Tổng quan về các đột biến gen mã hóa CYP2D6

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ MINH TẤN
TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN
MÃ HÓA CYP2D6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



HỒ MINH TẤN
TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN
MÃ HÓA CYP2D6
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Xuân Bắc

Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Sinh




HÀ NỘI – 2013




LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho tôi xin được gửi tới Ths. Nguyễn Xuân Bắc lời biết ơn chân
thành và sâu sắc. Thầy là người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa Sinh Trường Đại học Dược Hà
Nội, các dược sỹ và bác sỹ trong bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 đã giúp đỡ
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin dành những lời tri ân tới những người thân trong gia đình và
bạn bè đã luôn luôn động viên, cổ vũ tôi vượt qua những khó khăn mà có lúc tưởng
chừng như muốn bỏ cuộc, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình.

Hà Nội, ngày 21/5/2013
Hồ Minh Tấn

MỤC LỤC

Trang
Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6 2
1.1. CYTOCHROM
− P450
2
1.1.1. Phân bố 3
1.1.2. Phân loại và danh pháp 3
1.1.3. Cơ chế xúc tác của CYP 4
1.2. CYP2D6 6
1.2.1. Cấu trúc của CYP2D6 7
1.2.2. Cơ chế tác dụng của CYP2D6 8
1.2.3. Cơ chất của CYP2D6 9
1.3. GEN MÃ HÓA CYP2D6 15
CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 16
2.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN 16

2.1.1. Các loại đột biến 17
2.1.2. Nguyên nhân đột biến 20


2.2. NHỮNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 25
2.2.1. Những allen của gen CYP2D6 25
2.2.2.Kiểu hình và kiểu gen CYP2D6 của các chủng tộc trên thế giới 37
2.3. HẬU QUẢ LÂM SÀNG CỦA TƯƠNG TÁC KIỂU GEN – KIỂU HÌNH
CỦA CYP2D6 38
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 43
3.1. KỸ THUẬT ADN CHIP 43
3.1.1. Nguyên tắc: 43
3.1.2. Ưu điểm: 44
3.1.3. Nhược điểm: 45
3.2. KỸ THUẬT LONG-PCR 45
3.2.1. Nguyên tắc 45
3.2.2. Ưu điểm 45
3.3.3. Nhược điểm 45
3.3.4. Áp dụng xác định sự nhân đôi gen CYP2D6 46
3.3. KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 47
3.3.1. Nguyên tắc: 47
3.3.2. Ưu điểm 48
3.3.3. Nhược điểm 48
3.3.4. Áp dụng xác định đột biến CYP2D6 48
3.4. KỸ THUẬT PCR-RFLP 49


3.4.1. Nguyên tắc 49
3.4.2. Ưu điểm 51
3.4.3. Nhược điểm: 51

3.4.4. Áp dụng trên CYP2D6 51
3.5. KỸ THUẬT PCR PHỨC HỢP 52
3.5.1. Nguyên tắc: 52
3.5.2. Ưu điểm 53
3.5.3. Nhược điểm 53
3.5.4. Áp dụng trên CYP2D6 giúp chẩn đoán allen *5 và allen*10 53
3.6. MỘT SỐ KỸ THUẬT KHÁC GIÚP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN CYP2D6 56
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 56
4.1. HIỆN TƯỢNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 56
4.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH CYP2D6 TRÊN THẾ GIỚI 57
4.3. ĐỀ XUẤT HƯỚNG NGHIÊN CỨU CYP2D6 Ở VIỆT NAM 58
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN 59












DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
KÝ HIỆU/CHỮ TÊN TIẾNG ANH
TÊN TIẾNG VIỆT
(nếu có)
ADN Deoxyribonucleic Acid
ADR Adverse Drug Reaction

Phản ứng bất lợi của
thuốc
ARN Ribonucleotic Acid
CL
int
Clearance instrict
Độ thanh thải nội tại
gan
CYP Cytochrom P450
EM Extensive metabolism Chuyển hóa nhanh
FADH
2
Flavin Adenine Dinucleotide
FDA
Food and Drug
Administration
Cục quản lý thực phẩm
và dược phẩm Hoa Kỳ
IM Intermediate metabolism Chuyển hóa chậm
kb Kilo base
MR Metabolic ratio Tỷ lệ chuyển hóa
NADPH
Nicotinamide Adenine
Dinucleotide Phosphate

PCR Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại
gen
PM Poor metabolizer Chuyển hóa rất chậm
SNP

Single nucleotide
polymorphism
Đa hình đơn nucleotid
UM Ultra metabolism Chuyển hóa siêu nhanh







DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của đa hình di truyền CYP2D6 lên một số thuốc điều trị 38
Bảng 3.1. Các mồi và enzym cắt tương ứng từng allen [79] 50

