Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THANH THẢO


NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM
PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THANH THẢO


NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM
PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Bacillus subtilis natto
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đàm Thanh Xuân

2. DS. Đinh Thu Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI – 2013



LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
chân thành nhất tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công
nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và DS. Đinh Thu Hương, những
người đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập,
nghiên cứu khoa học.
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy,
cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy
cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Đinh Thị Thanh Thảo


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 2
1.1.1. Enzym vi sinh vật 2
1.1.2. Chiết xuất và thu nhận enzym từ vi sinh vật 3
1.1.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym 6
1.1.4. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc
chi Bacillus 6
1.2. Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus
subtilis natto 9
1.2.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis natto 9
1.2.2. Đặc điểm của protease ngoại bào của B. subtilis natto 10
1.2.3. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 14
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 14
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14
2.1.3. Môi trường 14
2.1.4. Máy móc và dụng cụ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết
protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15
2.2.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu … 15
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15


2.3.2. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym 16
2.3.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease 17

2.3.4. Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protease 17
2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease 19
2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE 21
2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin 21
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN 22
3.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết
protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto………… 22
3.1.1. Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto 22
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào
của B. subtilis natto 23
3.1.3. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của
B. subtilis natto 26
3.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 32
3.2.1. Tinh chế protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75 32
3.2.2. Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế 36
3.2.3. Sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC









DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AS :

Amoni sulfat
bh :

bão hòa
CM :

Carboxymethyl
Sắc kí trao đổi ion CM :

Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm
trao đổi là cation carboxymethyl
CMC :

Carboxy methyl cellulose
DEAE :

Diethylaminoethyl
Sắc kí trao đổi ion DEAE :

Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm
trao đổi là anion diethylaminoethyl
E :

Enzym
FU :

Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân
giải fibrin của chất nghiên cứu)

kDa :

kilo Dalton
mBar :

mili Bar
N
0
:

Lần thí nghiệm
nKat :

nano Katal
pI :

Điểm đẳng điện của protein
Quy mô PTN :

Quy mô phòng thí nghiệm
SDS :

Sodium dodecyl sulfat (Natri dodecyl sulfat)
SDS – PAGE

:

Sodium dodecyl sulfat – Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
Điện di SDS – PAGE :

Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của natri
dodecyl sulfat
TLPT :

Trọng lượng phân tử
t – PA :

Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa
plasminogen ở mô)
UF :

Mảng siêu lọc Ultra Filtration


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Trang
B
ả
ng 1.1:
Các phương pháp sắc kí 5
B
ả
ng 1.2
:

Các loại gel Sephadex

5
Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus

7

B
ả
ng 1.4:

Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B.
subtilis
8
B
ả
ng 1.
5
:
Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của
B. subtilis natto
12
B
ả
ng 2.1
:
Nguyên liệu và hóa chất 14
B
ả
ng 2.2
:
Thiết bị được sử dụng

15

B
ả
ng 3.1
:
Sơ bộ thử hoạt tính các enzym trong dịch nuôi cấy B.
subtilis natto
22
B
ả
ng 3.2:

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến
hoạt tính enzym protease của dịch trong
24
B
ả
ng 3.3
:
Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã
biết nồng độ
26
B
ả
ng 3.4:
Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột,
CMC của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng
độ amoni sulfat bão hòa khác nhau
27
B
ả

ng 3.5:
Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ
protease của các dịch enzym khi chiết xuất với các
nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau
29
B
ả
ng 3.6:
Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt
độ protease của các dịch enzym thu được theo quy
trình kết tủa phân đoạn
31
Bảng 3.7: Kết quả thử khả năng phân giải casein của các phân
đoạn thu được sau tinh chế
33


B
ả
ng 3.8:
Đánh giá sự có mặt của α – amylase và cellulase trong

các phân đoạn
34
B
ả
ng 3.9:
Kết quả các giai đoạn tách chiết và tinh chế protease

