XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GEN KatG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC I SONIAZID CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO TẠI VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦ U
1. L do chn đ ti
Nhiễ m vi khuẩ n lao (Mycobacterium tuberculosis) l mt trong nhng
nhiễ m trù ng phổ biế n nhấ t ở loà i ngườ i . Hiệ n nay tỷ lệ nhiễ m vi khuẩ n lao
đượ c xá c đị nh là chiế m 1/3 dân số thế giớ i . C khong 9 triệ u ngườ i mắ c lao
mớ i và hơn 3 triệ u ngườ i chế t do lao mỗ i năm . Tuy vậ y tỷ lệ phá t hiệ n chỉ đạ t
37% số bệ nh nhân ướ c tính . V vy cn rt nhiu bnh nhân lao không đưc
chữ a trị và đang tiế p tụ c là m lây lan bệ nh cho c ng đng.
Hiệ n nay, bệ nh lao đang trở nên nghiêm trọ ng hơn vớ i đặ c trưng là khá ng
đa thuố c. Trong cá c trườ ng hợ p bệ nh lao khá ng đa thuố c, kh khăn không ch l
điề u trị thấ t bạ i cao , dẫ n đế n lan truyề n nhanh chó ng vi khuẩ n lao khng đa
thuố c mà cò n chưa tì m ra đượ c nhữ ng thuố c thay thế hiệ u quả và hợ p lý , trong
khi cá c thuố c chố ng lao thự c sự có hiệ u quả chỉ tậ p trung có 5 thuố c.
Nhữ ng bệ nh nhân bị nhiễ m cá c chủ ng vi khuẩ n lao khá ng đa thuố c rấ t
kh điu tr. Do đó việ c phá t hiệ n sớ m cá c chủ ng vi khuẩ n lao khá ng đa thuố c
s gp phn đng k trong điu tr bnh lao .
Để ch n đon vi khun lao khng thuc , hiệ n nay cá c cơ sở trong
nướ c vẫ n phả i dự a và o nuôi cấ y vi khuẩ n và là m khá ng sinh đồ . Thờ i gian
chuẩ n đoá n lao khá ng thuố c cầ n í t nhấ t 4 – 6 tuầ n. Vớ i thờ i gian dà i như
vậ y sẽ khó khăn cho công tá c điề u trị , kh đp ng yêu cu gim st v
thanh toá n bệ nh lao .
Khắ c phụ c nhữ ng nhượ c điể m đó , việ c ứ ng dụ ng sinh họ c phân tử đang
to ra nhng đt ph trong chn đon vi khun lao khng thuc . Thờ i gian
chẩ n đoá n có thể rú t ngắ n xuố ng cò n và i ngà y , vớ i độ nhậ y và độ đặ c hiệ u
cao, to điu kin cho việ c kiể m soá t bệ nh lao dễ dà ng hơn .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Cc nghiên cu v sinh hc phân t trong chn đon vi khun lao
khng thuc đ ch ra rng mi loi khng thuc l do cc gen tương ng chu

trch nhim.
Ví dụ, nế u chỉ ra đượ c độ t biế n ở gen KatG cng c ngha l chng lao
đó khá ng isoniazid.
Xuấ t phá t từ nhữ ng lý do trên , chng tôi tin hnh đ ti : "Xc đnh
cc đt bin trên gen katG liên quan đế n tí nh khá ng thuố c i soniazid củ a
mộ t số chủ ng vi khuẩ n lao tạ i Việ t Nam".
2. Mc tiêu nghiên cu
1. Nhân bả n đoạ n gen katG từ cá c chủ ng vi khuẩ n lao nghiê n cu.
2. Pht hin đt bin trên gen katG liên quan đế n tnh khng isoniazid ở
cc chng vi khuẩ n lao nghiê n cứ u.
3. Nộ i dung nghiên cƣ́ u
- Nhân bả n đoạ n gen katG từ cá c chủ ng vi khuẩ n lao nghiên cứ u .
- To vector ti t hp v bin np vector ti t hp vo t bo vi khun
E. coli.
- Tch dng gen katG.
- Gii trnh t gen katG.
- Pht hiệ n, phân tch độ t biế n trên gen katG liên quan đế n tí nh khá ng
thuố c isoniazid ở cá c chủ ng vi khuẩ n lao nghiên cứ u .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
CHƢƠNG 1
TỔ NG QUAN TI LIU

1.1. Tnh hnh bnh lao
1.1.1. Tnh hnh bnh lao trên th gii
Bnh lao gắn lin với s pht trin x hi loi người từ hng ngn năm
nay, trên th giới chưa bao giờ v không c mt quc gia no, mt khu vc
no, mt dân tc no không c người mắc bnh lao v cht do lao [1]. Do s
pht minh cc thuc ha hc chng lao khin vic cha lao đơn gin hơn v
hiu qu hơn, đng thời đ pht sinh tâm trng ch quan ca y giới, đ lm

lng quên căn bnh nguy him ny. Ngy nay, bnh lao đang xut hin trở
li v cùng với đi dch HIV/AIDS trở thnh mt trong nhng căn nguyên
gây mắc bnh v t vong ch yu, đặc bit ti cc nước đang pht trin.
Năm 1993, T chc Y t th giới (TCYTTG) đ tuyên b tnh trng
khn cp ton cu ca bnh lao v mi him ho ca n trong tương lai l
bnh lao khng thuc [22].
Hin nay, trên th giới c khong 2,2 tỷ người đ nhiễm lao (chim 1/3
dân s th giới). Theo s liu công b ca TCYTTG (2004), ước tnh trong
năm 2003 c thêm khong 9 triu người mắc lao mới v 2 triu người cht
do lao. Khong 95% s bnh nhân lao v 98% s người cht do lao ở cc
nước c thu nhp vừa v thp, 75% s bnh nhân lao c nam v n ở đ tui
lao đng. Trong đ, c khong 80% s bnh nhân lao ton cu thuc 22
nước c gnh nặng bnh lao cao [1,22].
Hin nay, tỷ l điu tr thnh công trên ton cu đt 82%, nhưng tỷ l
pht hin ch đt 37% s bnh nhân ước tnh. Như vy, cn rt nhiu bnh
nhân lao không đưc cha tr đang tip tục lây bnh cho cng đng, v theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
ước tnh ca TCYTTG, mi năm c thêm 1% dân s th giới b nhiễm lao
(65 triu người) [22].
Hơn 33% s bnh nhân lao ton cu ti khu vc Đông nam Châu Á.
Dưới đây l ước tnh bnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vc [22].
Bng 1.1: Ƣc tính bnh nhân lao mi mắc năm 2002 theo khu vực
Khu vực
Số BN (nghn) Tỷ l/100 000
Tử vong do lao
(bao gồm cả nhiễm HIV)
Các thể
AFB
(+)