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. Tỷ lệ chuyển hóa thuốc bởi các CYP [65] 4
Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1] 5
Hình 3. Mô hình phân tử CY2D6 [100] 7
Hình 4. Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100] 7
Hình 5. Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68] 9
Hình 6. Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105] 12
Hình 7. Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37] 15
Hình 8 Mô tả các loại đột biến điểm [2] 19
Hình 9 Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [2] 20
Hình 10. Hình thành gen lai [33] 29
Hình 11. Sự lặp lại một hay nhiều lần và xóa toàn bộ gen CYP2D6 [43] 36
Hình 12. Kiểu gen CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 37

Hình 13. Kiểu hình của CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 38
Hình 14. Phân loại kiểu hình dựa trên kiểu gen và hậu quả lâm sàng dựa vào kiểu
xúc tác bởi hiện tượng đa hình enzym [109] 39


Hình 15. Sơ đồ minh họa một AND chip [118] 44
Hình 16. Sản phẩm Long-PCR [95] 46
Hình 17. Phổ điện di [95] 47
Hình 18. Mồi và trình tự mồi [82] 49
Hình 19. PCR-RFLP chẩn đoán đột biến 360C>G trên gen mã hóa enzym
deoxycytidin kinase [144] 50
Hình 20. Các allen CYP2D6 [84] 53
Hình 21. Chẩn đoán kiểu gen bằng kỹ thuật PCR truyền thống và PCR phức hợp
[84] 55

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vào cuối những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện và tập
trung nghiên cứu một hệ thống enzym có vai trò vô cùng quan trọng đối với con
người, đó là hệ thống cytochrom P450 hay còn được gọi là CYP450. Hệ thống
enzym này là tác nhân xúc tác chuyển hóa cho các chất nội sinh như các steroid,
cholesterol, các acid mật…cũng như các chất ngoại sinh có cấu trúc khác nhau
trong đó có các chất độc, chất gây ung thư và đặc biệt là chuyển hóa thuốc. Hiện
nay người ta đã phát hiện được 57 isozym trên hệ thống CYP450 ở người và chia nó
thành các họ và phân họ khác nhau.
Trong số những isozym này, CYP2D6 giành được sự quan tâm đặc biệt. Bởi
lẽ, dù chỉ đứng thứ hai về mặt số lượng các thuốc chuyển hóa nhưng CYP2D6 lại là
một trong những enzym có hiện tượng đa hình phổ biến nhất. Và những hậu quả của
hiện tượng này nhiều khi rất nghiêm trọng. Hơn thế nữa các nhóm thuốc điều trị
được enzym này chuyển hóa như tim mạch, giảm đau, thần kinh, ung thư là những
nhóm thuốc rất phổ biến hiện nay và có cửa sổ điều trị hẹp. Do đó, việc hiểu biết về
CYP2D6 trên các phương diện: các đột biến gen, những biến đổi ở kiểu hình, hậu
quả lâm sàng kèm theo và các phương pháp phát hiện đột biến là cần thiết, góp phần
vào việc “tối ưu hóa điều trị”.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Tổng quan về các đột biến gen mã hóa CYP2D6” với những mục tiêu sau:
1. Tìm hiểu các đột biến gen mã hóa CYP2D6 đã được phát hiện.
2. Tìm hiểu về các phương pháp phát hiện đột biến gen CYP2D6.

2

CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6
1.1. CYTOCHROM − P450
Cytochrom – P450 (Cyt-P450) là enzym mới được phát hiện cách nay khoảng
60 năm. Đây là một enzym oxy hóa cuối cùng của hệ thống monooxygenase (phản
ứng oxy hóa sử dụng một nguyên tử oxy), tham gia phản ứng oxy hóa rất nhiều hợp
chất khác nhau và có vai trò rất quan trọng trong chuyển hóa những chất có nhân
thơm (gồm cả chất nội sinh ưa mỡ như steroid, acid béo, những vitamin tan trong
dầu mỡ, prostaglandin, leukotrien, thromboxan và những chất ngoại sinh).
Cytochrom – P450 thuộc nhóm b theo cách phân loại của D. Keilin [53]. Enzym
này đã được phát hiện từ những năm 1940 trong khi các nhà khoa học đang tìm
cách giải thích cho một loại phản ứng không bình thường có sự tham gia của phân
tử oxy. Trong những phản ứng này, một nguyên tử oxy liên kết với hai nguyên tử
hydro (được cho từ hai phân tử NADPH) để tạo thành H
2
O, trong khi nguyên tử oxy
thứ hai được gắn vào cơ chất (kí hiệu là RH). Phản ứng có thể được biểu diễn theo
công thức sau:
2 NAD(P)H
+
+ O
2
+ RH → 2 NAD(P)
+
+ H
2
O + ROH
Cytochrom – P450 khác biệt với các Cytochrom khác ở chỗ chúng chuyển
thẳng điện tử đến phân tử oxy còn cytochrom khác chuyển điện tử đến các protein,

