Tổng quan một số ứng dụng của quang phổ raman trong kiểm nghiệm dược phẩm

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ MAI LINH

TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG
CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG
KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ MAI LINH

TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG
CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG
KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
Ths. Đặng Thị Ngọc Lan

Bùi Việt Phương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến:
ThS. Đặng Thị Ngọc Lan
DS. Bùi Việt Phương
là thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và chia sẻ cho tôi
những kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉnh sửa quý báu và kịp
thời của DS. Bùi Văn Trung, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, để hoàn
chỉnh nghiên cứu này một cách tốt nhất.
Tôi xin cảm ơn bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện
cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo
và cán bộ nhân viên trường đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo
và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt 5 năm học dưới
mái trường này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình, bạn
bè, tập thể lớp N1K64 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình
học tập và hoàn thiện khóa luận.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Linh


MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ và đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN 3
1.1. Giới thiệu quang phổ Raman 3
1.1.1. Lịch sử phát triển 3
1.1.2. Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn 4
1.2. Nguyên lý cơ bản của phổ Raman 5
1.2.1. Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman 8
1.2.2. Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman 12
1.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman 13
1.3.1. Nguyên tắc hoạt động 13
1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo cơ bản 14
1.4. Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman 24
1.4.1. Ưu điểm 24
1.4.2. Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ 27
CHƯƠNG II. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC 29
2.1. Phân tích định tính 29
2.2. Phân tích định lượng 30
2.3. Ứng dụng chung của phương pháp phân tích phổ Raman trong ngành
dược………………………………………………………………………… 35


2.4. Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong kiểm tra, giám sát

chất lượng thuốc. 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46
1. Kết luận 46
2. Đề xuất 46






DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
API Active Pharmaceutical Ingredients Dược chất có hoạt tính
CCD Charge-coupled device Thiết bị tích điện kép
FT Fourier Transform Biến đổi Fourier
MS Mass spectrometry Khối phổ
NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân
NIR Near Infrared Hồng ngoại gần
IR Infrared Hồng ngoại
S/N Signal-to-noise Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
TLTK Tài liệu tham khảo
UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại-khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược
phẩm…………………………………………………………………………16
Bảng 2.1. Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ
Raman đã được công bố từ năm 2002-2006…………………………………31

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến
mẫu……………………………………………………………………… … 6
Hình 1.2 .Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng
lượng……………………………………………………………………… …7
Hình 1.3. Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl
4
………………………… 10
Hình 1.4. Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của
phân tử CO
2
………………………………………………………………….11
Hình 1.5. Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động
1
,
2
,
3

trong phân tử CO
2
……………………………………………………………11
Hình 1.6. Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes và tán xạ đối
Stokes……………………………………………………………………… 12
Hình 1.7. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman…………………………….14
Hình 1.8. Đầu đo kéo dài giúp đo mẫu bên trong các bao bì đựng lớn, trong
môi trường độc hại………………………………………………………… 17
Hình 1.9. Đầu đo nhanh giúp đo trực tiếp các mẫu đơn giản……………… 17
Hình 1.10. Bộ phận đựng mẫu hỗ trợ đo các mẫu dạng lỏng, mẫu viên…….18

Hình 1.11. Sơ đồ một detector CCD……………………………………… 20
Hình 1.12. Cấu hình 90
o
(a) và cấu hình 180
o
(b)…………………………….21
Hình 1.13.Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng
Renishaw…………………………………………………………………….22
Hình 1.14. Máy quang phổ Raman cầm tay hãng NanoRam
®
………………23


