Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện hà nội bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC MS

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


TRẦN THỊ LAN


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN HÀ NỘI BẰNG KỸ
THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC – MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN HÀ NỘI BẰNG KỸ
THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC- MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương
ThS. Nguyễn Trung Hiếu
Nơi thực hiện: Phòng Hóa Lý – TT kiểm
nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm Hà Nội



HÀ NỘI – 2013


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với
ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương, ThS. Nguyễn Trung Hiếu đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận này.
Em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và độc chất – Trường
Đại Học Dược Hà Nội, ban giám đốc cùng toàn bộ cán bộ,nhân viên phòng Hóa lý-
Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp
đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để thực hiện đề tài.
Em chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, phòng đào tạo, cùng các thầy cô
bộ môn hoá phân tích và độc chất và các bộ môn khác của trường Đại Học Dược
Hà Nội đã tạo những điều kiện tốt nhất để emhoàn thành quá trình học tập tại

trường.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn gia đình,người thân,bạn bè đã luôn khích
lệ,chia sẻ,động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!



Hà Nội, tháng 5/2013
Sinh viên

Trần Thị Lan









MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1.TỔNG QUAN VỀ METRONIDAZOL 3
1.1.1. Công thức cấu tạo 3
1.1.2. Tính chất lý hóa 3
1.1.3. Đặc điểm dược động học 3
1.1.4. Dược lý – dược lâm sàng 4
1.1.5. Chế phẩm chứa metronidazol trên thị trường 5

1.1.6. Một số phương pháp định lượng metronidazol 6
1.2.THỰC TRẠNG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 7
1.2.1. Thành phần, tính chất nước thải bệnh viện 7
1.2.2. Tình trạng nước thải bệnh viện hiện nay 9
1.3.TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT LC/MS 9
1.3.1. Khái niệm 9
1.3.2. Cấu tạo 9
1.3.3. Một số kỹ thuật LC/MS 15
CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 17
2.1.1. Hóa chất và thiết bị 17
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 18
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH 20
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. CHUẨN BỊ MẪU 22
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 24
3.2.1. Khảo sát điều kiện khối phổ 24
3.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 26


3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu và ảnh hưởng của nền mẫu 28
3.3. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 32
3.3.1.Tính thích hợp của hệ thống 32
3.3.2. Độ chọn lọc 32
3.3.3. Khảo sát độ tuyến tính 33
3.3.4. Độ đúng 34
3.3.5. Độ chính xác 35
3.3.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 36

3.3.7. Khảo sát độ ổn định 37
3.3.7.1. Độ ổn định trong dung môi 37
3.3.7.2. Độ ổn định trong dung dịch thử 39
3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MTD TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 40
3.5. BÀN LUẬN 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
















DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APCI : Atmospheric pressure chemical ionization
( Ion hóa hóa học ở áp suất thường )
BOD : Biochemical Oxygen Demand
( Nhu cầu oxy sinh hóa )
COD : Chemical Oxygen Demand

( Nhu cầu oxy hóa học )
ESI : Electrospray ionization
( Ion hóa phun điện tử )
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
( Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
IT.s : Intensity.seconds
( Cường độ tín hiệu. giây )
LC/MS : Liquid chromatography – Mass spectrometry
( Sắc ký lỏng - khối phổ)
LOD : Limit of detection
( Giới hạn phát hiện)
LOQ : Limit of quantification
( Giới hạn định lượng)
MTD : Metronidazol
RSD%: Relative Standard Deviation
( Độ lệch chuẩn tương đối )
SD : Standard Deviation
( Độ lệch chuẩn )
SIM : Selected Ion Monitoring
( Chọn lọc ion )
SPE : Solid phase extraction
( Chiết pha rắn )
SRM : Selected Reaction Monitoring
( Chọn lọc ion con sau phản ứng )


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ các chất ô nhiễm trong nước thải
bệnh viện: QCVN 28:2010/BTNMT 8
Bảng 3.1: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc MTD trong nước ( C) 22