và có sóng hấp thụ cực đại ở 450nm khi gắn với CO. Sự có mặt của một chất màu
phản ứng với CO và đi kèm với cytochrom b5 trong microsom đã được phát hiện
bởi G.R.William vào năm 1955 và Garfinkel (1958) trong quỹ học bổng Johnson và
bởi Klingenberg [59]. Chất màu này được đặc trưng bởi một băng hấp thụ của hợp
chất với CO ở 450 nm, vì vậy gọi là P450. Để đơn giản và thống nhất về mặt thuật
ngữ, người ta qui ước dùng chữ CYP thay cho Cyt-P450. Sau đó, Sato và Omura
(1962,1964) đã xác định bản chất hem của nhóm ngoại của nó. Loại protein chứa
hem có mặt trong microsom mới được phát hiện này có những thuộc tính riêng biệt
đã được xác định là một enzym oxy hóa cuối cùng của nhiều phản ứng oxy hóa
khác nhau tham gia vào một số quá trình chuyển hóa quan trọng ở cơ thể động vật:
3

sinh vật tổng hợp hormon steroid, acid mật từ cholesterol và chuyển hóa thuốc [85,
86].
1.1.1. Phân bố
CYP là hệ enzym gắn màng có ở hầu hết các mô trong cơ thể, trong đó tập
trung nồng độ cao chủ yếu ở vi thể trên lưới nội sinh chất nhẵn của tế bào gan và
một lượng ít hơn ở ruột non, phổi, thận và não.
Ở người, CYP tập trung nhiều nhất ở tế bào gan. CYP cũng được tìm thấy
trong ti thể của thượng thận chuột cống và ở ti thể vỏ thượng thận bò [56, 132].
Người ta cũng phát hiện ra rằng CYP không chỉ có ở vi thể và ti thể của động vật có
vú mà còn phân bố rộng rãi ở các dạng tồn tại khác nhau của sự sống bao gồm:
động vật và vi sinh vật. Những nghiên cứu về CYP tăng lên đặc biệt nhanh chóng
trong nửa sau của những năm 1960, khi những nghiên cứu được tập trung chủ yếu
vào chức năng của CYP trong chuyển hóa thuốc ở vi thể gan. Vai trò của CYP trong
sự hoạt hóa các chất gây ung thư khác nhau (carcinogen) đã được khẳng định vào
đầu những năm 1970 và nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu các hóa chất gây ung
thư chuyển sang nghiên cứu CYP, mang lại sự phát triển vượt bậc lần thứ hai trong
lĩnh vực nghiên cứu này. Sự phát triển quan trọng tiếp theo là những nghiên cứu
làm sạch CYP từ vi thể và ti thể và dẫn tới việc tinh chế và đặc trưng được nhiều

dạng khác nhau của CYP nguồn gốc động vật. Hầu hết những dạng đã tinh thế này
đều tham gia vào sự chuyển hóa của những chất nội sinh khác nhau, khẳng định vai
trò thiết yếu của CYP trong sự chuyển hóa bình thường ở động vật [77].
1.1.2. Phân loại và danh pháp
CYP là tên chung của một “đại gia đình” các enzym gồm nhiều isozym có
trọng lượng phân tử khoảng 45-60 kDa, trong đó có chứa một nhân Hem ở dạng Fe
protoporphyirin IX và một chuỗi polypeptid. Hệ gen người có 57 gen và 33
pseudogen mã hóa CYP. Các isozym được sắp xếp lại thành họ và trong họ lại được
chia thêm thành các phân họ theo sự tương đồng của chuỗi acid amin trong phân tử.
Các họ có ít nhất 40% trình tự giống nhau, trong khi đó các phân họ tỷ lệ này ít nhất
4

là 55%. Mỗi họ được ký hiệu bởi một chữ số (ví dụ CYP2), mỗi phân họ được ký
hiệu bởi một chữ cái viết hoa (ví dụ CYP2D) và gen đơn hoặc isozym được biểu thị
bởi chữ số thứ hai ( ví dụ CYP2D6). Ngoài ra, người ta còn sử dụng chữ số thứ ba (
được ngăn cách với chữ số biểu thị isozym cụ thể bởi một dấu hoa thị *) để biểu
diễn cho vị trí allen (dạng biến đổi của gen) [107].
Ví dụ:
CYP Họ Phân họ Isozym Allen
Trong 30 họ được phân loại, chỉ có 3 họ CYP là CYP1, CYP2, CYP3 chịu
trách nhiệm chuyển hóa phần lớn các thuốc, trong đó riêng 6 enzym 1A2, 3A4,
2C9, 2C19, 2D6 và 2E1 đã đảm nhận chuyển hóa hơn 90% thuốc các thuốc điều trị
[65, 94].