Hình 1.15. Máy quang phổ Raman cầm tay TruScan RM của hãng Thermo
Scientific…………………………………………………………………….23
Hình 1.16. Kết quả định tính của một mẫu từ máy Raman cầm tay……… 24
Hình 2.1. Công thức hóa học và phổ Raman của một số tá dược thường dùng,
và một số API……………………………………………………………… 30
Hình 2.2. Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất…………………………… 34
Hình 2.3. Phổ Raman shift Ibuprofen chuẩn……………………………… 40
Hình 2.4. Phổ Raman Shift Ibuprofen mẫu thử…………………………… 41
Hình 2.5. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Ibuprofen trên
thị trường………………………………………….…………………………42
Hình 2.6. Phổ Raman shift Sildenafil chuẩn……………………………… 43
Hình 2.7. Phổ Raman Shift Sildenafil mẫu thử…………………………… 44
Hình 2.8. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Sildenafil trên
thị trường…………………………………………………………………….45
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bên cạnh các phương pháp phân tích quang phổ thông thường được sử
dụng như phổ UV - VIS, phổ IR, khối phổ có một phương pháp phân tích
quang phổ còn khá mới mẻ trong ngành Dược, đó là quang phổ Raman.
Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30 của thế kỷ trước, nhưng do
hạn chế về khoa học kỹ thuật mà nó phát triển khá chậm. Ngày nay, với sự
tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhất là kỹ thuật laser, quang phổ Raman đang
ngày càng phát triển và cho thấy nhiều ưu thế. Trên thế giới, phương pháp
phân tích phổ Raman được áp dụng một cách hiệu quả trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như hải quan, pháp y, khảo cổ học… trong đó có trong ngành
Dược. Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật
đơn giản, dễ sử dụng đã mang lại nhiều tiềm năng lớn để khai thác kỹ thuật
phổ này trong công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và công
tác phòng chống thuốc giả với độ an toàn và hiệu quả cao.
Vậy nên, những nghiên cứu trong khóa luận này được thực hiện với mong
muốn đưa lại một cái nhìn tổng quan về phổ Raman và khả năng ứng dụng
trong ngành Dược và đặc biệt trong kiểm nghiệm Dược phẩm, nhằm tạo một
nền tảng cơ bản cho việc ứng dụng của quang phổ Raman trong điều kiện
thực tế tại Việt Nam.
Mục tiêu của khóa luận:
1. Tìm hiểu nguyên lý tổng quan về quang phổ Raman, nguyên tắc hoạt
động, nguyên tắc cấu tạo và các bộ phận chính của máy quang phổ
Raman.
2. Phân tích ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman so với
các phương pháp phân tích quang phổ khác.
2

3. Phân tích khả năng ứng dụng thực tế của quang phổ Raman trong
ngành Dược và khả năng áp dụng phương pháp quang phổ này trong
công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc.
3

Chương I. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN
1.1. Giới thiệu quang phổ Raman
1.1.1. Lịch sử phát triển
Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời
làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ,
“detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra
một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông,
hiệu ứng Raman. Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện
tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã
giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930. [11]
Theo thời gian, đã có những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị
đo đạc tán xạ Raman. Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung phát triển là
nguồn ánh sáng kích thích. Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau được
nghiên cứu (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường độ ánh
sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu. Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp
dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không
mang lại hiệu quả như mong muốn. Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt
lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích
thích cho tán xạ Raman. Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ
yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar
+
(351,1-514,5nm); Kr (337,4-
674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào sử
dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động
mạnh đến việc thu phổ Raman). [28]
Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương
đối chậm. Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang học.
Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát
4

hiện Raman. Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, tản mát, muốn ghi được
chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian
dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu. Vậy nên, mặc dù bản
chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường
hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu chất.
[28]
Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ
Raman. Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến
bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự
cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các
phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng
rãi hơn. Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ
Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay
đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát
tại thực địa các mẫu cần phân tích.
1.1.2. Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn
Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngày nay quang phổ Raman không
chỉ còn là phương pháp phân tích cơ bản sử dụng trong phòng thí nghiệm mà
còn được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau. Trong khoa học
vật liệu, quang phổ Raman giúp xác định cấu trúc vật liệu, xác định thành
phần cấu tạo trong hỗn hợp rắn. Trong pháp y, người ta sử dụng quang phổ
Raman như một công cụ hiệu quả để tìm ra các chất độc hại, gây tử vong hoặc
dùng phương pháp phổ Raman để bổ sung khẳng định kết luận pháp y. Trong
khảo cổ học, người ta dùng phổ Raman để tìm ra các kim loại, đá quý, xác
định nguồn gốc các cổ vật Trong hải quan, phổ Raman dùng để kiểm tra
nhanh phát hiện các chất cấm như ma túy, chất gây nghiện, hướng thần, chất
5

