTIs
mà không nên đơn trị liệu vì có thể dẫn đến kháng thuốc, làm giảm hiệu quả
điều trị. [3], [11], [13]
Xuất phát từ nhu cầu đó, trên thị trường bắt đầu xuất hiện những thuốc
ở dạng hỗn hợp đa thành phần. Chế phẩm chúng tôi dùng nghiên cứu cũng là
một trong số đó. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng cũng như xác định các
thành phần trong chế phẩm hỗn hợp đóng một vai trò hết sức quan trọng trong
việc đảm bảo chất lượng thuốc, đem lại sự an toàn, hiệu quả cho người sử
dụng.
Hiện nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích
được đa số các Dược điển quốc tế lựa chọn trong kiểm nghiệm thuốc điều trị
HIV. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính xác cao,
khả năng tách tốt, độ nhạy cao và giới hạn phát hiện nhỏ. Tuy nhiên, phương
pháp này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn dung môi tinh khiết, đắt tiền,
nhiều loại dung môi có thể gây độc với người phân tích và ô nhiễm môi
trường. Đồng thời phương pháp này tương đối hạn chế trong việc phân tích
2
các chất có khả năng ion hóa, nhất là sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo RP –
HPLC (Reversed – phase liquid chromatography). [16], [17]
Nhằm mục đích xây dựng một phương pháp nghiên cứu phân tích ít tốn
kém và ít độc hại hơn, chúng tôi hướng đến phương pháp điện di mao quản.
Đã có nhiều nghiên cứu phân tích 3TC, AZT & NVP bằng phương pháp
HPLC. Tuy nhiên, chưa thấy một nghiên cứu nào phân tích định lượng đồng
thời ba chất đó bằng phương pháp CE. Mặt khác, CE tuy không còn mới lạ
trên thế giới, nhưng ở Việt Nam, việc ứng dụng CE vào trong kiểm nghiệm
dược phẩm vẫn còn rất hạn chế. Với những mục đích trên, đồng thời nhằm
nâng cao chất lượng việc xây dựng tiêu chuẩn và quản lý các thuốc điều trị

HIV đang được sử dụng tại Việt Nam; giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều
lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện nơi làm
việc nhất, chúng tôi đã tiến hành khóa luận “Xây dựng phương pháp định
lượng đồng thời Lamivudin, Nevirapin & Zidovudin bằng MEKC” nhằm
hai mục tiêu
- Xây dựng phương pháp phù hợp và ổn định để tách và định lượng
đồng thời Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin.
- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để kiểm tra một số chế
phẩm chứa Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin được dùng trong
phác đồ điều trị HIV/AIDS.




3
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về Lamivudin, Nevirapin và Zidovudin
1.1.1 Tổng quan chung [4], [5], [12]
Bảng 1: Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin
Đặc điểm
Lamivudin
Zidovudin
Nevirapin
CTHH




CTPT
C

8
H
11
N
3
O
3
S
C
10
H
13
N
5
O
4

C
15
H
14
N
4
O
PTK
229,3 g / mol
267,2 g/mol
266,3 g/mol
Tên KH
4-Amino-1-

[(2R,5S)-2-
(hydroxymethyl)-
1,3-oxathiolan-5-
yl]pyrimidin-2(1H)-
one.
1-(3-Azido-2,3-
dideoxy-b-D-erythro-
pentofuranosyl)-5-
methylpyrimidine-
2,4(1H,3H)-dione.
11-Cyclopropyl-4-
methyl-5,11-
dihydro-6H-dipyrido
[3,2-b:2’,3’-
e][1,4]diazepin-6-
one.
Tính chất
Bột kết tinh màu
trắng hoặc gần như
trắng
Tinh thể trắng hoặc
hơi nâu.
Bột kết tinh màu
trắng hoặc gần như
trắng
T
nc
160 – 162
0
C

120 – 122
0
C
242 – 246
0
C
Độ tan
Dễ tan trong nước,
tan trong cồn, khó
tan trong các dung
Khó tan trong nước,
EtOH
Thực tế không tan
trong nước, ít tan
trong CH
3
Cl.
4
môi hữu cơ không
phân cực
pKa
4,3
9,68
2,8
Năng
suất quay
cực
- 135
0
(C = 0,38%

trong MeOH)
+ 60,5
0
→ + 63,0
0
( C
= 1% trong EtOH)
+ 99
0
(C = 0,5%
trong nước)

λmax
270nm
264,5 nm
268,5 nm
1.1.2 Dược động học [3], [6], [11]
Bảng 2: Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin
Đặc điểm
Lamivudin
Zidovudin
Nevirapin
Sinh khả
dụng
~ 80%, không bị
ảnh hưởng bởi thức
ăn
60 – 70 %, bị ảnh
hưởng khi ăn nhiều
chất béo