35

B
ả
ng 3.10
:
Kết quả đo đường kính vòng phân giải fibrin

38



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Tên hình Trang
Hình 1.1
:
Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease 6
Hình 1.2
:
Năng suất và mức tinh sạch của protease chiết xuất từ
môi trường nuôi cấy B. subtilis
9
Hình
1.3
:
Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới
dạng muối halogen
9
Hình
1.4
:
Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto 10

Hình 3.1:
Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein
tại các giá trị pH khác nhau
24
Hình 3.2:
Biểu đồ mẫu định lượng protein theo phương pháp
Biuret
26
Hình 3.3: Khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các
dịch enzym khi chiết xuất với các nồng độ amoni
sulfat bão hòa khác nhau
28
Hình 3.4:
Mối liên hệ giữa hoạt tính enzym protease
của các phân đoạn và thể tích rửa giải (V
e
)
34
Hình 3.5:
Kết quả điện di SDS – PAGE

37

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, các chế phẩm enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzym phá vỡ
liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzym có nhiều ứng dụng trong
một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt

trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả
tốt.
Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin,
tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng
đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các
loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn
thuộc chi Bacillus. [55]
Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món
ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật đã phát
hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm các enzym
protease có khả năng phân giải fibrin [53]. Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về
Bacillus subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có
khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [31], elastase [62],
bacillopeptidase F [64]…
Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng vấn đề đặt
ra là làm cách nào để có thể thu được protease từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease bằng amoni sulfat từ môi
trường nuôi cấy B. subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết
protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.3. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật
1.3.1. Enzym vi sinh vật
Enzym là các chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao, phần lớn có bản
chất là protein; có ở trong tất cả các tế bào sống và có thể duy trì được hoạt tính xúc

tác sau khi tách ra khỏi cơ thể sống (ở những điều kiện nhất định). [2],[8],[14]
Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzym bằng phương pháp hóa học (các
synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt
tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzym hiện nay vẫn được chiết tách
từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật. [3],[8]
Vi sinh vật là nguồn thu enzym rất phong phú trong đó có những enzym mà
cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được. Vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp enzym với một lượng lớn, trong thời gian ngắn. Con người có thể tác động
vào vi sinh vật để thu được enzym theo ý muốn. Mặt khác enzym vi sinh vật thường
có hoạt tính mạnh. [14],[17],[36]
Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ
yếu:
 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym
 Chiết tách và thu nhận enzym
 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym
Quá trình phân lập, tuyển chọn, cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo ra giống vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các
biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến
nạp, tải nạp, tiếp hợp gen). [14],[17],[36]
Quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym được thực hiện bằng
phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc phương pháp nuôi cấy chìm. Cần lựa chọn thành
phần môi trường dinh dưỡng (đặc biệt là các chất cảm ứng); kiểm soát các thông số
3

của quá trình nuôi cấy như: nhiệt độ, pH, chế độ cấp khí… để quá trình sinh tổng
hợp enzym của vi sinh vật được diễn ra trong điều kiện tối ưu. [14],[17],[36]
1.3.2. Chiết tách và thu nhận enzym từ vi sinh vật
Các bước của quá trình chiết tách và tinh sạch enzym từ vi sinh vật được tiến
hành như sau:

a) Phá vỡ tế bào
Thực hiện với các enzym tập trung chủ yếu ở trong tế bào vi sinh vật (enzym
nội bào). Đối với các enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường nuôi cấy
(enzym ngoại bào) có thể bỏ qua bước này. Các phương pháp hay được sử dụng để
phá vỡ tế bào: phương pháp cơ học (sử dụng sóng siêu âm, máy đồng hóa cao
áp…); các phương pháp khác (sốc thẩm thấu, xử lý kiềm, sử dụng các chất tẩy rửa,
dung giải bằng enzym, phương pháp “tự phân”…). Đối với những enzym tồn tại ở
dạng gắn chặt vào màng tế bào thì phải sử dụng các chất tẩy không phân cực để tách
enzym ra khỏi màng. [6],[14],[26],[36]
b) Chiết tách enzym
Sử dụng dung môi để chiết tách enzym như: nước, acid, kiềm loãng, dung
dịch đệm, dung môi hữu cơ. Nếu dịch chiết enzym có nồng độ thấp có thể cô đặc để
tăng nồng độ enzym. Thông thường, người ta hay dùng các dung dịch đệm có lực
ion và pH thích hợp để chiết tách enzym [3],[14]. Sau khi chiết tách tiến hành các
bước sau:
Tách các phần tử không hòa tan: Dùng kỹ thuật li tâm, lọc. [6],[14],[36]
Loại các thành phần không phải protein: Chất phân tử lượng thấp (thẩm
tích, lọc gel, siêu lọc); acid nucleic (thủy phân bằng nuclease, protease); lipid (sử
dụng dung môi hữu cơ). [6]
Tách phân đoạn protein và enzym: Tùy theo đặc tính của enzym như trọng
lượng phân tử, điện tích hay tính ổn định mà có các kỹ thuật tách chiết và tinh chế
khác nhau [3],[14]. Các nhóm phương pháp cụ thể thường được sử dụng bao gồm:
 Kết tủa enzym: Do đa số các enzym có bản chất là protein nên có thể sử
dụng các yếu tố như pI, lực ion, trọng lượng phân tử… để kết tủa enzym từ dịch
4

chiết. Phương pháp thường được sử dụng để kết tủa enzym là phương pháp diêm
tích và phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. [5],[6],[36]
Phương pháp diêm tích: Enzym có thể được kết tủa bằng muối do hiện tượng
“salting out” (tính tan của protein enzym giảm mạnh ở nồng độ muối cao). Mỗi

enzym có một khoảng nồng độ muối mà enzym đó bị kết tủa hoàn toàn gọi là
khoảng nồng độ muối tách; do đó nên tiến hành kết tủa phân đoạn nhằm thu được
enzym mong muốn [6],[14],[26]. Các loại muối được dùng để kết tủa enzym theo
phương pháp này bao gồm: amoni sulfat, magnesi sulfat, natri sulfat… trong đó
amoni sulfat hay được sử dụng nhất do có một số ưu điểm sau:
+ Amoni sulfat có mức độ hòa tan rất cao trong nước (720g/l ở 25
0
C).
+ Ít làm mất hoạt tính enzym, có thể có tác dụng làm bền enzym.
+ Có khả năng kết tủa chọn lọc protein enzym khi bổ sung từ từ muối vào
dịch chiết enzym thô [3]. Một ưu điểm khác của amoni sulfat là giá thành thấp [5].
Tuy nhiên, kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat còn có một số nhược
điểm như: mất nhiều thời gian; nồng độ muối sử dụng thường cao nên tỷ trọng của
dung môi lớn, để thu được protein enzym cần phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ
thấp. Mặt khác, cần tiến hành tinh chế loại muối ra khỏi tủa enzym bằng phương
pháp thẩm tích hoặc sắc kí lọc gel. [3],[26]
Phương pháp kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: Dung
môi hữu cơ (có khả năng trộn lẫn với nước) được thêm vào dịch chiết enzym sẽ làm
giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm giảm độ tan của protein enzym và tạo kết
tủa. Các dung môi dùng phổ biến: aceton, ethanol, isopropanol. Để hạn chế ảnh
hưởng của dung môi đến hoạt tính của enzym cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới
0
0
C). [5],[6],[14]
Ngoài ra khi kết tủa enzym còn sử dụng các phương pháp khác như: kết tủa
enzym tại điểm đẳng điện, sử dụng các chất trợ (tinh bột, lactose) để cho tủa enzym
tạo thành ở dạng hạt hay sử dụng dung dịch polymer để kết tủa enzym. [14]
 Phương pháp sắc kí: Nguyên tắc của sắc kí trong chiết tách và tinh sạch
enzym là tách các enzym khác nhau từ dịch chiết dựa vào bản chất các liên kết của
5