kích thích…Và đặc biệt trong ngành Dược có rất nhiều ứng dụng quan trọng

sẽ được đề cập đến ở phần sau.
1.2. Nguyên lý cơ bản của phổ Raman [1], [11], [28]
Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ
ánh sáng, thì quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ. Tán xạ này xảy ra
do va chạm giữa các photon và các phân tử. Ánh sáng tới với tần số
0
trên
một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h
0
. Ví
dụ nguồn laser có bước sóng 500 nm và công suất 1W chứa khoảng 2,5x10
18
photon trong một giây. Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng
như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử.
Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không
thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là
tán xạ Rayleigh. Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số
với ánh sáng tới.
Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử
và trao đổi năng lượng sau va chạm. Nếu phân tử nhận năng lượng h từ
photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h(
0
– ), và tần số
của photon tán xạ khi đó là
0
– . Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng
h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h(
0
+ )
và tần số của photon tán xạ là

0
+ . Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng
của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman. Và các tán xạ
có tần số
0
– và có tần số
0
+ được gọi tương ứng là “tán xạ Stokes” và
“tán xạ đối Stokes”.
6



Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu
Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu
hoặc phát xạ
 Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên
tử.
 Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết
trong phân tử.
Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman, ta khảo sát
sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử. Quá trình trao đổi năng lượng
có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của
dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo
7

sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của
các liên kết.
Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes. Tán xạ Stokes xảy ra khi
một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán

xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng
lượng kích thích. Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái
năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số. Vì vậy,
trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes.

Hình 1.2. Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng
lượng
Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay
đổi tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift”. Đối với một
chất, cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau,
chúng tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi
nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau. Vì vậy, phân
tích phổ Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên
cứu cấu trúc của chất ấy.

8

1.2.1. Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman [1], [11]
Khi một phân tử nào đó được đặt trong điện trường E của bức xạ điện từ
có tần số
0
, dưới tác dụng của điện trường có sự phân bố lại electron trong
phân tử và làm xuất hiện momen lưỡng cực P. Khi điện trường E đủ nhỏ, độ
lớn của momen lưỡng cực P và của E tỷ lệ thuận với nhau và được biểu diễn
bởi công thức sau
P = αE (1.1)
Trong đó, α là hệ số phân cực.
Trạng thái phân cực có thể tạo thành dễ dàng như là khi một đám mây
electron nào đó biến dạng. Trong hệ tọa độ không gian Oxyz, phương trình
(1.1) được viết lại như sau

(1.2)
Để đơn giản, chúng ta giả sử P và E là các giá trị trong cùng một trục tọa
độ. Thay E = E
0
cos 2πv
0
t vào phương trình (1.1) ta được:
P = α E
0
cos 2πv
0
t (1.3)
Hệ số phân cực α không phải là một hằng số mà nó có thể thay đổi trong
suốt quá trình dao động của phân tử. Chúng ta có thể chia hệ số phân cực này
thành hai thành phần, thành phần α
0
không đổi khi phân tử không dao động và
một thành phần Q (Q = Q
0
cos 2πv
0
t). Khi đó ta có:
α = α
0
+ ( )
0
Q = α
0
+ ( )
0