>90%, không bị ảnh
hưởng bởi thức ăn
hoặc thuốc kháng
acid
Tmax
1h sau khi uống
0,5 – 1h sau khi
uống
4h sau khi dùng liều
duy nhất
Cmax
1,5 µg/ml (liều
150mg)
1,2 mg/l ( liều
250mg )
5,74 µg/ml (liều
200mg)
Phân bố
Vd = 1,3 ± 0,4
lit/kg
Vd = 1,6 ± 0,6 lit/kg
Nevirapin đi qua
được nhau thai và
hàng rào não tủy,
phân bố trong dịch
não tủy và sữa mẹ.
Vd = 1,21 0,09
lit/kg
5
Liên kết

protein
huyết
tương
<36% (thấp)
34 – 38%
60%
Chuyển
hóa
5 -6% thuốc được
chuyển hóa thành
trans – sulfoxyd.
Chuyển hóa tại gan
thành dẫn xuất
glucuronid không
hoạt tính
Chuyển hóa tại gan
thành dẫn xuất
glucuronid không
hoạt tính
Thuốc gây cảm ứng
enzyme gan
Thời gian
bán thải
2,5h
1,1 ± 0,2h
Người bệnh bị ure
huyết cao: 1,4 – 2,1h
Bệnh nhân xơ gan:
2,4h
25 – 30h

Thải trừ
70% thải trừ dưới
dạng còn nguyên
vẹn qua nước tiểu
70% liều uống (40-
60% liều tiêm
truyền) được thải trừ
dưới dạng chuyển
hóa qua nước tiểu
10 -20% liều uống
(15 – 30% liều tiêm
truyền) được thải trừ
dưới dạng không đổi
qua nước tiểu
>70% thải trừ qua
nước tiểu dưới dạng
chuyển hóa.

Độ thanh
thải Cl
0,37 ± 0,05
lit/giờ/kg
0,2 – 0,3 lit/giờ/kg
0,017 – 0,032
lit/giờ/kg
6
1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV
1.1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị HIV
- Nhóm 1: Thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleoside
(nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs)

VD: Zidovudin; Didanosin; Zalcitabin; Stavudine; Lamivudin; Abacavir;
Tenofovir disoproxil fumarate.
- Nhóm 2: Thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleoside
(non-nucleoside reverse transcriptase ninhibitors =NNRTIs)
VD: Nevirapin; Delavirdin; Effavirenz
- Nhóm 3: Thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs)
VD: Indinavir; Ritonavir; Saquinavir; Nelfinavir; Amprenavir; Lopinavir.
Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối
hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc
nhóm 3 để đạt được hiệu quả điều trị cao và tránh kháng thuốc.
1.1.3.2 Phác đồ phối hợp trong điều trị HIV [3], [11], [13], [20]
Trong liệu pháp kháng retrovirus, thuốc được chọn lọc là những thuốc
tương tự nucleoside. Hiện nay chưa biết rõ lúc nào là thời điểm tốt nhất để bắt
đầu điều trị với thuốc kháng retrovirus. Liệu pháp kháng retrovirus cũng làm
tăng thời gian sống sót ở người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong
1mm
3
. Liệu pháp này cũng có thể dùng cho người bệnh có mật độ HIV trên
30.000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng CD4, vì mật độ HIV là
một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh. Mật độ virus cao hơn dẫn đến
giảm tế bào CD4 nhanh hơn. Mục tiêu điều trị là đạt mật độ HIV ở mức
không thể phát hiện được.
Liệu pháp chuẩn hiện nay gồm 2 thuốc tương tự nucleoside kháng
retrovirus, cùng với một thuốc ức chế protease.
7
Người bệnh điều trị không có kết quả (tăng gấp 3 lần mật độ virus, hoặc
giảm số lượng tế bào CD4, hoặc tiến triển thành bệnh AIDS) phải chuyển
sang dùng kết hợp với một thuốc kháng retrovirus khác. Lựa chọn thuốc sao
cho nguy cơ kháng chéo với những thuốc đã dùng là tối thiểu. Khi liệu pháp
cũ không có tác dụng cần thêm thuốc mới, nguyên tắc là cho thêm không chỉ