Hình 1. Tỷ lệ chuyển hóa thuốc bởi các CYP [65]
1.1.3. Cơ chế xúc tác của CYP
Cơ chế phản ứng vòng được đề xuất cho phản ứng oxygen hóa bởi CYP. Theo
quan điểm chung, một chu trình phản ứng oxy hóa cơ chất của hệ thống CYP có thể
chia thành 6 bước chính như sau:

5


Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1]
 Bước 1: Cơ chất được gắn vào CYP (dạng oxy hóa) tạo ra hỗn hợp enzym-cơ
chất. Sự gắn cơ chất này làm biến đổi đương lượng từ của CYP từ trạng thái spin
thấp (low spin). Sự biến đổi thế năng oxy hóa được gây ra bằng cách đó sẽ tạo
thuận lợi cho việc chuyển của điện tử thứ nhất.
 Bước 2: Là bước nhận điện tử thứ nhất từ NADPH dưới tác dụng xúc tác của
enzym Cyt-P450-reductase (hoặc từ một loại protein chứa sắt- lưu huỳnh (2Fe-2S)
gọi là adrenodoxin trong cơ thể vi sinh vật) tạo thành hỗn hợp enzym-cơ chất dạng
khử.
6

 Bước 3: Hỗn hợp enzym-cơ chất trên gắn với một phân tử O
2
. Trong hỗn hợp
này mới có sự chuyển điện tử nội phân tử để tạo thành hỗn hợp enzym-cơ chất,
trong đó sắt ở dạng oxy hóa gắn với O
2
-
.
 Bước 4: Hỗn hợp vừa tạo thành nhận điện tiếp điện tử thứ 2 từ phân tử
NADPH thứ hai do NADPH-reductase xúc tác hoặc từ NADH (xúc tác bởi NADH-
Cytochrom b
5
reductase và Cytochrom b
5
), ở vi sinh vật bước này do adrenoxin xúc
tác. Hai điện tử nhận được khử phân tử O

2
trong hỗn hợp enzym-cơ chất thành hợp
chất trung gian peroxo (RH) Fe
3+
-(O
2

).
 Bước 5: Oxy được hoạt hóa sẽ phản ứng với 2H
+
(do 2 phân tử NADHP
+

cung cấp) tạo thành phân tử nước tách ra khỏi hợp chất trung gian trên, còn lại hợp
chất (RH) (Fe-O)
3+
.
 Bước 6: Là sự oxy hóa cơ chất bằng nguyên tử oxy còn lại và giải phóng cơ
chất ở dạng oxy hóa, enzym CYP trở về trạng thái Fe
+3
ban đầu (dạng oxy hóa),
hoàn thành một chu kì phản ứng. Sản phẩm tạo ra là cơ chất được oxy hóa và một
phân tử nước [1, 77].
1.2. CYP2D6
CYP2D6 được phát hiện bởi Robert Smith trường đại học Y Saint Mary. Khi
tham gia tình nguyện thử thuốc hạ áp debrisoquin, Smith đã bị ảnh hưởng lớn tới
sức khỏe và điều đó giúp ông phát hiện ra mình bị thiếu hụt CYP2D6 [1].
CYP2D6 đóng vai trò như một enzym oxy hóa một nguyên tử oxy (mono-
oxygenase) thường được tìm thấy ở trong các vi thể gan. Và nó chuyển hóa tới 30
% thuốc. Các nhóm thuốc quan trọng được enzym này chuyển hóa là : thuốc điều trị

trầm cảm, thuốc chẹn Beta và thuốc giảm đau. Đặc điểm của các thuốc này là
những chất thân dầu với một nhóm amin đã được proton hóa và một vòng thơm
[13]. Sự sáng tỏ về cấu trúc tinh thể của CYP2D6 và việc FDA phê duyệt việc thí
nghiệm kiểm tra gen đã đưa việc nghiên cứu về enzym này lên vị trí mũi nhọn [28,
119].
7

1.2.1. Cấu trúc của CYP2D6
Phân tử CYP2D6 là một protein gồm 479 acid amin, chứa một nhóm heme, ID
trong dữ liệu Ngân hàng protein: 2f9q [100]. (hình 3). CYP2D6 có một vị trí hoạt
động, nằm phía trên nhóm hem. (hình 4)


Hình 3. Mô hình phân tử CY2D6 [100]

Hình 4. Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100]
8

Các acid amin xoắn lại ở vùng tiếp nhận và gắn cơ chất là Asp301 (D301), Glu216
(E216), Phe483 (F483) và Phe120 (F120). (hình 4). Vai trò rất quan trọng của
D301, E216, F120 và F483 đó là nhận biết và gắn cơ chất. Trong đó D301 và E216
giúp gắn kết cơ chất. Còn F483 và F120 còn lại điều khiển sự liên kết phân tử cơ
chất ở vị trí hoạt hóa [91].
CYP2D6 được phát triển sau khi trẻ được sinh ra. CYP2D6 hoặc hoạt tính của
nó không được phát hiện ở các tế bào gan của thai nhi mặc dù ARN CYP2D6 tăng
lên cùng với sự phát triển của bào thai. Lượng CYP2D6 cùng với hoạt tính của nó
không liên quan đến tuổi của thai nhi và tăng lên cùng với sự phát triển của trẻ sau
khi ra đời. Sau khi sinh 7 ngày, hoạt tính enzym này xấp xỉ bằng 25% so với người
trưởng thành. Và khi một tuổi hoạt tính CYP2D6 ở gan bằng với mức ở người
trưởng thành [80].