Các
thể
AFB
(+)
SL (nghìn) TL/100000
Châu Phi
2354
(26%)
1000 350 149 556 83
Châu Mỹ
370
(4%)
165 43 19 53 6
Trung Đông
622
(7%)
279 124 55 143 28
Châu Âu
472
(5%)
211 54 24 73 8
Đông nam Châu Á
2890
(33%)
1294 182 81 625 39
Tây Thi Bnh Dương
2090
(24%)
939 122 55 373 22
Ton cu

8797
(100%)
3887 141 63 1823 29

Mc đ nặng n ca bnh lao đ nh hưởng tới thu nhp quc dân v
ch s pht trin con người ca cc quc gia. Cc nghiên cu v kinh t y t
cho thy, mi bnh nhân lao s mt trung bnh 3-4 thng lao đng, lm gim
20-30% thu nhp bnh quân ca gia đnh. Nhng gia đnh c người cht sớm
v bnh lao c th s mt tới 15 năm thu nhp. Bnh lao đ tc đng mnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
tới 70% đi tưng lao đng chnh ca x hi, lm lc lưng sn xut b gim
sút, năng sut lao đng gim v mùa mng, ch ba s không tham gia đưc.
Diễn đn cc đi tc chng lao ln th nht diễn ra năm 2001 ti trụ sở ca
ngân hng th giới ở Washington D.C với s c mặt ca đi din cp B
trưởng từ cc quc gia c tnh hnh bnh lao nặng n đ nhn đnh, bnh lao
l nguyên nhân ch yu lm nghèo đi dai dẳng v l trở ngi đi với s
pht trin kinh t x hi [22].
Bnh lao l bnh ca người nghèo, lây lan nhanh trong cng đng c
điu kin sng cht chi, thiu v sinh, thông kh v dinh dưỡng kém. Trên
95% s bnh nhân lao, 98% s cht do lao trên ton cu thuc cc nước c
thu nhp vừa v thp, 75% s người mắc bnh lao ở cc la tui 14-55, là
tui lm ra nhiu ca ci nht trong cuc đời [1, 22].
Bnh lao l kt qu ca nghèo đi v nghèo đi li l nguyên nhân lm
cho bnh lao pht trin.
1.1.2. Tnh hnh bnh lao  Vit Nam
Ở nước ta, bnh lao cn ph bin v ở mc đ trung bnh cao. Vit
Nam đng th 13 trong 22 nước c s bnh nhân lao cao trên ton cu
(TCYTTG, 2004). Trong khu vc Tây Thi Bnh Dương, Vit Nam đng th
ba sau Trung Quc v Philipinnes v s lưng bnh nhân lao lưu hnh cng

như bnh nhân lao mới xut hin hng năm [1].
Năm 1995, trước nhng bin đng xu đi ca tnh hnh dch tễ bnh lao
ton cu, công tc chng lao thc s bắt đu phi đi mặt với nhng thch
thc mới l bnh lao khng thuc v Lao/HIV, Nh nước v B Y t Vit
Nam đ quyt đnh đưa Chương trnh chng lao thnh mt trong nhng
Chương trnh y t quc gia trng đim. Cùng với s đu tư pht trin các
Chương trnh y t quc gia ni chung, B Y t v Chnh ph đ ưu tiên đu tư
đng b lưng rt lớn cn b, kinh ph v trang thit b cho Chương trnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
chng lao. Ban ch đo Chương trnh chng lao v chnh quyn đa phương
cc cp đ tham gia tch cc trin khai công tc ny, cùng với s hp tc v
gip đỡ c hiu qu v ti chnh v kỹ thut ca cc t chc quc t [4].
Năm 1996, Chương trnh chng lao quc gia (CTCLQG) với s h tr
v kỹ thut v ti chnh ca Chnh ph H Lan, hip hi chng lao hoàng gia
Hà Lan, uỷ ban hp tc y t H Lan - Vit Nam, CTCLQG đ hnh thnh v
xây dng k hoch phng chng lao giai đon 1996-2000. Đn năm 1999,
chin lưc DOTS (điu tr bng ho tr liu ngắn ngy c kim sot trc tip)
đ đưc bao ph 100% s huyn trên c nước [4].
Trong giai đon 1997-2002, CTCLQG đ pht hin đưc 532.703 bnh
nhân lao cc th, tỷ l pht hin đt 82% s bnh nhân ước tnh (so với mục
tiêu ca TCYTTG l 70%), CTCLQG đ điu tr 260.698 bnh nhân lao phi
AFB (+) với tỷ l khỏi l 92% [3].
Năm 2002, khu vc Tây Thi Bnh Dương pht hin 806.460 bnh nhân
lao cc th, 372.220 bnh nhân lao phi AFB (+) mới. Trong đ, s bnh nhân
do CTCLQG Vit Nam pht hin chim 12% bnh nhân cc th v 15% s
bnh nhân lao phi AFB (+) mới [1].
Với nhng kt qu đt đưc trong ch tiêu pht hin v điu tr bnh
nhân, năm 1996, Vit Nam l nước đu tiên ở Châu Á đ đt đưc mục tiêu
ca TCYTTG. Vit Nam đ đưc TCYTTG v ngân hng th giới đnh gi