Bảng 3.2: Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn MTD trong nước thải 22
Bảng 3.3: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nước ( QC-W) 23
Bảng 3.4: Chuẩn bị các mẫu QC trong nước thải 23
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 27
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tốc độ dòng 27
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng chiết của các phương pháp 31
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 32
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của MTD 34
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 36
Bảng 3.12: Kết quả độ ổn định của MTD trong dung môi 38
Bảng 3.13: Kết quả độ ổn định của MTD trong nước thải 39
Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu nước thải bệnh viện 40















DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Mô hình hệ thống LC/MS 10

Hình 1.2: Các bộ phận của detector khối phổ 12
Hình 1.3: Bộ ion hóa phun điện tử ESI 13
Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực đơn 14
Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của khối phổ 2 lần MS/MS 15
Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030 17
Hình 2.2: Mô hình thực nghiệm 19
Hình 3.1: Phổ MS của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml 24
Hình 3.2: Phổ MS
2
của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml, CE = 15 V 25
Hình 3.3: Phổ MS
2
của dung dịch chuẩn MTD 5 µg/ml, CE = 25 V 25
Hình 3.4: Quy trình chiết MTD trong nước thải bệnh viện bằng chiết lỏng-lỏng 29
Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn MTD 0,05µg/mL trong nước (a) và khi tiêm
mẫu nước thải trắng đã được xử lý chiết lỏng – lỏng (b) 30
Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu nước thải trắng đã qua xử lý chiết pha rắn 30
Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu nước thải trắng (a), mẫu chuẩn MTD (0,005 µg/mL)(b).33
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ MTD 34
Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định LOD của dung dịch chuẩn MTD 37






1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nước thải bệnh viện là một trong những mối quan tâm, lo ngại vì chúng có thể

gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và nguy hại đến đời sống con người. Điều
quan tâm hàng đầu đối với nước thải của các bệnh viện là vấn đề các vi trùng gây
bệnh và thuốc kháng sinh
.
Các sinh vật được tiếp xúc lâu dài với các chất kháng
sinh ở nồng độ thấp trong môi trường sẽ kích thích sự phát triển của các chủng vi
khuẩn kháng thuốc và duy trì quần thể các chủng kháng thuốc. Hiện tượng kháng
kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người, đang
là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn kháng kháng sinh làm giới hạn
khả năng điều trị nhiễm trùng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh
nhưng kháng kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi
khuẩn gây bệnh khác. Nhưng tình trạng xử lý nước thải bệnh viện hiện nay lại
chưagiám sát được dư lượng thuốc kháng sinh, chưa được đưa vào tiêu chuẩn quản
lý.
Metronidazol là một dẫn chất thuộc nhóm 5- nitro imidazol, có phổ hoạt tính
rộng trên động vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí. Nên
metronidazol có một vị trí rất quan trọng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn,
đặc biệt là vi khuẩn kỵ khí. Vì vậy, việc định lượng hàm lượng kháng sinh
metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà Nội là
rất cần thiết nhằm xác định được tình hình thực trạng dư lượng kháng sinh trong
nguồn nước thải và đề xuất những giải pháp quản lý, xử lý phù hợp nhằm đem lại
hiệu quả cao và tránh được tình trạng kháng kháng sinh.
Hệ thống phân tích LC/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều
kiện cho các nhà khoa học thực hiện được các nghiên cứu phức tạp. Với ưu điểm
vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp
dụng nhiều trong nghiên cứu các chất có hàm lượng thấp.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp
định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải
một số bệnh viện Hà Nội bằng kỹ thuật LC- MS”.
Với các mục tiêu:

2


1. Khảo sát điều kiện định lượng kháng sinh metronidazol bằng kỹ thuật LC- MS.
2. Thẩm định phương pháp định lượng vừa xây dựng.
3. Áp dụng phương pháp để khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong
nước thải tại một số bệnh viện Hà Nội.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH METRONIDAZOL
1.1.1. Công thức cấu
tạo[4], [5], [26], [33].






• Công thức phân tử: C
6
H
9
N
3
O
3

• Khối lượng phân tử: M = 171,2 g/mol.
• Tên khoa học: 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethan-1-ol
1.1.2. Tính chất lý hóa [4], [27], [28].