1.2.2. Cơ chế tác dụng của CYP2D6
Chức năng chính của CYP2D6 là oxy hóa thuốc thông qua cung cấp electron
đầu tiên từ việc tương tác với phức hợp hem-oxy. (Hình 5) Phản ứng xúc tác liên
quan đến sự chèn một nguyên tử oxy vào phân tử chất nền và nguyên tử oxy thứ
hai thì được chuyển thành nước.
Nguồn electron được cung cấp từ phức hợp khử NADPH - cytochrom P450,
đây là một flavoenzym cái chứa 1 phân tử của mỗi coenzym, flavin adenin
dinucleotid (FAD) và flavin mononucleotid ( FMN) [55]. FAD nhận electron từ
NADPH và giảm thế, FADH chuyển electron tới FMN,[87]. Sau đó electron được
chuyển từ FMNH
-
tới phức hợp hem, làm giảm hóa trị của sắt từ +3 xuống +2.
Vùng liên kết của CYP ở dạng khử này được tìm thấy ở đầu C tận của CYP2D6.
Vùng này chủ yếu chứa những vị trí cơ bản, kết nối CYP ở dạng khử thông qua
các cầu muối với Arg-440 đóng một vai trò kết nối rất quan trọng [6]. Phản ứng oxy
hóa được khởi động bởi sự hoạt hóa một phân tử oxy thông qua ion sắt 2. Phản ứng
hydroxyl hóa này xảy ra ở vùng 5-7 A
˚
so với nguyên tử Ni tơ trong phân tử chất
nền. Điều này tạo ra cặp sắt – oxy hoạt hóa, chính phức hợp này phản ứng lại với
các phân tử thuốc thông qua nhiều cơ chế khác nhau [41].
9

Hai phức hợp phản ứng sắt – oxy chính liên quan tới phản ứng li giải là phức
hợp ái điện tử “ sắt- hydroperoxo và sắt – oxo” [104]. Loại “sắt – hydroperoxo”
được hình thành bởi phức hợp “ dioxygen- Fe
2+
”, sắt- peroxo.( Như hình 5). Phức
hợp sắt – oxo làm tách liên kết O – O. Cơ chế phản ứng đòi hỏi sự giải phóng hợp
chất trung gian, mặc dù điều này vẫn còn nhiều sự tranh cãi [68].

Hình 5. Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68]
1.2.3. Cơ chất của CYP2D6
1.2.3.1. Cơ chất mẫu của CYP2D6
Cơ chất mẫu của CYP2D6 thường là những thuốc đã được dùng điều trị từ rất
lâu (tới nay có thể không còn dùng để điều trị nữa) và được chuyển hóa thông qua
CYP2D6. Sự thay đổi trên CYP2D6 sẽ ảnh hưởng rất lớn tới tác dụng điều trị của
các thuốc. Khi các nhà khoa học biết được điều này cùng với sự ra đời của các
phương pháp pháp hiện đột biến trên gen, họ đã tìm cách đưa ra mối quan hệ về
kiểu gen và kiểu hình CYP2D6. Do đó mà các thuốc này được lựa chọn làm chất để
phân loại các kiểu hình chuyển hóa nhanh (EM), chuyển hóa chậm (IM), chuyển
10

hóa siêu nhanh (UM) và chuyển hóa rất chậm (PM). Sự phân biệt này sẽ được trình
bày cụ thể ở mục 2.3.
a. Spartein
Spartein và debrisoquin là hai cơ chất đầu tiên được nghiên cứu và nó cũng
được sử dụng rộng rãi để xác định kiểu hình chuyển hóa chậm (PM) của CYP2D6
[138]. Những nghiên cứu sớm chỉ ra rằng spartein chuyển hóa chủ yếu bởi một hệ
thống các CYP thành một “N-oxid”. “N-oxid” tiếp tục phản ứng, và bị mất nước để
trở thành 2-dehydrospartein (ví dụ: 2,3-didehydrospartein) và 5- dehydrospartein (ví
dụ: 5,6 –didehydrospartein). So sánh sự tạo thành 2-dehydrospartein ở vi thể gan
người từ hai kiểu hình EM (MR < 2) và PM (MR > 20) đã chỉ ra hơn sự hơn kém
nhau 32 lần đối với giá trị của hằng số thải trừ K
m
giữa EM và PM (58.3 và 1880
micromol/L ) [89].
Với tỷ lệ chuyển hóa của spartein (MR) = spartein thải trừ qua nước tiểu ÷ (
2-dehydrospartein và 5- dehydrospartein thải trừ qua nước tiểu).