một thuốc mà kết hợp 2 thuốc mới.
Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleoside có tác dụng
kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzyme phiên mã
ngược của virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng
retrovirus để điều trị HIV.
Nevirapin là chất ức chế enzyme phiên mã ngược non-nucleosid có hoạt
tính kháng retrovirus HIV-1.
Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin là ba thuốc phối hợp được tổ chức Y
tế thế giới WHO khuyến cáo dùng trong điều trị HIV.
Liều dùng:
- Nevirapin 200mg/lần/ngày (trong hai tuần đầu), sau đó 200mg/2 lần/ngày
- Zidovudin 300mg/ 2 lần/ngày. Bệnh nhân bị suy giảm chức năng thận
hoặc phải điều chỉnh liều do bị nhiễm độc tố không được sử dụng viên
phối hợp.
- Lamivudin 150mg/2 lần/ngày
Nevirapin được khuyến cáo nên dùng nửa liều trong vòng 14 ngày đầu để
làm giảm nguy cơ phát ban. Theo lưu ý trên, trong suốt thời kì này, không nên
sử dụng viên nén phối hợp 3 thành phần trên. Không nên cố gắng sử dụng
một viên/ ngày, vì điều đó có thể dẫn đến việc kháng Lamivudin và điều trị
thất bại. Thay vì đó, nên sử dụng những viên riêng biệt. Sau 14 ngày, liều của
Nevirapin nên được tăng lên 200mg/2 lần/ ngày hoặc có thể sử dụng viên
thuốc phối hợp.
8
Viên phối hợp Zidovudin/Lamivudin không phù hợp với những người bị
suy thận hoặc những bệnh nhân sử dụng liều Zidovudin thấp hơn do tác dụng
phụ
1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản [1], [2], [9], [14], [15]
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hóa từ thuật
ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.
1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản

Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100 cm,
đường kính trong 25 - 100 µm, đường kính ngoài 300 - 400 µm. Sử dụng áp
suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản. Điện thế một
chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tách. Dưới tác dụng của lực
điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-
Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau
và tách ra khỏi nhau do điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác
nhau. Các chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di
chuyển về một đầu mao quản.
Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diod DAD. Vị trí
phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”.

Hình 1: Sơ đồ hệ thống điện di
9
 Dòng điện thẩm (EOF)
Trong CE, dòng điện thẩm (EOF: electro-osmotic flow) là một thành phần
cơ bản, tạo nên sự di chuyển của toàn bộ dung dịch trong mao quản bắt nguồn
từ điện tích bề mặt trong của thành mao quản.
 Nguồn gốc EOF
Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành
trong của mao quản sẽ giải phóng ra H
+
vào dung dịch và bề mặt thành mao
quản sẽ mang điện tích âm. Quá trình giải phóng H
+
phụ thuộc vào hằng số
cân bằng K, nhưng thực nghiệm chỉ rõ rằng dòng EOF có giá trị đáng kể khi
pH dung dịch trên 4.
Do bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm, nên đối ion (chủ yếu
là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng điện

tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta.
Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di
chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo theo cả
khối dung dịch trong mao quản đi về catod. Sự di chuyển của khối dung dịch
trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường được gọi là dòng điện
thẩm EOF.
 Hai đặc điểm của EOF
- Đặc điểm đầu tiên của EOF là tạo nên một dòng chuyển khối phẳng trong
mao quản. Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc
theo mao quản, cho nên không có sự sụt áp trong mao quản: dòng đồng
nhất từ đầu đến cuối (mao quản).
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện di chỉ
xuất hiện khi đường kính trong mao quản (d
i
) dưới 200µm. Nếu d
i


200µm,
sức căng bề mặt không đủ tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng
ở giữa và ở gần thành mao quản.
10
- Đặc điểm thứ hai của EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung
dịch điện di, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng hướng.
Với điều kiện điện di thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng
này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc
độ EOF thường lớn hơn rất nhiều lần so với tốc độ điện di.

Hình 2: Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
Cation di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo

sau là các chất không mang điện tích (trên hình vẽ là N) di chuyển theo EOF
nhưng không tách khỏi nhau được. Cuối cùng là anion. Trên điện di đồ thứ tự
rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước
nhất, anion có điện tích lớn kích thước nhỏ ra sau cùng.







Hình 3: Thứ tự rửa giải trên điện di đồ
1.2.2 Các kiểu điện di mao quản
Thời gian
Điện tích lớn
kích thước
nhỏ
Cation
Các chất
trung hòa
Anion
Điện tích lớn
kích thước nhỏ
11
Điện di mao quản khá đa dạng, có thể thực hiện theo nhiều kiểu khác
nhau. Mỗi kiểu có cơ chế tách riêng của nó. Bảng dưới đây tóm tắt bốn kiểu
điện di.
Bảng 3: Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng
STT
Kiểu điện di

Cơ chế tách
Ứng dụng
1
Điện di mao quản vùng
(Capillary zone
electrophoresis: CZE)
Dựa trên linh
độ khác nhau
của các ion
trong dung dịch
tự do
-Sinh học: phân tích các
peptid, protein, dặc biệt là
glucoprotein
-Xác định dược chất và các
chất chuyển hóa của chúng
-Phân tích các chất ô nhiễm
môi trường
2
Sắc kí điện động
micelle (Micellar
electrokinetic
chromatography:
MEKC)
Dựa trên sự
tương tác
nước/ion với
hạt micelle
trong dung
dịch.