 Tính chất vật lý:
- Tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, bền vững ở ngoài
không khí, sẫm màu khi tiếp xúc dần với ánh sáng .
- Nóng chảy ở nhiệt độ 159 – 163
0
C .
- Độ tan: khó tan trong nước, aceton, methylen clorid, ethanol 96%. Rất khó tan
trong ether.
Cụ thể, độ tan của metronidazol (g/100mL) ở 20
0
C là: trong nước 1,0; trong
ethanol 0,5; ether < 0,05.
 Tính chất hóa học:
Hóa tính của metronidazol là hóa tính của nhóm nitro thơm và nhân dị vòng thơm
imidazol. Ứng dụng các hóa tính này để định tính, định lượng và pha chế MTD.
1.1.3. Đặc điểm dược động học [3], [6].
Metronidazol hấp thu nhanh và hoàn toàn qua đường tiêu hóa, đạt tới nồng độ
trong huyết tương khoảng 10 µg/mL khoảng 1 giờ sau khi uống 500 mg. Khoảng
10 - 20 % thuốc liên kết với protein huyết tương. Metronidazol thâm nhập tốt vào


4

các mô và dịch cơ thể (như trong nước bọt, dịch não tủy, mủ của áp xe não, mủ
viêm tai giữa, đờm, lợi, mủ màng phổi, sữa, mủ áp xe gan, nước ối, tổ chức phôi,
tinh dịch, thủy dịch) với nồng độ tương tự như trong huyết tương. Thuốc cũng qua
được nhau thai và đi vào tuần hoàn thai nhi nhanh chóng. Chuyển hóa ở gan thành
các chất chuyển hóa dạng hydroxy và acid, các chất chuyển hóa còn hoạt tính, thải
trừ chủ yếu qua nước tiểu, thời gian bán thải khoảng 8 giờ.
1.1.4. Dược lý – dược lâm sàng [3], [4], [6], [7].

1.1.4.1. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Metronidazol là một dẫn chất 5 - nitro - imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động
vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí.
• Metronidazol là một thuốc rất mạnh trong điều trị nhiễm động vật nguyên sinh
như Entamoeba histolytica, Giardia lambliavà Trichomonas
vaginalis.Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn
trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng
không có tác dụng trên vi khuẩn ái khí.
• Có tác dụng diệt vi khuẩn Campylobacter/ Helicobacter pylori gây bệnh viêm dạ
dày mạn tính và loét dạ dày tá tràng.
• Cơ chế: Trong ký sinh trùng, nhóm 5 - nitro của thuốc bị khử thành các chất trung
gian độc với tế bào. Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm
vỡ các sợi này và cuối cùng làm tế bào chết. Nồng độ trung bình có hiệu quả của
metronidazol là 8 µg/mL hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh
và các vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) các chủng nhạy cảm
khoảng 0,5 µg/mL.
• Kháng thuốc: Metronidazol chỉ bị kháng trong một số ít trường hợp, thường gặp
ở một vài chủng Trichomonas vaginalis, hiếm khi gặp với Bacteroides và những
vi khuẩn kỵ khí khác . Các chủng kháng Metronidazol đã được chứng minh chứa
ít ferrdoxin, chất này là một protein xúc tác khử hóa metronidazol. Trong các
chủng đó, ferredoxin giảm nhưng không mất hoàn toàn, có lẽ giải thích tại sao
nhiễm khuẩn với các chủng kháng đó lại đáp ứng với liều metronidazol cao và
kéo dài hơn.
5



1.1.4.2. Chỉ định
- Ðiều trị các trường hợp nhiễm Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica (thể
cấp tính ở ruột và thể áp xe gan), Dientamoeba fragilis ở trẻ em, Giardia lamblia