phân tử enzym đó. Các enzym khác nhau sẽ di chuyển qua cột theo pha động với
tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và enzym; do đó
có thể tách riêng được enzym. Một số loại sắc kí và nguyên lí tách được trình bày
trên bảng 1.1. [5],[6],[14],[17],[26],[36]
Bảng 1.1: Các phương pháp sắc kí
Loại sắc kí Nguyên lí Tách theo
Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt
Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực
Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích
Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước, hình dạng phân tử

Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử
Kị nước Tương tác kị nước Cấu trúc phân tử
Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực
Tạo vòng kim loại Tạo phức Cấu tạo phân tử
Tương tác đặc hiệu
sinh học
Tương tác sinh học đặc
hiệu (enzym – cơ chất)
Cấu trúc phân tử
Quá trình chiết tách và tinh chế enzym thường sử dụng phương pháp sắc kí
lọc gel (sắc kí lọc rây phân tử). Mỗi loại gel thường có khả năng tách và tinh chế
các enzym có trọng lượng phân tử nằm trong một khoảng giới hạn thích hợp. Gel
được sử dụng rộng rãi nhất là gel Sephadex. Gel Sephadex có đặc điểm là trung hòa
về điện tích nên không có tương tác anion và cation. Dựa vào kích thước mắt lưới
của mạng lưới rây phân tử và phạm vi phân tách các chất theo trọng lượng phân tử,
Sephadex được chia thành 5 loại theo bảng 1.2. Chỉ số càng nhỏ thì kích thước mắt
lưới gel càng nhỏ. [14],[17],[36],[42]
Bảng 1.2: Các loại gel Sephadex

Loại gel
Sephadex
Phạm vi phân tách
theo TLPT (kDa)
Loại gel
Sephadex
Phạm vi phân tách
theo TLPT (kDa)
G – 25 0,1 – 5 G – 100 50 – 100
G – 50 5 – 10 G – 200 100 – 200
G – 75 10 – 50
 Các phương pháp khác để tách chiết và tinh chế enzym như: phương pháp
kết tinh; phương pháp phân tách lỏng – lỏng; phương pháp gây biến tính chọn lọc
protein sử dụng acid, kiềm hoặc nhiệt độ; phương pháp siêu li tâm; phương pháp
6

điện di không gây biến tính protein. Sau khi tách chiết và tinh chế, dịch enzym thu
được có thể được cô đặc bằng phương pháp siêu lọc, đông khô hoặc cô chân không.
[3],[14]
1.3.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym
Điện di trên gel polyacrylamid biến tính có mặt SDS (SDS – PAGE): là
phương pháp hay được sử dụng nhất. Phương pháp này sử dụng gel và đệm có chứa
SDS. Dưới tác dụng của SDS, các protein enzym sẽ bị duỗi thẳng, tích điện âm và
di chuyển về phía cực dương trong điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào
trọng lượng phân tử của protein enzym. Dựa vào các băng điện di xuất hiện trên
điện di đồ sau khi nhuộm màu để kiểm tra mức độ tinh sạch của chế phẩm. [14]
Ngoài ra có thể dùng một số phương pháp khác như: phương pháp phối hợp
điện di với sắc kí lọc gel; điện di gel hoạt tính; kỹ thuật phân tích khối phổ hay xác
định hoạt độ riêng của chế phẩm enzym. [3],[6],[14]
1.3.4. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus

Hiện nay, các enzym vi sinh vật được sử dụng ngày càng phổ biến trong
nhiều lĩnh vực; trong số đó có các enzym nhóm protease.
a) Khái niệm về protease
Nhóm enzym protease là các enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết
peptid (– CO – NH –) giữa các L – acid amin trong phân tử protein, polypeptid đến
sản phẩm cuối cùng là các L – acid amin (hình 1.1). Ngoài ra, nhiều protease cũng
có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển acid amin. [12]
H
2
N – CH – CO – NH – CH – CO – …. – NH – CH – COOH
R
1
R
2
R
x
H
2
N – CH – COOH + H
2
N – CH – CO … NH – CH – COOH
R
1
R
2
R
x
Hình 1.1: Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease
Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại
các nhóm enzym [2]. Có nhiều cách phân loại protease:

H
2
O
Protease
7

+ Phân loại theo pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzym, protease được
chia thành 3 nhóm: protease acid (pH hoạt động từ 2 – 4); protease trung tính (pH
hoạt động từ 7 – 8); protease kiềm (pH hoạt động từ 9 – 11). [12]
+ Phân loại theo vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease được chia
thành hai loại: endopeptidase (protease thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch
polypeptid) và exopeptidase (protease phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch
polypeptid) [12]. Các endoprotease có nhóm OH của Ser đóng vai trò quan trọng
trong hoạt động xúc tác được gọi là protease serin. Trong protease serin có hai họ
được nghiên cứu nhiều là: chymotrypsin và subtilisin. Đa số protease họ subtilisin
có nguồn gốc từ vi khuẩn như: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN [12],[55]
b) Protease ngoại bào của chi Bacillus và các phương pháp chiết tách
Chi Bacillus là chi vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease và
có nhiều ứng dụng trong công nghiệp; sản lượng protease trên 100 tấn/năm
[14],[36]. Các sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus và một số ứng dụng
của chúng được đưa ra trong bảng 1.3.
Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus [55]
Nhà sản xuất Tên thương mại

Nguồn vi sinh vật Ứng dụng
Rohm, Đức Corolase 7089 Bacillus subtilis
Công nghiệp thực
phẩm
Nagase
Biochemicals,

Nhật Bản
Bioprase
concentratre
B. subtilis
Mỹ phẩm, dược
phẩm
Cryst. Protease B. subtilis (K2) Nghiên cứu khoa học
Cryst. Protease B. subtilis (bioteus) Nghiên cứu khoa học
Bioprase B. subtilis Chất tẩy rửa
Bioprase SP – 10

B. subtilis
Công nghiệp thực
phẩm
Novo Nordisk,
Đan Mạch
Alcalase B. licheniformis Chất tẩy rửa
Savinase Bacillus sp. Công nghiệp dệt may
Durazym Bacillus sp. Chất tẩy rửa
Nue Bacillus sp. Công nghiệp thuộc da

Hiện nay, quy trình chiết tách protease ngoại bào của chi Bacillus vẫn được
nghiên cứu cả trên quy mô PTN và quy mô công nghiệp.
8

 Quy mô PTN: Quy trình chiết tách protease ngoại bào của loài Bacillus
subtilis thuộc chi Bacillus được nghiên cứu nhiều (bảng 1.4). Phương pháp chiết
tách hay được sử dụng là kết tủa bằng amoni sulfat 40 – 80% bão hòa; tinh chế bằng
phương pháp thẩm tích và sắc kí.
Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis

Trích dẫn
Phương pháp
chiết tách
Tinh chế và xác định TLPT
1. E. M. El - Safey
(2004) [30]
Tủa enzym: AS 40% bh Thẩm tích
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 200
2. Sadia Almas
(2009) [23]
Tủa enzym: AS 70% bh Thẩm tích
Sắc kí trao đổi ion (DEAE)
Sắc kí kị nước Phenyl Sepharose
3. Ishtiaq Ahmed
(2011) [22]
Kết tủa loại protein tạp:
AS 40% bh
Tủa enzym: AS 70% bh
Thẩm tích
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100
Điện di SDS – PAGE
4. Ravi Sankar
(2012) [59]
Tủa enzym: AS 50% bh