Là kỹ thuật bổ sung cho
CZE để tách các ion và
phân tử trung hòa về điện
3
Điện di mao quản gel
(Capillary gel
electrophoresis: CGE)
Dựa trên kích
thước và điện
tích
Dùng để phân tích các
phân đoạn AND, tách
protein
4
Điện sắc kí mao quản
(Capilarry
electrochromatography:
CEC)
Dựa trên sự
phân bố và linh
độ khác nhau
của các chất.
-Phân tích dược: dùng phân
tích dược chất thuộc nhiều
nhóm khác nhau
-Phân tích các phân tử sinh
học, các đồng phân quang
học
12
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di

1.2.3.1 Điện thế
Thời gian phân tích tỉ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao quản. Tuy
nhiên, nếu điện thế quá cao có thể gây ra hiệu ứng June, tạo ra nhiệt trong
mao quản, làm thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong mao quản, khiến cho các
phân tử chất tan di chuyển không đồng nhất, dẫn đến sự khuếch tán khác nhau
và làm mở rộng vùng mẫu.
1.2.3.2 Nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện của dung dịch
điện ly nền. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ mao quản tăng là nguyên
nhân thay đổi cấu trúc protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu quả phân
tích.
1.2.3.3 Dung dịch điện ly
- Loại dung dịch điện ly và nồng độ: dung dịch điện ly thích hợp cho CE khi
có tác dụng tốt nhất trong dãy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt
trong dung dịch ấy
- pH: pH của dung dịch điện ly có thể tác dụng lên khả năng phân tích và
làm thay đổi EOF.
1.2.3.4 Cột mao quản
Kích thước cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng đến thời
gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều dài hiệu dụng
và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng thời gian phân
tích.
1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC)
MEKC có khi còn được viết tắt là MECC (micellar electrokinetic capillary
chromatography) là một kỹ thuật bổ sung cho CZE: tách được ion và cả phân
tử trung hòa điện bằng cách thêm các chất hoạt động bề mặt vào dung dịch
13
điện di ở nồng độ trên nồng độ micelle tới hạn (critical micelle concentration
– CMC). Chất hoạt động bề mặt thường dùng là natri dodecylsulfat (SDS) có
CMC = 9mM. Và đây cũng là chất diện hoạt chúng tôi sử dụng trong nghiên

cứu này.
Phương pháp MEKC là một kiểu kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di
có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản và sắc ký lỏng
có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký của kỹ thuật CE được ứng
dụng rộng rãi trong sinh học y học và dược. MEKC là một phương pháp tách
có hiệu quả cao, chủ yếu phù hợp để phân tích các hợp chất trung hòa nhỏ. Cơ
chế tách của kỹ thuật này dựa trên sự khác biệt của cân bằng phân phối của
các hợp chất mẫu giữa pha động là dung dịch nước và pha tĩnh giả là các
micelle. Ưu điểm của MEKC là khả năng dễ dàng thay đổi các thành phần
của hệ thống,và đặc biệt có thể thay đổi pha tĩnh giả micelle. Theo đó, có thể
dễ dàng và nhanh chóng kiểm soát được pha động và tối ưu hóa độ phân giải.
Vì vậy nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử
Micell ( tiểu phân Micell – pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân
này sẽ dẫn dắt và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các
chất trên nền của dung dịch đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách
sắc ký của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật MEKC được điều
chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện ly nền.
Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và cả
trung hòa. Đối với các chất có điện tích, các micelle loại này chuyển động
hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tùy thuộc vào điện
tích của chất hoạt động bề mặt và cấu trúc của micelle. Các chất hoạt động bề
mặt anion hóa, ví dụ SDS, sẽ di chuyển về anod (cực dương), nghĩa là di
chuyển ngược chiều với hướng của dòng EOF. Trong dung dịch đệm điện di
14
có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ của
micelle, thì sự điện di thực (net movement) của micelle là theo hướng của
dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các micelle có thể tương tác với các
phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-
LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để

tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá
trình điện di.

Hình 4 : Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC
Đối với các phân tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan
vào trong micelle và ở ngoài micelle (pha động điện di) theo một cân bằng
động học có hằng số phân bố K
i
nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự
phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau của các
chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký của các chất phân tích theo kiểu micelle. Vì
thế các micelle trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh
giả. Nhiều chất tương tác với micelle khá bền, nó tồn tại trong micelle dài hơn
sự di chuyển của nó, khi các micelle mang nó một phần di chuyển ngược
chiều dòng EOF.