và Dracunculus medinensis.
- Ðiều trị nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn kỵ khí nhạy cảm như nhiễm khuẩn ổ
bụng, nhiễm khuẩn phụ khoa, nhiễm khuẩn da và các cấu trúc da, nhiễm khuẩn hệ
thần kinh trung ương, nhiễm khuẩn huyết và viêm màng trong tim. Phối hợp với
uống Neomycin, hoặc Kanamycin để phòng ngừa khi phẫu thuật ở người phải phẫu
thuật đại trực tràng và phẫu thuật phụ khoa.
- Viêm lợi hoại tử loét cấp, viêm lợi quanh thân răng và các nhiễm khuẩn răng khác
do vi khuẩn kị khí. Bệnh Crohn thể hoạt động ở kết tràng, trực tràng. Viêm loét dạ
dày - tá tràng do Helicobacter pylori (phối hợp với 1 số thuốc khác).
1.1.4.3. Chống chỉ định
- Có tiền sử quá mẫn với metronidazol hoặc các dẫn chất nitro-imidazol khác.
- Bệnh nhân động kinh.
- Rối loạn đông máu.
- Người mang thai 3 tháng đầu, thời kì cho con bú.
1.1.4.4. Tác dụng không mong muốn (ADR)
Thường gặp: buồn nôn, nhức đầu, chán ăn, khô miệng, nôn mửa, tiêu chảy, miệng
có vị kim loại. Nặng: co giật, mất điều hòa, giảm bạch cầu, rối loạn đông máu.
1.1.5. Chế phẩm chứa metronidazol trên thị trường [3], [4], [6].
- Viên nén metronidazol hàm lượng 250 mg và 500 mg.
- Thuốc đạn, thuốc trứng 500 mg, 1000 mg.
- Dịch truyền 100 mL chứa 500 mg metronidazol, thuốc tiêm 5 mg/mL.
- Kem bôi da, âm đạo 10%.
- Viên nang 373 mg, 500 mg.
- Nhũ dịch metronidazol.
- Dạng viên nén giải phóng kéo dài 750mg.


6

- Dạng gel 10% .

1.1.6. Một số phương pháp định lượng Metronidazol đã được tiến hành.
1.1.6.1. Định lượng metronidazol bằng đo acid trong môi trường khan:
• Chỉ thị đo thế: [4], [5], [23], [28].
Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol trong acid acetic khan, chuẩn độ bằng
HClO
4
0,1 N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo thế. 1mL
dung dịch acid HClO
4
0,1 N tương đương với 17,12 mg C
6
H
9
N
3
O
3
.
• Chỉ thị màu: [1], [29], [30], [31], [32], [33].
Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol bằng anhydrid acetic, đun nóng nhẹ để
hòa tan chất tan, làm lạnh và thêm một giọt thuốc thử xanh malachite TS ( hoặc chỉ
thị là p- naphtholbenzein chuẩn). Định lượng bằng acid HClO
4
0,1 N, kết thúc định
lượng khi dung dịch chuyển màu vàng xanh đối với malachit (chuyển từ vàng xanh
sang xanh lá cây đối với chị thị naphtholbenzein). 1mL HClO
4
ứng với 17,12 mg
C

6
H
9
N
3
O
3
.
1.6.1.2. Định lượng bằng quang phổ UV-VIS:
• Trong môi trường acid: [4], [5]
Dựa vào khả năng hấp thụ UV của Metronidazol: đo độ hấp thụ của dung dịch
Metronidazol trong HCl 0,1 N ở bước sóng hấp thụ cực đại 277 nm. Mẫu trắng là
dung dịch HCl 0,1 N. A( 1%, 1 cm ) ở 277nm là 377. Tiến hành song song với
chuẩn cùng điều kiện.
• Trong môi trường kiềm:
[10], [12]
Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol bằng dung dịch NaOH 0,1 N trong bình
định mức 100 mL. Lọc bỏ 20 mL dung dịch đầu, hút 1mL dịch lọc tiếp theo vào
bình định mức 100 mL, bổ sung NaOH 0,1 N tới vạch, lắc đều. Dung dịch thu được
đem đo mật độ quang ở bước sóng 319 nm với mẫu trắng là NaOH 0,1 N. A (1%, 1
cm) ở 319 nm là 377. Song song tiến hành với chuẩn cùng điều kiện.
1.6.1.3. Định lượng bằng đo nitrit: [4].
Bằng cách khử nhóm nitro thơm bằng hydro mới sinh thành nhóm amin thơm, định
lượng metronidazol dựa vào nhóm chức amin thơm này.
7



1.6.1.4. Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ):[9].
Định lượng Metronidazol bằng HPLC với chương trình chạy như sau:

- Cột Supelco IC-AB2 C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm).
- Detector UV đặt ở 292 nm.
- Pha động: acid phosphoric 0,01 M : CH
3
CN : CH
3
OH ( 1000 : 225 : 25 ).
Metronidazol có tính base, nên dùng pha động pH = 2,4 ( <3) có lợi hơn dùng pH
trung hòa. Metronidazol rất dễ tan trong acid, bề rộng của pic sẽ hẹp và tính đối
xứng được đảm bảo (hệ số cân đối 0,9- 1,1).
1.2. Giới thiệu chung về thực trạng nước thải ở các bệnh viện tại Hà Nội [37],
[38].
1.2.1. Thành phần, tính chất nước thải bệnh viện
Thành phần chính gây ô nhiễm môi trường do nước thải bệnh viện gây ra là:
- Các chất hữu cơ: BOD, COD.
- Các chất rắn lơ lửng .
- Các vi trùng, vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, tụ cầu, liên cầu, virus đường tiêu
hóa, bại liệt, các loại kí sinh trùng, amip, nấm…
- Các mầm bệnh sinh học khác trong máu, mủ, dịch, đờm, phân của người
bệnh.
- Các loại hóa chất độc hại từ cơ thể và chế phẩm điều trị, thậm chí cả chất phóng
xạ.

8


Bảng1.1:Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ các chất ô nhiễm trong nước
thải bệnh viện: QCVN 28:2010/BTNMT
TT Thông số Đơn vị
Giá trị C
A B
1
pH
-
6,5 – 8,5
6,5 – 8,5
2
BOD
5
(20
o
C)
mg/L
30
50
3
COD
mg/L
50
100
4 Tổng chất rắn lơ lửng (TSS) mg/L 50 100

5
Sunfua (tính theo H
2
S)
mg/L
1,0
4,0
6
Amoni (tính theo N)
mg/L
5
10
7
Nitrat (tính theo N)
mg/L
30
50
8
Phosphat (tính theo P)
mg/L
6
10
9
Dầu mỡ động thực vật
mg/L
10
20
10
Tổng hoạt độ phóng xạ α
Bq/L

0,1
0,1
11
Tổng hoạt độ phóng xạ β
Bq/L
1,0
1,0
12
Tổng coliforms
MPN/100mL
3000
5000
13
Salmonella
Vi khuẩn/100 mL
KPH
KPH
14
Shigella
Vi khuẩn/100ml
KPH
KPH
15
Vibrio cholerae
Vi khuẩn/100mL
KPH
KPH
KPH: Không phát hiện
- Cột A quy định giá trị tối đa cho phép trong nước thải y tế khi thải vào các nguồn
nước được dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt.

- Cột B quy định giá trị tối đa cho phép trong nước thải y tế khi thải vào các nguồn
nước không dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt.
- Trường hợp nước thải y tế dẫn đến hệ thống xử lý nước thải tập trung thì áp dụng
theo
quy định của đơn vị quản lý, vận hành hệ thống xử lý nước thải tập trung.
9

1.2.2. Mức độ xử lý và tình trạng nước thải hiện nay tại các bệnh viện[37],
[38].
Trong bối cảnh quản lý, xử lý nước thải gần như bị thả lỏng, đáng chú ý hơn cả là,
từ trước đến nay, ngành y tế chưa kiểm soát kháng sinh trong nước thải bệnh viện.
Từ năm 2009, Viện Y học Lao động & Vệ sinh Môi trường cùng với một số đơn vị
như Viện Pasteur Nha Trang, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, Viện Vệ sinh Lao
động TP.HCM thực hiện chương trình quan trắc của Bộ Y tế, trong đó có quan trắc
nước thải bệnh viện. Kết quả quan trắc cho thấy, nước thải bệnh viện có đặc điểm ô
nhiễm chủ yếu như nước thải sinh hoạt chứa vi khuẩn,trong đó có vi sinh vật gây
bệnh đường ruột vốn dễ dàng lây truyền qua nước. Một số chất độc tế bào hay dư
lượng thuốc kháng sinh cũng có khả năng có trong nước thải bệnh viện. Tuy nhiên,
đến nay vẫn chưa xác định được hai thành phần độc hại nói trên. Nguyên do là các
cơ quan này không có phòng thí nghiệm đủ điều kiện phân tích.
Thống kê của Bộ Y tế mới đây cho thấy 67,7% số bệnh viện tuyến trung ương,
56,1% bệnh viện tuyến tỉnh và 44,4% bệnh viện tuyến huyện thực hiện thu gom và
xử lý nước thải theo quy định. Như vậy vẫn còn rất nhiều cơ sở y tế xả chất thải
lỏng ra môi trường.
1.3 . TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT LC/MS [1], [2], [8],[11], [13], [14], [20],
[21], [22], [24], [34]
1.3.1. Khái niệm
Sắc kí lỏng khối phổ là kĩ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các
chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc kí lỏng hiệu năng cao ( High performance
liquid chromatography-HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận

khối phổ( Mass spectrometry- MS).
1.3.2. Cấu tạo
Thành phần cơ bản của hệ thống LC/MS (Hình 1.1) gồm 7 phần chính:
- Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi)
- Hệ thống bơm (Pump system)
- Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
-Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)


10

-Cột sắc ký (pha tĩnh – stationary phase)
- Detector khối phổ
- Hệ thống xử lý dữ liệu

Hình 1.1: Mô hình hệ thống LC/MS
 Pha động
Là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm.
- yêu cầu:
• Độ tinh khiết cao (ví dụ: nước/đệm với MeOH/ACN)
• Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh
• Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm, lọc).
- Có hai cách dùng pha động để rửa giải:
• Đẳng dòng (rửa giải thường): Thành phần pha động không thay đổi trong suốt
quá trình sắc ký.
• Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường sử dụng từ 2 đến 4
loại dung môi khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký.
 Hệ thống bơm
- Chức năng: bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình
dung môi qua hệ thống sắc ký.

- Ðặc diểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:
Đáp ứng
tín hiệu

Hệ
thống
bơm
Detector
MS
11

• Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)
• Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 mL/min
• Thể tích chết nhỏ
• Trơ với dung môi của pha động
• Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau
 Hệ tiêm mẫu
Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà
không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng chứa mẫu có
dung tích khác nhau, thường dùng loại 0,5-20µL.
 Buồng cột
Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích.
 Cột sắc ký
Là một loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha tĩnh), kích thước cột:
Dài (L): 10-30cm, đường kính trong: 4-10mm, kích cỡ hạt: 5-10µm. Thông thường
chất nhồi trong cột là Silicagel hoặc Silicagel đã được silan hóa, hoặc được bao một
lớp mỏng hữu cơ, ngoài ra người ta còn dùng các hạt khác như nhôm oxyd, polyme
xốp, chất trao đổi ion
 Detector khối phổ
Là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột, các tín hiệu

này được ghi trên sắc đồ.
Việc sử dụng MS làm detector có những ưu điểm sau:
•Độ nhạy cao (phân tích được các chất ở mức độ vết).
•Đưa ra những thông tin về khối lượng và cấu tạo hóa học của chất phân tích.
•Làm tăng tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích.
*Nguyên tắc hoạt động:
Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo
thành trong pha khí từ nguyên tử hay phân tử của mẫu.Các ion được tạo thành
trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến
detector. Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không, áp suất trong hệ
dao động từ 10
-3
Pa đến 10
-6
Pa. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện


12

bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ
hay phổ khối. Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các
chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất.
*Nhiệm vụ của detector khối phổ:
Chuyển các ion đã đến detector thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy
khối phổ.
*Các bộ phận của detector khối phổ:

Hình 1.2:Các bộ phận của detector khối phổ
 Bộ nạp mẫu:
Là đầu ra của máy sắc ký lỏng, kết nối với khối phổ.
 Bộ nguồn ion hóa:
Là bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ: ion hóa chất cần phân tích, khử dung môi
để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển
với bộ phận nằm trong chân không sâu và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion
khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo.
Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hiện nay thường sử dụng hai kỹ
thuật là kỹ thuật ion hóa phun điện tử ( ESI) và ion hóa bằng hóa học ở áp suất
thường
(APCI) . Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI.

- Kỹ thuật phun ion ESI ( Electrospray ionization) :
Xử lý dữliệu
Bơm chân không

Hệ chân không áp suất 10
-3
– 10
-6
Pa
Nạp mẫu
Nguồn ion
Phân tích khối

detector
13

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao
quản bằng kim loại cao thế 1- 6 kV ( điện thế dương ở đầu ion kim loại tạo ion
dương, điện thế âm ở đầu kim loại tạo ion âm), sau đó được phun mịn bằng khí nitơ
thoát ra xung quang ống mao quản. Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ
bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện
tích cùng dấu sẽ bẻ dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích. Các ion dương
hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi
và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài.