Q
0
cos 2πvt (1.4)
Thay (1.4) vào (1.3) ta được
9


Phương trình trên chỉ ra momen lưỡng cực P gồm có ba tần số dao động là
0
,
0
– và
0
+ . Số hạng đầu tiên chỉ ra tán xạ cùng tần số
0
với ánh sáng
tới, đó là tán xạ Rayleigh. Số hạng thứ hai biểu thị sự thay đổi tần số so với
ánh sáng tới và như được biết đó là tán xạ Stokes và đối Stokes (tán xạ
Raman).
Phương trình (1.5) chỉ ra điều kiện tiên quyết để có tán xạ Raman là yếu
tố(∂α/∂Q)
0
Q
0
E
0
không thể là 0. Tức là Q
0
hay E
0

đều không thể là 0, điều kiện
quan trọng là (∂α/∂Q)
0
≠ 0. Theo phương trình trên, hoạt động Raman chỉ là
những dao động mà có sự thay đổi độ phân cực kết hợp với dao động trong
phân tử.
Hai số hạng trong phương trình (1.5) cho ta thấy sự liên quan giữa các tán
xạ Raman (tán xạ Stokes và đối Stokes) và tỷ lệ giữa tán xạ Raman với tán xạ
Rayleigh. Bởi vì cường độ của tán xạ đối Stokes phụ thuộc vào số lượng của
những phân tử ở trạng thái kích thích ban đầu, mặt khác các phân tử này ở
trạng thái kích thích thường có nhiệt độ cao mà phân bố Boltzmann lại giảm
khi nhiệt độ của chất tăng. Chính vì vậy, tán xạ đối Stokes là ít hơn, khó thu
thập hơn và có cường độ nhỏ hơn tán xạ Stokes. Phương trình (1.5) không chỉ
ra tỷ lệ giữa ba loại tán xạ này, nhưng thực nghiệm cho thấy cả hai loại tán xạ
Raman này đều yếu hơn tán xạ Rayleigh (thường là nhỏ hơn 0,1%).
10


Hình 1.3. Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl
4
Để minh họa cho các hoạt động Raman, chúng ta cùng tìm hiểu về các
trạng thái dao động của phân tử CO
2
. Hình 1.4 miêu tả ba trạng thái dao động
của phân tử CO
2
và hình 1.5 chỉ ra sự thay đổi độ phân cực α theo các trạng
thái dao động
1
,

2
,
3
. Trong quá trình dao động IR, độ phân cực của phân
tử là không đổi, còn theo phương trình (1.5) để có hoạt động Raman thì tỷ số
(∂α/∂Q)
0
≠ 0 (độ phân cực thay đổi) nên trạng thái dao động
1
là dao động
Raman, còn trạng thái dao động
2
và
3
là dao động IR. [28]
11


Hình 1.4.Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của
phân tử CO
2


Hình 1.5. Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động
1
,
2
,
3

trong phân tử CO
2

Ví dụ trên minh họa mối quan hệ loại trừ lẫn nhau giữa các dao động IR
và Raman trong các phân tử, tuy nhiên, vẫn có sự chồng chéo giữa phổ IR và
phổ Raman. Vì vậy việc lựa chọn dải phổ đặc trưng cho các loại dao động này
là rất quan trọng.
Tóm lại dao động đối xứng kéo dài hoặc thu hẹp của các đám mây điện tử
là dao động Raman mà không phải IR. Còn các dao động uốn, rung động
12

không đối xứng (kể cả thay đổi momen lưỡng cực mà không kèm theo sự thay
đổi lớn trong các điện tử) thì hoạt động IR rất mạnh nhưng Raman lại yếu. Cả
hai loại phổ này được đặc trưng bởi các đỉnh sắc nét, rõ ràng trên phổ đồ.
1.2.2. Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman [28]
Mặc dù thuyết cổ điển giúp chúng ta dễ hình dung về hiệu ứng Raman
nhưng có vài yếu tố mà một mình thuyết cổ điển không thể giải thích được;
chỉ thông qua thuyết lượng tử chúng ta mới có thể giải thích hoàn toàn hiện
tượng này. Ví dụ, thuyết cổ điển không giải thích được sự khác nhau giữa
năng lượng photon trong tán xạ Stokes và photon trong tán xạ đối Stokes. Để
làm rõ hiệu ứng Raman bằng thuyết lượng tử, chúng ta hãy theo dõi sự thay
đổi các mức năng lượng của phân tử như trên hình 1.6.