Ở kiểu hình PM, sự thải trừ spartein phụ thuộc hoàn toàn vào sự thải trừ của
thận với tỷ lệ thải trừ 99,9% liều dùng qua thận ở dạng không thay đổi. Ở kiểu hình
EM có sự tăng lên 30% chất chuyển hóa của spartein sau khi dùng rifampicin ở liệu
pháp điều trị 600 hoặc 1200 mg trong 7 ngày, trong khi rifampicin không ảnh
hưởng tới thải trừ spartein ở kiểu hình PM [22]. Mặc dù spartein chuyển hóa chủ
yếu bởi CYP2D6 (>85%) [21, 23, 69], nó cũng bị chuyển hóa bởi những CYP
không được xác định. Có thể những CYP này bị giảm tác dụng bởi rifampicin. Điều
này có thể giải thích được sự tăng thải trừ toàn phần spartein ở kiểu hình EM. Cả
EM và PM đều không bị ảnh hưởng bởi liệu pháp điều trị bằng pentobarbital
(phenobarbi-ton) một tác nhân gây cảm ứng mạnh tới CYP2B6 [66]. Tác động
không đáng kể của những enzym cảm ứng điển hình đối với sự chuyển hóa spartein
chỉ ra rằng những enzym này chịu tác động chủ yếu do gen. Những ca nghiên cứu
xa hơn nữa xác định rằng sự khiếm khuyết chuyển hóa spartein là do những đột
biến gen CYP2D6.

11


b. Debrisoquin
Debrisoquin là thuốc điều trị tăng huyết áp và được chuyển hóa chủ yếu bởi
CYP2D6 (CYP2D6 còn được gọi là tác nhân hydroxyl hóa debrisoquin). Các chất
chuyển hóa của nó là: 4-hydroxy-debrisoquin, 3-hydroxydebrisoquin và 1-
hydroxydebrisoquin [24]. Mahgoub và cộng sự báo cáo một trường hợp thải trừ
60.8% liều ban đầu dưới dạng nguyên vẹn và chỉ 5.4% dưới dạng 4-
hydrodebrisoquin, chỉ số MR là 11.3 [67]. Một chuỗi các nghiên cứu đã chỉ ra rằng
trường hợp này là một kiểu hình PM, trong khi đó 3 trường hợp khác trong ca
nghiên cứu này chỉ có MR ở mức 0.5 – 1.4 điển hình của kiểu hình EM. Tỷ lệ
chuyển hóa (MR) của debrisoquin (lượng debrisoquin / lượng 4-
hydroxydebrisoquin trong nước tiểu thu thập trong 8h) dùng để xác định kiểu hình
của CYP2D6. Ở quần thể người da trắng mức MR >12.6 được xác định là kiểu

hình PM, còn mức MR < 12.6 được xác định là kiểu hình EM. Có ít hơn 1% người
châu Á được phân loại là PM nếu sử dụng MR của debrisoquin = 12.6 là mức để
đánh giá [8]. Phân bố tỷ lệ chuyển hóa debrisoquin thay đổi cao hơn ở những người
châu Á có kiểu hình EM so với người da trắng có kiểu hình EM. Các thí nghiệm
kiểm tra kiểu hình sử dụng spartein hoặc debrisoquin có giá rẻ và đáng tin cậy tuy
nhiên ngày nay không còn dùng nữa.
c. Dextromethorphan
Dextromethorphan một chất tổng hợp tương tự thuốc giảm đau gây nghiện
được sử dụng như một thuốc giảm ho không cần kê đơn. Ở người nó được thải trừ
12

chủ yếu dạng nguyên vẹn và dextrorphan có tác dụng dược lý ( hình 6).

Hình 6. Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105]
Sự hình thành dextrorphan từ dextromethorphan chủ yếu do CYP2D6 thông
qua việc cắt bỏ nhóm methyl qua cầu nối oxy [18, 49]. Do đó dextromethorphan
ngày nay được sử dụng như là một cơ chất mẫu để xác định hoạt tính CYP2D6 cả ở
in vivo và in vitro. Tùy thuộc quần thể, chủng tộc mà biểu đồ tần số phân bố, giá trị
phản ánh mà có các giá trị MR tiêu chuẩn (antimode) khác nhau. Giá trị MR nước
tiểu = 0.3 khi sử dụng dextromethorphan làm thuốc thử để phân loại EM và PM ở
người da trắng, giá trị này cũng được áp dụng cho các quần thể khác [105]. Còn đối
với MR huyết thanh giá trị sử dụng là 0.126. Tuy nhiên có sự chồng chéo giữa kiểu
hình IM và EM khi sử dụng giá trị “antimode” bằng 0.03 [60].
d. Bufuralol
Bufuralol là một thuốc chẹn β rất hay được sử dụng làm chất mẫu trong các
thí nghiệm kiểm tra CYP2D6 in vitro. Nó được chuyển hóa thành 3 chất: 1’-
hydroxybufuralol, 1’-oxobufuralol và 1’,2’-ethenylbufuralol. Nồng độ 1’-
hydroxybufuralol - chất chuyển hóa chính của bufuralol, thường được định lượng
13