Hình 1.3: Bộ ion hóa phun điện tử ESI
APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực có khối lượng nhỏ hơn
1000. ESI được sử dụng nhiều hơn cho những phân tử phân cực nhiều hơn và có
khối lượng phân tử khối lớn ( ion đa điện tích với protein). Trong trường hợp cả hai
kỹ thuật đều dùng được trong phân tích một hóa chất xác định, ESI được ưu tiên
hơn; tuy nhiên vẫn cần thí nghiệm để lựa chọn kỹ thuật thích nghi nhất.
 Bộ phân tích khối:
Bộ phận này được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion của
máy có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Các ion được gia tốc và
tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector. Bộ phân tích
khối phân thành 4 loại:
• Bộ phân tích tứ cực ( Quadrupole analyser )
• Bộ phân tích từ ( Magnetic analyser )
• Bộ phân tích thời gian bay ( Time of flight analyser - TOF )


14

• Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser–ICR)
Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực
(quadrupole mass spectrometer). Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt
song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ:

Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực đơn
Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC. Chúng làm cho
các phân tử chuyển động quanh trục trung tâm. Do đó chỉ các ion nhất định mới tới
được detector, sự thay đổi tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác
nhau lần lượt tới detector.
Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : Không nghiên cứu được cơ
chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc
hoá học, do kỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ
thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ
nhạy, độ chính xác.
Máy đo khối phổ hai lần liên tiếp MS/MS gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc
lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell ).
MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion mẹ ( precursor ion ), ion này
liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những
ion con ( product ion ), tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion
này. Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu.
15


Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của khối phổ 2 lần MS/MS
 Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu:
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm
kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết
xuất dữ liệu thô vừa thu được.
1.3.3. Một số kỹ thuật LC/MS:

1.3.3.1. Kỹ thuật phân tích toàn thang ( Full scan).
Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ được đưa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta
có một sắc đồ toàn ion TIC ( Total Ion Chromatogram).Kỹ thuật này cho đầy đủ
các thông tin liên quan về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương pháp này có độ
nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn.
1.3.3.2. Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion SIM ( Selected Ion Monitoring).
Kỹ thuật này chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian. Kỹ
thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy ( tăng
tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu đường nền). Kỹ thuật SIM nhạy hơn Fullscan. Kỹ thuật này
thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp.
1.3.3.3. Kỹ thuật MS/MS.
Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó được phân tích tiếp bằng cách
sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân
tích MS lần 2. Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy
do làm giảm nhiễu đường nền đáng kể.




16

1.3.3.4. Kỹ thuật SRM ( Selected Reaction Monitoring).
Nếu khi lấy khối phổ 2 lần MS/MS ( MS
2
) mà khối phổ kế chỉ ghi nhận một mảnh
ion con mà thôi thì ta nói sử dụng kỹ thuật SRM ( chọn lọc ion con sau phản ứng).
Đây là một kỹ thuật định lượng khá chính xác.

17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1.1. Hóa chất

• Chất chuẩn Metronidazol (Merck, số lô 086M4014), hàm lượng 99,90%, độ ẩm
0,03%
• Hóa chất: acid formic (HPLC, Merck), acid acetic (HPLC, Merck), amoni acetat
(HPLC, Merck)
• Dung môi: methanol (HPLC, Merck), acetonitril (HPLC, Merck), nước cất 2
lần.
2.1.1.2. Thiết bị, dụng cụ
• Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030

Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS/MS 8030
• Cột sắc ký Apollo C18 ( 150 x 4,6 mm, 5 µm)
• Bộ chiết pha rắn với cột AccuBOND II Evidex Cartridges C18 ( 3mL,
200mg)
• Bình chiết 500 mL
• Bếp cách thủy ( GLF, Đức)
• Bể đánh siêu âm(Branson 2210, Mỹ)
• Máy đo pH (Cyber Scan 500, Singapore)
• Cân phân tích (Sartorius, d = 0,1 mg, Đức)
• Bộ dụng cụ lọc mẫu, bộ dụng cụ lọc dung môi.