cao thnh tch đt đưc trong mi hot đng chng lao. Từ năm 1997,
TCYTTG và hip hi bài lao và bnh phi quc t cùng phi hp với
CTCLQG Vit Nam t chc 8 kho hc v qun lý Chương trnh chng lao
cho cc hc viên quc t ti Vit Nam. Mô hnh hot đng chng lao ở Vit
Nam đưc xem l mô hnh đ hc viên cc nước hc tp [4].
V l mt trong s t nước sớm nht đt đưc cc mục tiêu phng chng
lao do TCYTTG đ ra, nhng kt qu đt đưc c tnh bn vng, nên thng 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
năm 2003 vừa qua CTCLQG Vit Nam đ nhn đưc gii thưởng ca hi
chng lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ nim 100 năm ngy thnh
lp t chứ c này.
Nhân ngày th giới chng lao, 24/3/2004, ti diễn đn cc đi tc chng
lao ln th 2 do TCYTTG t chc ti New Dehli, CTCLQG Vit Nam l mt
trong 6 nước trên th giới (bao gm: Vit Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia
v Morocco) v l nước duy nht trong 22 nước c gnh nặng bnh lao cao
đưc nhn gii thưởng ca TCYTTG v thnh tch đ đt đưc mục tiêu ca
TCYTTG v kt qu c tnh bn vng trên 4 năm [4].
Hin nay nguy cơ nhiễm lao hng năm ở nước ta ước tnh l 1,5% (ở
cc tnh pha nam l 2%, ở cc tnh pha bắc l 1%).
Ước tnh với dân s 70-80 triu, hng năm ở nước ta c mộ t s  lưng
lớ n người b mắ c lao mớ i . S lưng người mắc lao mớ i đưc th hiệ n qua
bng 1.2.
Bng 1.2: Bng ƣc tính s bnh nhân mắc lao mi qua mi năm  Vit Nam
S mới mắc lao (mi th): 130.000
S lao phi BK dương tnh mới: 60.000
Tng s trường hp lao: 260.000
Tng s lao phi BK dương tnh: 120.000

Nước ta thuc loi trung bnh v dch tễ lao so với cc nước vùng Tây

Thi Bnh Dương, vùng dch tễ lao vo loi trung bnh trên th giới.
Trên thc t c th ch s nguy cơ nhiễm lao hng năm c th cao hơn
1,5% như vy cc con s nêu trên c th cn lớn hơn. Điu đ s tăng thêm s
kh khăn đi với công tc chng lao không nhng trong nhng năm tới m c
th cn trong thời gian kh di, ngay c khi đ bước sang thiên niên kỷ mới.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
1.1.3. Tnh hnh lao khng thuc
Theo bo co da trên thăm d lớn v lao khng thuc ton cu ca
TCYTTG công b ngy 26/2/2008, tỷ l nhiễm lao khng nhiu thuc hin
nay ở mc cao chưa từng c. Mi năm c khong na triu ca lao kháng đa
thuc, theo ước tnh ca TCYTTG, chim khong 5% trong s 9 triu ca
nhiễm lao hng năm. Cng trong bo co ny, ln đu tiên lao khng thuc
cc mnh đưc đ cp, đây l mt dng gn như không cha lnh đưc [5].
Theo TCYTTG, hin nay bnh lao khng thuc l mt vn đ ton cu,
đặc bit nghiêm trng l tnh hnh khng đa thuc. Bnh lao khng thuc xut
hin khi c vi khun lao khng với mt hoặc nhiu loi thuc chng lao,
nguyên nhân l do bnh nhân không hp tc, không tuân th đng nguyên tắc
điu tr đưc quy đnh ca chương trì nh chố ng lao , mt nguyên nhân khc
hay gặp l do thy thuc kê đơn không đng do không phi hp đy đ cc
thuc chng lao, liu lưng thuc không đ, hướng dẫn bnh nhân không
đng cch, điu tr không đ thời gian...
Kt qu điu tr với bnh nhân khng thuc thường không cao, nht l
đi với bnh nhân khng đa thuc. Chi ph điu tr bnh nhân lao khng đa
thuc tăng lên 100 ln so với bnh nhân lao không khng thuc v thm ch
không điu tr đưc ở mt s trường hp.
Tỷ l khng đa thuc trong bnh nhân lao mới ở khu vc Tây Thi
Bình Dương dao đng trong khong 1% đn 10,8% (theo mt s nghiên cu
trong khu vc) [4].
Dự á n nghiên cứ u khá ng t huố c lao trên cơ sở toà n c u đượ c thự c hiệ n