Thẩm tích
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100
Sắc kí trao đổi ion (DEAE)
Điện di SDS – PAGE
5. F. Mashayekhi

Mazar (2012) [43]
Hệ 2 pha: PEG 10.000
22%; citrat 18%
Điện di SDS – PAGE

6. Do Thi Bich
Thuy (2011) [27]
Tủa enzym: Ethanol
75%
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75
Điện di SDS – PAGE
Hiệu quả và mức tinh sạch của chế phẩm enzym so với dịch chiết enzym thô
ban đầu của một số quy trình chiết tách protease theo thứ tự trong bảng 1.4 (từ quy
trình 1 đến 5) được thể hiện trên đồ thị hình 1.2. Nhìn chung, hiệu quả của quy
trình chiết tách trên quy mô PTN sử dụng phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat
(thứ tự từ 1 đến 4) thường nhỏ hơn 10%. [30],[23],[22],[59],[43],[27]
Ở Việt Nam, ngoài nghiên cứu của Do Thi Bich Thuy, Trần Thị Hồng Nghi
bước đầu đã nghiên cứu khả năng ứng dụng protease của B. subtilis làm chất thủy
phân phụ phẩm trong công nghiệp thủy sản với kết quả khả quan. [9]
9


Hình 1.2: Hiệu quả và mức tinh sạch của protease
chiết tách từ môi trường nuôi cấy B. subtilis
 Quy mô công nghiệp: Quy trình chiết tách một enzym ngoại bào họ subtilisin
của Bacillus sp. theo phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat trên quy mô công
nghiệp được thể hiện trên hình 1.3. Trong quy trình này, mầm kết tinh được thêm
vào để tủa tạo thành dưới dạng tinh thể. Sản phẩm là subtilisin dưới dạng muối
halogen. [17],[36],[55]

Hình 1.3: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới dạng muối halogen
1.4. Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis
natto
1.4.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis natto
Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus subtilis var. natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905. [57]
10.52
8
3.11
7.3
39.7
7.87
11.18
1.49
13.7
4.8
0
5
10
15
20
25
30

35
40
45
0 1 2 3 4 5 6
Hi
ệ
u su
ấ
t quy
trình (%)
M
ứ
c tinh s
ạ
ch
của chế phẩm
(lần)
Các nghiên cứu theo
thứ tự bảng 1.4
Giá trị
Siêu lọc, cô đặc Tách tế bào, thu dịch trong Lên men
Dung môi Nước rửa

Mầm kết tinh

Kết tinh
Sản phẩm
Lọc ép
Muối
Chất thải

10

a) Phân loại khoa học
Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ:
Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [29]. Phân loại dưới loài:
Bacillus subtilis natto. [29],[57]
Khi mới được phát hiện ra, Bacillus natto được coi như là một loài vi sinh
vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. nato và B.
subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [61],[65]; các khóa phân loại đã
xếp B. subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng
khác là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [57]. Trong dòng B. subtilis natto
còn có nhiều loại như B. subtilis natto B – 12 [67], B. subtilis natto OK2 [24] …
b) Đặc điểm của B. subtilis natto
B. subtilis natto là trực khuẩn hình que, dị dưỡng, hiếu khí, bắt màu Gram (+),
nội bào tử hình que có kích thước dưới 1µm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay
nối với nhau thành chuỗi (hình 1.4). B. subtilis natto phát triển tối ưu trong khoảng
nhiệt độ từ 37 – 43
0
C, pH trung tính. Sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế bởi nhiệt
độ lớn hơn 55
0
C và pH ≤ 4,5. B. subtilis natto có khả năng sinh bào tử và nhiệt độ
thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 40
0
C. [57]

Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto [75]
1.4.2. Đặc điểm của protease ngoại bào của B. subtilis natto
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
tổng hợp nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzym γ–

transpeptidase theo Noda năm 1989 [50] và Ogawa năm 1991 [70]; amylase theo K.
Yamane năm 1974 [40]; phytase theo M. Shimizu năm 1992 [58]; cellulase theo
Bào tử
Tế bào vi khuẩn
11