như là một chỉ số để đánh giá hoạt tính hoặc mức độ của CYP2D6 và lượng 1’-
hydroxybufuralol tạo thành từ bufuralol ở kiểu hình PM của CYP2D6 là rất thấp.
Tuy nhiên, chính bufuralol chứ không phải spartein hay debrisoquin được chuyển
hóa rất mạnh bởi CYP2C19 và một phần bởi CYP1A2, điều này có thể ảnh hưởng
đến sự đặc trưng của nó như một cơ chất mẫu của CYP2D6 [133]. Ngoài ra, S-
metoprolol cũng được sử dụng để làm chất mồi cho CYP2D6 nhưng ở qui mô nhỏ
hơn.
e. Tramadol
Tramadol là một thuốc giảm đau gây nghiện kiểu aminocyclo-hexanol, có hai
trung tâm bất đối xứng cũng được sử dụng làm cơ chất mẫu cho CYP2D6. (-)-
tramadol được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 thành O-desmethyltramadol (M1)
trong khi (+)-tramadol thì được chuyển hóa ít hơn. Một chất chuyển hóa khác của
tramadol là N-desmethyl-tramadol (M2). Những ca nghiên cứu in vitro đã chỉ ra
rằng tramadol chủ yếu chuyển hóa thành M1 bởi CYP2D6 và thành M2 bởi
CYP2B6 và 3A4 [90, 117].
Giữa 5 loại cơ chất mẫu trên của CYP2D6 thì dextromethorphan và bufuralol
là hai chất được sử dụng rộng rãi trong điều kiện in vitro với tỷ lệ sử dụng bufuralol
là 60% và dextromethorphan là 30% [136].
1.2.3.2. Thuốc điều trị là cơ chất của CYP2D6
a. Các thuốc tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
CYP2D6 có thể chuyển hóa một số lượng lớn thuốc có đích tác dụng là hệ
thần kinh trung ương và trong chúng có nhiều thuốc với trị số điều trị hẹp [36, 141,
142]. Những thuốc này bao gồm: thuốc điều trị trầm cảm ba vòng (như: amitriptylin
[124], clomipramin [83], imipramin [123], doxepin [42], thuốc ức chế chọn lọc thu
hồi serotonin (SSRI; như là: fluoxetin, fluvoxamin, paroxetin và sertralin), những
thuốc điều trị trầm cảm không vòng khác (như là: atomoxetin, maprotilin, mianserin
và venlafaxin ), thuốc điều trị rối loạn tâm thần (như : chlorpromazin, perphenazin,
thioridazin, zotepin, zuclopenthixol, risperidon và haloperidol ), nhóm opioid (như
là: codein, dihydrocodein và tramadol ). Thuốc chống nôn như là tropisetron,
14

ondansetron, dolasetron và metoclopramid cũng được CYP2D6 chuyển hóa. Tuy
nhiên những CYP khác nhau thì đảm nhận vai trò khác nhau, chúng có thể đảm
nhận hoàn toàn hoặc chỉ một phần. Chẳng hạn như CYP1A2 và 3A4 cũng liên quan
đến chuyển hóa của hầu hết thuốc điều trị rối loạn tâm thần trong khi CYP2C19,
2C9 và 3A4 lại có vai trò rất lớn đối với chuyển hóa của phần lớn thuốc ức chế thu
hồi chọn lọc serotonin [141]. Do đó mà ảnh hưởng của hiện tượng đa hình di truyền
của CYP2D6 lên sự chuyển hóa hoàn toàn những thuốc này là rất đa dạng và phụ
thuộc rất nhiều vào vai trò của CYP2D6 trong sự chuyển hóa của chúng.
CYP2D6 đóng một vai trò không lớn trong sự chuyển hóa của citalopram.
Trong khi sự chuyển hóa qua CYP3A4 và CYP2C19 lần lượt chiếm tỷ lệ 70% và
7%. Tuy nhiên CYP2D6 lại có vai trò rất quan trọng đối với chuyển hóa
escitalopram- đồng phân S của citalopram. Sự phân bố tương quan giữa CYP2D6,
2C9 và 3A4 tới độ thanh thải nội tại của gan (CL
int
) của escitalopram được ước tính
theo thứ tự là 28%, 37% và 35% [125]. Gepiron là một thuốc chống trầm cảm thế
hệ mới được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6,