từ năm 1995 vớ i mụ c tiêu là xá c đị nh đượ c tổ ng số bệ nh nhân lao khá ng
thuố c trên thế giớ i bằ ng nhữ ng phương phá p thố ng nhấ t thử độ nhạ y vớ i thuố c
lao ca vi khun . Năm 1998, TCYTTG đã công bố kế t quả khả o sá t tình hình
vi khuẩ n lao khá ng thuố c ở 35 nướ c và khu vự c trên thế giớ i [6].
Theo công bố nà y, tỷ l khng thuc tiê n phá t trung bì nh vớ i riêng từ ng
loi thuc c khc nhau , cụ th l : khng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, trong đó khá ng steptomycin ở vù ng
Ivanovo (Nga) l nơi khng đơn thuc cao nht . Tỷ l kh ng thuc tiên pht
trung bì nh là 9,9 % trong đó khá ng 1 thuố c chiế m 6,6 %, khng 2 thuố c chiế m
2,5 %, khng 3 thuố c chiế m 0,6 %, khng bn thuố c chiế m 0,2 %, khng đa
thuố c trung bình là 1,4 %. Tỷ l khng thuc tiên pht cao n hấ t 40,6 % ở cng
ha Dominica, thấ p nhấ t là 2% ở cng ha Séc [6].
Tnh hnh khng thuc mắc phi với từng loi thuc cng khc nhau :
khng isoniazid trung bì nh 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %,
steptomycin 2,6 %. Khng thuố c mắ c phả i vớ i steptomycin ở Cuba có tỷ lệ
cao nhấ t 57 %. Tỷ l khng thuc mắc phi trung bnh trên ton th giới l 36
%, trong đ khng 1 loi thuc 12,2 %, 2 loi thuc 9,7 %, 3 loi thuc 5,4 %,
4 loi thuc 4,4 %. Lao khá ng đa thuố c mắ c phả i có tỷ lệ trung bì nh là 13 %.
Khng đa thuc mắc phi cao nht ở Latvia , c tỷ l 54 % [6].
Vi khuẩ n lao khá ng đa thuố c là mộ t thá ch thứ c lớ n , đe dọ a công cuộ c
phng chng lao trên ton cu , v cc thuố c chố ng lao có hiệ u quả hiệ n nay
đang bị vi khuẩ n lao khá ng lạ i nhấ t là khá ng đa thuố c . Trong khi cá c thuố c
chố ng lao hà ng đầ u chỉ có năm thuố c thì cá c thuố c chố ng lao loạ i hai lạ i
thườ ng có độ c tính cao và giá thà nh đắ t [5].
Việ c nghiên cứ u lao khá ng thuố c ở Việ t Nam đượ c tiế n hà nh khá sớ m .
Năm 1958 Phm Ngc Thc h và cộ ng sự đã công bố t ỷ lệ khá ng thuố c mắ c
phi v ới isoniazid l 53 %, vớ i paraminosalicylic acid l 26 %, vớ i
steptomycin là 59 % [6].

Bo co ca CTCLQG năm 1998 cho thấ y tì nh hình khá ng thuố c củ a vi
khuẩ n lao ở Việ t Nam là mộ t vấ n đề đá ng lo ngạ i . Tỷ l khng thuc tiên
pht l 32,5 % đứ ng thứ tư trong khả o sá t củ a TCYTTG sau Latvia (34%),
Thi Lan (36,6%), v Cng ha Dominica (40,6%). Qua cá c nghiên cứ u đã
cho thấ y Việ t Nam là mộ t trong nhữ ng quố c gia có tỷ lệ bệ nh lao khá ng thuố c
cao trên thế giớ i [6].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
Nhiễ m vi khuẩ n lao khá ng thuố c là nguyên nhân dẫ n đế n thấ t bạ i trong
điề u trị . Nhữ ng bệ nh nhân lao mớ i có thể chữ a khỏ i 95 – 100%. Nhưng bệ nh
nhân lao khá ng thuố c mắ c phả i , tỷ l cha khỏi ch 20 – 30% [22]. Kế t quả
cn thấ p hơn nữ a ở nhữ ng trườ ng hợ p khá ng đa thuố c mắ c phả i, thm ch không
chữ a đượ c. Nguy hiể m hơn là cá c bệ nh nhân nà y có thể tiế p tụ c truyề n bệ nh cho
ngườ i khá c. V vy vic pht hin v ngăn chặn s lan trn ca cc chng lao
khng đa thuc l vn đ quan trng nht trong chin lượ c điề u trị lao hiệ n nay.
1.2. Vi khuẩ n lao
1.2.1. Đc đim phân loạ i
Vi khuẩ n lao thuộ c giớ i Bacteria , ngnh Actinobacteria , bộ
Actinomycetales, phân bộ , h Mycobacteriaceae, giố ng Mycobacterium [18].
Tên khoa họ c củ a vi khuẩ n lao l: Mycobacterium tuberculosis.
Cc chng vi khun lao đưc chia lm 2 nhm: Mycobacterium
tuberculosis gồ m bố n loi c kh năng gây bnh ở người , v nhm
Mycobacteria other than tuberculosis gồ m nhiề u loà i không gây bệ nh ở
ngườ i [6,7].
1.2.2. Đc đim hnh th
Vi khun lao c hnh trc khun , kch thước 2 – 4 μm, rộ ng 0,3 – 1,5
μm. Trự c khuẩ n thanh mả nh , đứ ng riêng lẻ hoặ c xế p thà nh hình chữ N , Y, V
hoặ c thà nh dã y phân nhá nh như cà nh cây .
Vi khun lao không di độ ng, không sinh bà o t, kh bắ t mu cc thuố c
nhuộ m thông thường do có lớp sp ở thnh t bo [7].

1.2.3. Kh năng gây bnh
Cc bnh lý nhiễm trùng l nguyên nhân gây t vong hng đu trên th
giới. Không ch c nhng bnh nhiễm trùng mới pht sinh m nhng bnh
nhiễm trùng c gây cht người đ bit từ lâu cng ti xut hin. Hơn na t l
vi khun gây bnh đ khng khng sinh ngy cng tăng cao l nguy cơ lớn
cho sc khỏe cng đng. Nhng bng chng gn đây cho thy cc tc nhân
gây bnh mặc dù rt khc nhau đu s dụng nhng phương thc chung đ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
pht đng qu trnh nhiễm trùng v gây bnh. Nhng cơ ch ny to nên đc
lc ca vi khun. Tm hiu cc cơ ch m vi khun s dụng đ xâm nhp v
gây bnh c ý ngha quan trng trong cuc chin chng li cc tc nhân bé
nhỏ ny [7].
Đc lc ca vi khun lao c liên quan đn “Cord factor” (trehalose –
6,6’ – dimycolate) l cht gây c ch hot đng ca t bo bch cu , gây nên
nhữ ng u hạ t mã n tính . Miễ n dị ch trong bệ nh lao ngà y nay đượ c xá c đị nh là
đá p ứ ng miễ n dị ch qua trung gian tế bà o . Đá p ứ ng miễ n dị ch là m chậ m sự
nhân lên củ a vi khuẩ n lao , gây hạ n chế sự lan trà n củ a vi khuẩ n lao , dẫ n tớ i
ph hy t bo vi khun . Đá p ứ ng miễ n d ch trong bnh lao pht sinh mt
phn ng qu mun . Mộ t số trườ ng hợ p vi khuẩ n lao có khả năng ứ c chế hoặ c
tiêu diệ t trở lạ i bạ ch cầ u ngườ i và tồ n tạ i dướ i dạ ng ngủ trong cá c u hạ t nên cơ
thể không tiêu diệ t đượ c . Đặc bit trong cá c trườ ng hợ p lao khá ng thuố c cơ
thể không tiêu diệ t đượ c vi khuẩ n và cá c thuố c cũ ng không tá c độ ng đượ c . Đó
l mt vn đ nan gi i trong điề u trị bệ nh lao [8].
Vi khuẩ n lao có thể và o cơ thể qua nhiề u đườ ng , thườ ng là qua đườ ng
hô hấ p, bên cạ nh đó là cá c đườ ng tiêu hó a , da, kế t mạ c mắ t... Sau khi gây tổ n
thương tiên phá t , vi khuẩ n lao có thể theo đườ ng bạ ch huyế t hoặ c đườ ng má u
tớ i cơ quan khá c gây tổ n thương thứ phá t .
Nhiề u cơ quan : phổ i, thậ n, mng no, xương, hch, da... đu c th b
vi khuẩ n lao xâm nhậ p , nhưng thườ ng bị hơn cả là phổ i và vị trí gặ p nhiề u