Sun Yan năm 2011 [63]; và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease.
[31],[39],[44],[64],[67],[71]
B. subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis. Protease ngoại bào
của loài B. subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn
vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử. Hai protease
chính được sản xuất trong thời gian này là protease serin kiềm (subtilisin) và
protease trung tính. [52],[56]
Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis natto như sau:
 Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay
subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có
275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7kDa đến
29kDa; pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 – 10, nhiệt độ <50
0
C; được
hoạt hóa bởi Zn
2+
; bị bất hoạt bởi điều kiện pH <5, nhiệt độ ≥70
0
C và các ion Fe
3+
,
Al
3+
. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và Asp. Cơ chất đặc hiệu: Suc

– Ala – Ala – Pro – Phe – pNA. [31],[67]
 Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7
[62]. Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa, pI = 8,5; ổn định
hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50
0
C; bị bất hoạt bởi diisopropyl
fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại. [44]
 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba
xúc tác: Ser, His, Asp. [64]
 Protease serin có TLTP 90kDa: có TLPT khoảng 90kDa; pH và nhiệt độ tối
ưu cho hoạt động của enzym là 10 và 55
0
C, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba
xúc tác: Asp33, His81, Ser 259. [39],[71]
1.4.3. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto
Các nghiên cứu về quy trình chiết tách các protease ngoại bào của B. subtilis
natto trên quy mô PTN được nêu ra trong bảng 1.5. Phương pháp chiết tách hay
dùng là kết tủa protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa. Tinh chế bằng cách kết
hợp nhiều phương pháp khác nhau. Nhìn chung hiệu quả và mức tinh sạch enzym
12

sau chiết tách của các quy trình là rất khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu chiết
tách protease ngoại bào của B. subtilis natto đã cho thấy vi khuẩn này có nhiều tiềm
năng ứng dụng sản xuất protease phục vụ cho công nghiệp dược phẩm. [57]
Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto
Trích dẫn Phương pháp chiết tách Phương pháp tinh chế
Tetsuya Kato
(1992)
[39]

Tủa enzym: AS 65% bh Sắc kí trao đổi ion
Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl,
Butyl – toyopearl HW – 50F
Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Fujita M.

(1993)
[31]
Tách lấy E thô: NaCl 0,9%
Kết tủa loại tạp: AS 25%
bh
Tủa enzym: AS 60% bh
Thẩm tích
Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl
Sắc kí trao đổi ion CM – toyopearl
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 50
Sumi H.
(1999) [62]
Tách lấy E thô: NaCl 0,9%
Kết tủa enzym ở pI = 8,7
Sắc kí lọc gel
Điện di SDS – PAGE
Muramatsu
K. (2000)
[44]
Tủa enzym: AS 60% bh Thẩm tích; Sắc kí trao đổi ion
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75
Hiệu quả: 10%. Mức tinh sạch: 46,5
Huang Jun
(2005) [35]

Tủa enzym: AS 60% bh Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75
Sắc kí trao đổi ion
Hiệu quả: 77%. Mức tinh sạch: 6,27
S. Tokudome
(2005) [64]
Tách lấy E thô: nước
Loại tạp: siêu lọc
Làm giàu protein: cô dưới
áp suất giảm.
Sắc kí kị nước Butyl – Toyopearl
Quá trình tinh chế được lặp lại nhiều
lần
Cong Wang
(2009)
[67]
Tủa enzym: AS 30 – 60%
bh
Thẩm tích
Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75
Sắc kí kị nước Phenyl Sepharose Hiệu
quả: 43,2%.
Mức tinh sạch: 56,1
Xiaoyan Zu
(2010)
[73]
Tách lấy E thô: NaCl 0,9%
Kết tủa enzym: Ethanol
95%; AS 20% bh
Siêu lọc qua màng UF-1, UF-5 OPS
Đông khô thu chế phẩm enzym.