Hình 1.6. Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes
và tán xạ đối Stokes
Khi ánh sáng tới tương tác với phân tử, từ các mức năng lượng ban đầu (m
hoặc n), phân tử bị kích thích lên mức năng lượng cao hơn là r (trạng thái kích
thích này chỉ là trạng thái kích thích các dao động trong phân tử hoặc thay đổi
hình dạng các đám mây electron mà không làm thay đổi vị trí của chúng như
phổ UV-VIS). Tiếp theo, phân tử sẽ bức xạ ra các photon để chuyển năng

lượng về trạng thái n hoặc m tương ứng (nếu ban đầu nó ở trạng thái m thì sẽ
chuyển sang trạng thái n và ngược lại).
13

Theo công thức lượng tử hóa học thì tổng cường độ ánh sáng I
mn
của tán
xạ Raman tương ứng với sự chuyển mức năng lượng từ trạng thái m sang
trạng thái n mà người ta biểu diễn ở phương trình sau:

I
mn
= (
i
±
mn
)
4
I
i
α
pσ
2
(1.6)
Trong công thức trên I
i
là cường độ của ánh sáng tới (có tần số dao động
i
); α
pσ

là hệ số phân cực của thành phần σ. Công thức trên diễn tả diễn tả
cường độ tán xạ Raman tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng tới I
i
, tỷ lệ lũy thừa
bậc bốn của hiệu tần số
i
±
mn
và bình phương của hệ số phân cực α
pσ
.
Hệ số (α
pσ
)
mn
được tính theo công thức
(
1.7)

Trong công thức trên, r bao gồm tất cả các giá trị lượng tử riêng của phân
tử; v
rm
là tần số chuyển tiếp từ m đến n; <m|µ
α
|r>, <r|µ
p
|n>,… là các thành
phần của momen lưỡng cực điện; µ
p
là một momen lưỡng cực điển p, Γ là

năng lượng giảm từ trạng thái r. Phương trình này là một công thức quan
trọng để giải thích tán xạ Raman và nó được biết như là “phương trình của tán
sắc Kramers-Heisenberg-Dirac”.
1.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman
1.3.1. Nguyên tắc hoạt động [6]
Mẫu phân tích sau khi được kích thích bởi bức xạ laser sẽ phát ra ánh sáng
tán xạ. Tán xạ Raman được thu lại cùng với các bức xạ khác qua hệ kính hiển
vi và đưa tất cả các bức xạ này cùng vào hệ quang. Hệ quang sẽ phân tách và
loại bỏ các bức xạ tạp, chọn lọc và đưa tín hiệu Raman vào dectector.
14

Detector ghi lại các tín hiệu Raman, sau đó thông qua bộ phận xử số liệu, các
tín hiệu quang được biến đổi thành tín hiệu điện tử và cho ta phổ Raman của
mẫu phân tích.
1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo cơ bản
Máy quang phổ Raman được phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản
xuất khác nhau. Nhưng về cơ bản nó bao gồm năm bộ phận sau: Nguồn laser,
bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detector, hệ quang. Hình 1.9 mô tả các bộ
phận cơ bản của máy quang phổ Raman.

Hình 1.7: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman
1.3.2.1. Nguồn laser [11], [28]
Khi sử dụng nguồn laser kích thích, vấn đề quan trọng nhất được đặt ra đó
là nó có gây ra hiện tượng huỳnh quang đối với mẫu phân tích hay không.
Trong trường hợp khả năng xảy ra huỳnh quang cao thì laser NIR sẽ là sự lựa
chọn thích hợp. Có nhiều loại laser với bước sóng đủ cao để giảm bớt hiện
tượng huỳnh quang nhưng nguồn laser hay được dùng nhất là nguồn laser
xung quang vùng 780 nm. Đây là loại laser được tạo ra dựa trên sự phát
15