nhấ t là đỉ nh phổ i, nơi có phân á p oxy 120 mmHg [6].
1.2.4. Hệ gen củ a vi khuẩ n lao
Hệ gen củ a v i khuẩ n lao đã đượ c đọ c trì nh tự , c chiu di 4.411.522
cặ p base trong đó có 3.924 trnh t đưc d đon l c m ha protein , tỷ l G
+ C chiế m đế n 65,6%. Genome củ a vi khuẩ n lao có chứ a tớ i 90,8 % trnh t
m ha protein và chỉ có 6 gen giả [28].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
1.3. Gen KatG v tnh kháng thuốc isoniazid  vi khun lao
Gen katG l mt đon DNA c kch thước 2223 bp, nằ m trên nhiễ m sắ c
thể củ a vi khuẩ n lao và chị u trá ch nhiệ m m ha cho enzyme catalase -
peroxidase. Ngườ i ta nhậ n thấ y có khoả ng 95% cc chng vi khun lao khng
isoniazid c đt bin trên gen ny [28].
Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase. Enzyme ny hot
hóa isoniazid bng cch kt hp axyl isonicotinic với NADH đ to thnh
phc h axyl isonicotinic-NADH. Phc h ny liên kt chặt ch với enzyme
ketoenoylreductase (m ha bởi gen InhA), theo đ lm ngăn cn cơ cht
enoyl-AcpM. Qu trnh ny lm c ch s tng hp axit mycolic cn cho
thnh t bo vi khun lao. Cơ ch phân t ca tnh khng isoniazid ch yu c
liên quan tới đt bin thêm đon/mt đon hoặc cc đt bin nhm ngha/vô
ngha, trong đ ch yu diễn ra ti codon 315 v 463 (S315T) ca gen katG
mã hóa catalase-peroxidase. Nu c s bin dng hay đt bin ở base th 2 ti
codon 315 ca gen katG (AGC bin thnh ACC hay ACA) s dẫn đn lm
gim hoặc mt hon ton hot tnh ca enzyme catalase-peroxidase do đ M.
tuberculosis s trở thnh khng thuc isoniazid [51]. Do đ pht hin s thay
đi di truyn ny trong gen katG c th cung cp mt phương php sng lc
nhanh v chnh xc cho vic pht hin cc chng M. tuberculosis kháng
isoniazid.
1.4. Chẩ n đoá n vi khuẩ n lao khá ng Isoniazid
Vi khuẩ n lao khá ng isoniazid đượ c xc đnh theo phương php chẩ n

đoá n kiể u gen. Cc phương php chn đon kiu gen đu da trên cơ sở xc
đị nh độ t biế n ở cá c gen có liên quan khá ng thuố c tương ứ ng .
Để xá c đị nh độ t biế n trên gen katG hiệ n có nhiề u phương phá p , song
gii trnh gen vẫn l phương ph p cơ bả n, chnh xc, r rng nht . Tuy nhiên
đây là phương phá p không phả i nơi nà o cũ ng là m đượ c vì đò i hỏ i má y mó c
thiế t bị đắ t tiề n và nhân lự c có trì nh độ để vậ n hà nh khai thá c [28].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Gii trnh t (DNA squencing ) l phương phá p xá c đị nh vị trí sắ p xế p
cc nucleotide trong phân tử DNA . Nguyên lý củ a phương phá p nà y là : Tổ ng
hợ p cá c mạ ch đơn DNA mớ i có độ dà i ngắ n hơn mạ ch khu ôn, nhờ kỹ thuậ t
đá nh dấ u và ngắ t đoạ n trong quá trì nh tổ ng h p mch DNA , thu đượ c cá c
mch đơn hơn ké m nhau mộ t base từ đó có đượ c sơ đồ trậ t tự mạ ch DNA
khuôn mẫ u. So sá nh trậ t tự củ a mẫ u thí nghiệ m vớ i trậ t tự DNA ch un ta bit
đượ c vị tr cc sai lch (độ t biế n) [33].
ng dụ ng cá c kỹ thuậ t sinh họ c phân tử đã xá c đị nh cá c chủ ng vi
khuẩ n lao khá ng isoniazid là do có độ t biế n ở gen katG. Codon xy ra độ t
biế n là codon 315 [34].
Sự độ t biế n xả y ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC
hoặ c AGC  ACA) [34].
Để giả i trì nh tự gen katG, hiệ n nay ngườ i ta có thể thự c hiệ n trự c tiế p
từ sả n phẩ m PCR . Khi sả n phẩ m PCR là đơn nhấ t và có độ di thch hp cho
việ c phân tí ch kế t quả thì có thể thự c hiệ n giả i trì nh tự trự c tiế p. Cng c th
gii trnh t thông qua tá ch dò ng , gắ n đoạ n gen katG cầ n nghiên cứ u và o
vector. Đoạ n gen cù ng vớ i vector tá i tổ hợ p đượ c nhân lên trong tế bà o E.coli.
Khi giả i trình tự gen , c đon gen katG v 1 phn vector đề u đượ c xá c đị nh
trnh t. Gii trnh t thông qua tch dng đượ c ứ ng dụ ng khi sả n phẩ m PCR
không đượ c tố t , đặ c biệ t l trong cc trườ ng hợ p gây độ t biế n nhân tạ o kiể m
chứ ng khá ng thuố c và trong nghiên cứ u biể u h iệ n gen [6].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
CHƢƠNG 2
ĐI TƢNG, VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U