nhưng ở nồng độ thấp thì vai trò của
CYP3A4 lại đóng vai trò chính [39]. Một thuốc chống trầm cảm mới hơn,
duloxetin, được chuyển hóa chính bởi CYP2D6 và 1A2 [110]. Methadon là một
thuốc chủ vận trên receptor μ, được chuyển hóa chủ yếu bởi cả CYP2D6 và 3A4
[127].
Atomoxetin, một thuốc điều trị chứng tăng động, giảm tập trung hay
nicergolin – một dẫn xuất của cựa lõa mạch để điều trị mất trí nhớ cũng được
chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 [10, 99]. Selegilin, một thuốc sử dụng điều trị giai
đoạn đầu của bệnh Parkinson, trầm cảm, chứng mất trí nhớ được chuyển hóa một
phần bởi CYP2D6, nhưng CYP2B6 và 2C19 mới là những enzym chính trong sự
chuyển hóa thuốc này [44]. Almotryptan một chất chủ vận chọn lọc receptor 5-

HT
1B/1D
đã được phát triển để điều trị triệu chứng của bệnh đau nửa đầu cấp là một
cơ chất của CYP2D6 [38].


15

b. Thuốc tim mạch
CYP2D6 đóng một vai trò quan trọng trong chuyển hóa các thuốc điều trị bệnh
tim mạch. CYP2D6 chuyển hóa cho rất nhiều thuốc điều trị loạn nhịp tim (như là:
spartein, propafenon, encainid, flecainid, cibenzolin, aprindin, lidocain,
procainamid và mexiletin) và thuốc chẹn β (như là: atenolol, bufuralol, carvedilol,
metoprolol, bisoprolol, propranolol, bunitrolol, bupranolol, timolol andalprenol)
[36, 141].
c. Những thuốc khác
Tamoxifen được chuyển hóa bởi CYP2D6 thành endoxifen, một chất chuyển
hóa có tác dụng dược lý thông qua hai quá trình cắt bỏ nhóm methyl và gắn vào
nhóm hydroxyl (“N-demethylation” và “4-hydroxylation”) liên tục [9, 19]. Các
thuốc kháng histamin, chống dị ứng hay kháng cholinergic cũng được CYP2D6
chuyển hóa.
1.3. GEN MÃ HÓA CYP2D6
CYP2D6 chiếm 1 vùng 4.2 kb trên nhiễm sắc thể 22 ở vị trí q13.1 và chứa 9
đoạn exon và 8 đoạn intron. Nó bao gồm 1491 cặp base mã hóa cho 497 acid amin.
Nằm cùng trên nhiễm sắc thể 22 còn có 2 pseudogen là CYP2D8P và CYP2D7P
[37].

Hình 7. Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37]
16

CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6
2.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN
Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột. Một đột
biến gen là một sự thay đổi trong trình tự nucleotid trên gen, dẫn đến kết quả là tạo
ra một protein đột biến với trình tự acid amin thay đổi hay tác động đến quá trình
điều khiển sự tổng hợp của các sản phẩm gen. Nếu protein đột biến có chức năng
khác với dạng tự nhiên thì sẽ tạo ra một sự thay đổi tương ứng ở những đặc tính có
thể quan sát được và tạo ra thể đột biến. Sự khác biệt có thể do hoạt tính hay tính ổn
định của enzym. Một số đột biến có thể tồn tại trong quần thể bên cạnh các dạng tự
nhiên làm thành một thể đa hình [4].
Đột biến xảy ra ở các tế bào không sinh sản được gọi là đột biến sinh dưỡng
và tạo ra các thay đổi có tính cục bộ, không di truyền được như các u sắc tố ngoài
da người tạo ra nốt ruồi. Những đột biến sinh dưỡng có thể là nguyên nhân gây ra
ung thư và có thể là nguyên nhân của sự lão hóa .
Đột biến xảy ra trong giao tử được gọi là đột biến dòng mầm và được truyền
cho đời sau. Khi nghiên cứu các đột biến giao tử và đo tỷ lệ đột biến ở sinh vật đa
bào nói chung và người nói riêng cần xét đến tính lưỡng bội. Hầu hết các đột biến
gen là đột biến lặn và sẽ không được phát hiện nếu hợp tử không có hai bản của
allen đột biến. Do đó việc phát hiện và đo tần số đột biến phải dựa vào quan sát các
đột biến trội đang xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, các đột biến lặn và trội trên
nhiễm sắc thể X.
Ví dụ: chứng loạn sản sụn xảy ra rải rác là bởi các đột biến mới trong gen của
thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi. Trong 1 năm có 7 trẻ sơ sinh bị loạn sản
sụn trên tổng số 242257 trẻ sơ sinh , tỷ lệ là 7/242257 × 1/2 ( 2allen/ hợp tử) =1,4 ×
10^
-5
.

Trong tự nhiên, dù trong điều kiện nào tất cả các gen đều có đột biến được gọi
là đột biến tự nhiên hay đột biến tự phát. Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất
ít. Các gen khác nhau của cùng một sinh vật có thể có tần số đột biến khác nhau
nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen là ổn định.