quang từ các nút bán dẫn. Loại nguồn laser này thường được thiết kế nhỏ gọn,
giá thành rẻ và có khả năng kích thích được cho nhiều loại mẫu khác nhau. Vì
vậy mà loại laser này ngày càng được phổ biến trong các máy quang phổ
Raman, nhất là trong các máy quang phổ Raman cầm tay. Một loại laser khác
được sử dụng đó là laser Nd: YAG (Neodymium-YAG), nguồn laser này cho
bước sóng 1064 nm và thường được sử dụng trong các máy FT-Raman. [11],
[28]
Đối với những mẫu phát huỳnh quang yếu thì người ta sử dụng các nguồn
laser với bước sóng khoảng 470-650 nm. Các nguồn laser này thường dựa
trên ion Ar
+
. Có một số loại khác được dùng đó là laser He-Ne hoặc Kr
+
. Tất
cả các loại này đều có thể cung cấp một nguồn laser với công suất lớn, dễ xảy
ra hiện tượng phá hủy mẫu khi đo. [11]
Các tính năng chính của hai nhóm laser trên đó là: Nguồn laser với bước
sóng kích thích trong vùng nhìn thấy thường cho tín hiệu tốt hơn (hệ số
signal-to-noise: S/N cao hơn), do đó tín hiệu dễ phát hiện hơn bởi vì dòng
photon Raman mạnh, nhờ thế mà detector đi cùng với nó thường đơn giản và
có giá thành rẻ. Tuy nhiên, sử dụng nguồn laser này có một số nhược điểm là
có thể xảy ra hiện tượng huỳnh quang làm che phủ tín hiệu Raman và vì năng
lượng lớn nên mẫu phân tích dễ bị phá hủy. Đối với nguồn laser kích thích
trong vùng NIR thì cho tín hiệu Raman thấp hơn trên Detector vì vậy mà
detector cần phải tinh vi và được tối ưu hóa. Các thiết bị sử dụng với nguồn
laser này ít nhạy hơn các thiết bị sử dụng với laser trong vùng nhìn thấy.
Nhưng bù lại, tín hiệu đường nền có xu hướng thấp hơn, vì vậy việc ghi tín
hiệu Raman dễ dàng hơn. [28]
Với những phân tích trên, laser NIR thường được dùng cho các mẫu sinh
học. Bởi vì các thành phần của mẫu thường phát huỳnh quang và nó làm giảm

nguy cơ phá hủy mẫu. Ngược lại, do có độ nhạy cao hơn với trang thiết bị đơn
16

giản hơn, laser với nguồn kích thích trong vùng nhìn thấy được sử dụng để
phân tích các nguyên vật liệu không có bản chất sinh học, nhất là công nghệ
dược phẩm và trong các điều kiện sản xuất đặc biệt, thực phẩm chức năng.
Ngoài hiệu quả sử dụng, các vấn đề an toàn cho người sử dụng đang được
quan tâm và nó định hướng cho sự phát triển của các loại nguồn laser hiện
đại.
Bảng 1.1. Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược phẩm [29]
Nguồn
laser (nm)
Loại
Công suất
nguồn
Dải Raman
(cm
-1
)
Chú thích
NIR laser
1064
Dạng rắn
(Nd:YAG)
Lên tới 3 W
1075-1563
Thường được sử dụng với
thiết bị FT-Raman
830
Diode

Lên tới 300
mW
827-980
Ít phổ biến hơn các nguồn
laser khác
785
Diode
Tới 500 mW
791-1027
Được sử dụng rộng rãi
nhất
VIS Laser
632.8
He-Ne
Tới 500 mW
637-781
Nguy cơ huỳnh quang thấp
532
Doubled
(Nd:YAG)
Tới 1 W
535-632.8
Nguy cơ huỳnh quang cao
514.5
Ar
+
Tới 1 W
517-608
Nguy cơ huỳnh quang cao
488-632.8

Ar
+
Tới 1 W
490-572
Nguy cơ huỳnh quang cao