2.1. Đối tƣng nghiên cu
Cc chng vi khun lao M. tuberculosis đưc cung cp bởi Hc vin
Quân y.
Bng 2.1: Đc đim khng sinh đ ca cc chng vi khun lao
M DNA M Chng Khng thuc
ĐA1 TB06-22 HSRE
ĐA2 TB06-23 HSRE
ĐA3 TB06-26 HSRE
ĐA4 TB06-27 HSR
ĐA5 TB06-28 HSRE
ĐA6 TB06-31 HSRE
ĐA7 TB06-33 HSRE
ĐA8 TB06-35 HSR
ĐA9 TB06-36 HSRE
ĐA10 TB06-37 HSRE
ĐA11 TB06-38 HSRE
ĐA12 TB06-39 HSR
ĐA13 TB06-41 HSRE
ĐA14 TB06-51 HSRE
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
2.2. Vậ t liệ u thiế t bị và dụ ng cụ nghiê n cƣ́ u
2.2.1. Cc sinh phm ha cht chính
Bng 2.2: Cc sinh phm ha cht chính
Tên hó a chấ t Hng sản xut

1. H/c dù ng trong PCR
Tris base
Lysozyme
Proteinase K
Agarose
Thang chuẩ n DNA
EDTA
Taq-DNA-polymerase
2. H/c sinh phẩ m dù ng trong tá ch dò ng
Pepton
Yeast Extract
Nacl
Agar
Ampicilin
X-gal
IPTG
Accuprep plasmid Mini Extraction Kit
EcoRI
pBT
3. H/c phụ c vụ giả i trì nh tƣ̣ gene
Big Dye Terminator V3.1
HiDi Formamid
Ethanol tuyệ đố i

Applied BioSciences (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)

Fermentas (Mỹ)

Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)

Applied BioSciences (Mỹ)
Applied BioSciences (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
2.2.2. Cc my v thit b chính
Bng 2.3: Cc my v thit b chính
Tên má y, thiế t bị Hng sản xut
T m ổ n nhiệ t
My PCR (GenAmp PCR System 9700)
My PCR (Thermo cycle)
My ly tâm (Biofuge Primo R)
My đo pH (Digital pH Meter Delta 320)
My chụp nh Gel-Doc
T lnh -20
0
C, -80

0
C
L vi sng
T an ton sinh hc cp II Nuaire
Bể ổ n nhiệ t
My lắ c Gyromax 737R
My quang ph t ngoi kh bin Nano Drop
My phân tch trnh t DNA ABI 3100-
Avant
Sanyo (Nhậ t Bả n)
Applied BioSciences (Mỹ)
Bio-rad (Php)
Heraeus (Mỹ)
Thommas Scientific (Mỹ)
Dolphin (Mỹ)
Nuaire (Mỹ)
Sanyo (Nhậ t Bn)
Nuaire (Mỹ)
Memmert (Đc)
Amerex Instrument (Đc)
Analitika (Đc)
Applied BioSciences (Mỹ)

2.2.3. Cc mi dng trong nghiên cu
Cc mi đặ c hiệ u cho phá t hiệ n trự c khuẩ n lao và lao khá ng thuố c đượ c
sử dụ ng cho phả n ứ ng PCR n hân cá c đoạ n gen đí ch có trình tự tương ứ ng là :
- Cặ p mồ i dùng cho nhân trì nh tự gen katG:
KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3'
KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3'
- Cặ p mồ i dùng cho gii trnh t gen katG:

M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'
M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
Cc trnh t ny đưc gi tng hp ở công ty Invitrogen , Hồ ng Kông.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
2.3. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u
2.3.1. Thiế t kế nghiên cƣ́ u
Tiế n hà nh nghiên cứ u theo phương phá p :
- Dch tễ hc mô t, điề u tra cắ t ngang, c đi chng.
- Thự c nghiệ m labo có đố i chứ ng .
Sơ đồ nghiên cƣ́ u

DNA (Tch t vi khun
lao đã đƣợ c xá c đị nh tí nh
khng thuc)
Nhân bả n đoạ n gen katG
sƣ̉ dụ ng mồ i đặ c hiệ u

Sn phm gen KatG

Tch dng gen KatG
Sn phm vector c đon
gen KatG

Gii trnh tự gen KatG
Xc đnh đt bin liên
quan đế n tính khá ng INH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
2.3.2. Cc k thut c th

2.3.2.1. K thut nhân bả n đoạ n gen katG sử dụ ng mồ i đặ c hiệ u
Sơ đồ qui trì nh nhân bn đon gen KatG


C th:
1. Sau khi đo nồ ng độ DNA khuô n, tnh v to cc nng đ DNA ca
cc mẫu như nha u để khi đưa và o hỗ n hợ p sả n phẩ m cùng mộ t thể tí ch DNA
khuôn, v đt khong 100 ng/thể tí ch 25µl phn ng.
2. Tnh cc gi tr ca cc thnh phn khc .
Đo nồ ng độ DNA củ a mẫ u
nghiên cƣ́ u
Tính ton gi tr cc thnh
phầ n phn ng PCR
To hn hp phn ng
Nhân gen theo chu trình
nhiệ t đã đƣợ c tố i ƣu hó a
Điệ n di kiể m tra vạ ch đặ c
hiệ u
Sƣ̉ dụ ng sả n phẩ m PCR là m
DNA chè n và o plasmid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
Bng 2.4: Tính ton cc thnh phn cho phn ng PCR
Thnh phn phản ng PCR Thể tí ch (µl) Nồ ng độ
Nướ c 10,25
MgCl
2
(25 mM) 2,5 2 mM
PCR bufer (10X) 2,5 1 X
dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM

Mồ i KatG F 1 0,5 µM
Mồ i KatG R 1 0,5 µM
Taq Polymerase 0,25 1 unit
DNA khuôn 5
Tổ ng 25


Cc thnh phn ny ở phn ng ca cc mẫu bnh phm đu ging
nhau. C đi chng âm khi tin hnh phn ng .
3. Chu trì nh nhiệ t như sau:










4. Điệ n di sả n phẩ m PCR trên a garose 1,5%, nhuộ m Ethidium bromide
v đc kt qu trên my Gel - Doc.
95
0
C
5 pht
95
0
C
1 pht

56
0
C
45 giây
72
0
C
1 pht
72
0
C
4 pht
4
0
C
60 pht
35 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
2.3.2.2. K thut tách dng (cloning), tạo sn phm phc v gii trnh t gen
katG
Sơ đồ qui trì nh tá ch dò ng

Sau khi nhân bả n thà nh công đoạ n gen katG, chng tôi tin hnh lm
sch (thôi gel) bằ ng bộ kit QIAquick Gel Extraction . Trong quá trì nh thao tá c
trên đè n tím rấ t có thể bị đứ t gẫ y cá c nucleotide s gây nh hưởng k hông tố t
tớ i sả n phẩ m kế t nố i , v vy trước k hi thự c hiệ n phả n ứ ng kế t nố i chng tôi
tiế n hà nh thự c hiệ n phả n ứ ng nố i đầ u A . Thnh phn phn ng đưc trnh
by ở bng 2.5.
Tinh sạ ch và gắ n đoạ n gen và o vector tá ch

dng pBT to vector tá i tổ hợ p
Đƣa vector tá i tổ hợ p và o tế bà o khả biế n
Nuôi cấ y tế bà o có vector
Lƣ̣ a chọ n tế bà o mang vector tá i tổ hợ p theo
nguyên tắ c chọ n lọ c khuẩ n lạ c xanh trắ ng
Kiể m tra và tá ch plasmid
Thu plasmid, kiể m tra đoạ n gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Bng 2.5: Tính ton cc thnh phn cho phn ng ni đu A
Thnh phn phản ng PCR Thể tí ch (µl) Nồ ng độ
Nướ c 5,25
MgCl
2
(25 mM) 2,5 2 mM
PCR bufer (10X) 2,5 1 X
dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM
Taq Polymerase 0,25 1 unit
DNA khuôn 7
Tổ ng 20


Sn phm đưc tiế n hà nh trên má y PCR ở 72
0
C trong 10 pht.
Sau đó tiế n hà nh tinh sạ ch sả n phẩ m PCR theo qui trì nh củ a nhà sả n xuấ t.
Qui trì nh:
- Thêm 100 µl building buffer và o cá c Eppendorf chứ a mẫ u vừ a đượ c
nố i đầ u A. Vortex nhẹ .
- Ht hế t sn phm trên sang cc Eppendorf c bổ sung cộ t lọ c.

- Ly tâm 13000 vng/pht/4
0
C. Đ dch lỏng, thu cặ n bá m trên cộ t lc.
- Thêm 500 µl Washing buffer và o Eppendorf. Ly tâm 13000
vng/pht/4
0
C. Đ dch, thu cặ n bá m trên cộ t lc.
- Lặ p lạ i bướ c trên.
- Lm khô bng cch ly tâm thêm 1 lầ n nữ a.
- Thêm 15 µl nướ c deion và o. Đi trong vng 1 pht.
- Thu dị ch, loi bỏ ct lc.
Sau đó thự c hiệ n cá c bướ c sau:
1. To sn phm kt ni
Kế t nố i đoạ n gen katG cầ n nghiên cứ u vớ i vector pBT theo qui trì nh
ca nh sn xut.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Qui trì nh:
- 2X Papid Ligation Buffer 1 µl
- T4 DNA Ligase 1 µl
- pBT Vector 1
- PCR product 5 µl
- Nướ c cấ t khử ion vừ a đủ 10 µl.
Sau đó sn phm đưc tiế n hà nh trên má y PCR ở 22
0
C trong vò ng 60 pht.
2. Biế n nạ p và nuôi cấ y tế bà o có vector tá i tổ hợ p
Biế n nạ p sả n phẩ m kế t nố i trên và o tế bà o khả biế n E.coli DH5α theo
phương phá p số c nhiệ t [15]. Nuôi cấ y tế bà o và kiể m tra sự có mặ t củ a vector
ti t hp trong t bo theo qui trnh sau :

- Lấ y tế bo kh bin ra khỏi t âm , đ trong nước đ (4
0
C) trong vò ng
10-15 pht.
- Ht 5 µl sả n phẩ m kế t nố i cho và o cá c ống tế bà o khả biế n (c đo nh).
- Để ố ng t bo kh bin trong nước đ (4
0
C) 30 pht, số c nhiệ t ở 42
0
C
trong vò ng 90 giây.
- Tiế p tụ c giữ ở 4
0
C trong vò ng 1-2 pht.
- Thêm 100 µl LB lỏ ng vo cc ng t bo kh bin trên (c đo nh ),
cho ngay cc ng t bo kh b iế n ny vo t nuôi cy lắc , đ ở 37
0
C và 220
vng/pht trong 1 giờ .
- Ht 150 µl dch khun đ nuôi lắc cấ y trả i trên đĩ a thạ ch LB đặ c có
carbenicillin, X-gal, IPTG.
- Giữ sả n phẩ m ở tủ n nhit 37
0
C qua đêm (18-24 giờ ).
- Khi trên bề mặ t đĩ a thạ ch xuấ t hiệ n cá c tế bà o xanh trắ ng , lự a chọ n
cc khuẩ n lạ c trắ ng chấ m và o 3 ml LB lỏ ng có khá ng sinh carbenicillin vớ i
nồ ng độ 100 µg/ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
- Lấ y 1 µl dị ch khuẩ n là m phả n ứ ng PCR k iể m tra đoạ n gen vớ i 2 mồ i

KatG F v KatG R (chu trì nh nhiệ t như vớ i PCR nhân đoạ n gen katG).
- Tiế n hà nh điệ n di kiể m tra sả n phẩ m PCR , nế u mẫ u nà o có vạ ch
tương ứ ng vớ i đoạ n gen KatG th s dụng mẫu đ đ tch plasmid .
3. Tch chit plasmid (Sử dụ ng cá c hó a chấ t có tạ i phò ng Công nghệ tế
bo thc vt - Việ n CNSH).
Sử dụ ng kit QIAprep spin Miniprep (ca hng QIAGEN ) v quy trnh
ca nh sn xut đ tch chit plasmid . Đây là phương phá p tá ch chiế t
plasmid lượ ng nhỏ từ 1-1,5 ml khuẩ n lạ c E. coli.
- Ht 2 ml dị ch khuẩ n cho và o Eppendorf 2 ml.
- Ly tâm 8000 vng/2 pht ở 4
0
C thu khuẩ n.
- Thêm 100 µl sol I, vortex nhẹ cho tan cặ n.
- Thêm 200 µl sol II, đả o nhẹ Eppendorf.
- Thêm 150 µl sol III, đả o nhẹ Eppendorf cho dị ch chuyể n sang mà u
trắ ng. (Đả o ngay khi thêm hó a chấ t và o Eppendorf, trnh kt ta cục b).
- Ly tâm 13000 vng/10 pht/4
0
C. Ht 300 µl dịch, bỏ cặn.
- Thêm 1 lượ ng tương đương P CI 24:1 (24 phenol-chloroform -
isoamylalchohol). Lắ c mạ nh, ly tâm 13000 vng/10 pht/4
0
C. Thu pha trên.
- Thêm 1 lượ ng tương tương isopropanol . Lắ c đề u.
- Ly tâm 13000 vng/10 pht/4
0
C. Thu cặ n.
- Rử a cồ n. Ly tâm 13000 vng/5 pht/4
0
C.

- Đi khô.
- Thêm 50 µl nướ c deion.
4. Kiể m tra sự có mặ t củ a đoạ n gen chè n và o plasmid
Sử dụ ng enzym cắ t giớ i hạ n BamHI để cắ t plasmid . Theo như sơ đồ
vector pBT thì chỉ cầ n mộ t enzym ny l c th cắt ở c hai đầ u phí a trướ c vị
tr ca đon gen chè n và o. Kế t quả sau khi thự c hiệ n phn ng cắt s thu đưc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
hai phầ n: to mt vch trên hnh nh đin di c kch thước khong 684 bp và
mộ t vch l phn cn li ca plasmid khong 2705 bp.
Qui trì nh dùng BamHI:
- 10X BamHI buffer: 2µl
- BamHI enzym: 1µl
- DNA plasmid: 5µl
- Nướ c deion vừ a đủ 20µl
Sn phm đượ c tiế n hà nh ở b n nhit 37
0
C trong vò ng 90 pht. Sau
đó điệ n di trong agarose 1% kiể m tra vạ ch đặ c hiệ u . Nhữ ng mẫ u nà o có vạ ch
tương ứ ng vớ i v tr 684 bp thì c th s dụng đ đc trnh t.
Sau khi xá c đị nh đượ c mẫ u plasmid đi đọ c trình tự , pha loã ng plasmid
50 lầ n rồ i hú t 10µl mẫ u đó cho và o Eppendorf, bổ xung thêm 5µl RNAase.
Sn phm đưc tin hnh ở b n nhiệ t 37
0
C trong vò ng 90 pht đ kh RNA.
2.3.2.3. Phương phá p đọ c trình tự DNA theo Sanger trên má y đọ c trình
tự tự độ ng phân tí ch kế t quả bằ ng cá c phầ n mề m chuyên dụ ng
Plasmid đượ c gử i đọ c trì nh tự ti phng Công ngh gen t rng đim -
Việ n Công nghệ Sinh họ c .
* Phân tí ch kế t quả :

- Kiể m tra kế t quả thu đượ c bằ ng phầ n mề m má y tính ABI 3130.
- Khai thá c dữ liệ u từ ngân hà ng gen , thiế t lậ p chủ n g chuẩ n wild type
đ so snh.
- Xử lý , phân tí ch cá c trnh t đon gen katG c kch thước khong 684
bp ca cc chng vi khun lao bng chương trnh phân tch chui BioEdit . So
snh đi chiu với cc d liu ở ngân hng gen đ c kt qu cc v tr đt
biế n củ a từ ng chủ ng nghiên cứ u.
Xử lý số liệ u theo phương phá p thố ng kê , sử dụ ng chương trì nh phân
tch sinh hc Star View v5.0 đ xc đnh cc mi liên quan khng thuc .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
CHƢƠNG 3
KẾ T QUẢ NGHIÊN CƢ́ U V THO LUN

3.1. Kế t quả nhân bản gen katG các chủ ng vi khuẩ n lao nghiên cƣ́ u
Sử dụ ng cặ p mồ i katG F v katG R nhân bả n đoạ n gen katG bằ ng kỹ
thuậ t PCR. Sau khi có đượ c sả n phẩ m PCR , chng tôi tiế n hà nh kiể m tra đoạ n
gen đượ c nhân lên bằ ng phương phá p điệ n di trên agarose 1%. Kế t quả đượ c
thể hiệ n như trong ả nh 3.1 v 3.2.