Hiệu quả: 0,18%
Guang C.
(2012) [32]
Tủa enzym: AS 30 –70%
bh
Sắc ký lọc gel Sephadex G – 50
Hiệu quả: 42,1%. Mức tinh sạch: 19
13

Ở Việt Nam, quy trình chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto
chưa được tiến hành nghiên cứu nhiều. Những năm gần đây, một số nghiên cứu về
nattokinase và enzym họ subtilisin của B. subtilis đã được thực hiện như:
Năm 2008, Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương đã tách chiết enzym
nattokinase (fibrinase) từ dịch nuôi cấy B. subtilis NT5, enzym có TLPT khoảng
27kDa, pI = 7,04; nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính enzym là 60
0
C và 7,5; các
điều kiện ổn định enzym là Ca
2+
và Mg
2+
với nồng độ 5 – 10 mM, pH = 7 – 7,8.
Enzym đã được áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý thử
nghiệm trên 24 đối tượng và cho kết quả khả quan. [1]
Năm 2008, Nguyễn Thị Thảo và cộng sự đã nhân dòng, phân tích trình tự và
biểu hiện gen mã hóa subtilisin từ các chủng B. subtilis G1 và RD23 trong E. coli
BL21/pESUb. [16]
Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và nhóm nghiên cứu ở Viện Sinh học
nhiệt đới và Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã phân lập, tuyển chọn được hai
chủng Bacillus sp.7.2, Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzym

nattokinase (470 FU/g), chiếm khoảng 70 – 85% so với hoạt tính protease tổng.
[11]
Trong các protease ngoại bào của B. subtilis natto, nattokinase có nhiều tiềm
năng được ứng dụng làm dược phẩm. Bên cạnh các nghiên cứu về quy trình chiết
tách nattokinase; các nghiên cứu invivo, tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm
1995, Maruyama năm 1998, M. Haritha năm 2011 đã chứng minh nattokinase có
tác dụng làm tan cục máu đông và phòng chống huyết khối thông qua các cơ chế:
trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông; hoạt hóa quá trình tổng hợp t – PA
trong huyết tương; thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin; tăng
cường plasmin nội sinh [34],[46],[48]. Năm 2009, kết quả của Kim J. đã chỉ ra
nattokinase có vai trò trong việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [38]. Hiện
nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase
dưới dạng viên nang nhập khẩu từ Nhật Bản và Mỹ như: Nattospes (3.000 FU/g),
Japato (600 FU/g), Nattokinase plus TM (3.000 FU/g), Dosaka (300 FU/g) [11]
14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1.Vi sinh vật sử dụng
Bacillus subtilis natto – Nhật Bản
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất
Tên Nguồn gốc Tên Nguồn gốc
Pepton Ấn Độ Dung dịch xanh methylen Việt Nam
Cao thịt Ấn Độ KI, Iod, CuSO
4
, HCl, NaOH Trung Quốc
NaCl Trung Quốc Dung dịch protein chuẩn 1% Đức
Thạch bột Việt Nam KH

2
PO
4
Trung Quốc

Casein Trung Quốc Na – K tatrat Trung Quốc
Tinh bột Việt Nam Acid tricloacetic Trung Quốc
CMC Trung Quốc Amoni sulfat Trung Quốc
Nattospes
(300FU/viên)
Công ty IMC
(Việt Nam)
Nattokinase 16.000FU/g Trung Quốc
Cách pha chế một số dung dịch hóa chất sử dụng trong đề tài được đưa ra
trong phụ lục 1.
2.1.3. Môi trường
Công thức môi trường thạch thường


Công thức môi trường canh thang

Thành phần

Lượng


Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g


Pepton

1,0g

Thạch bột

2,3g


Cao thịt

0,5g

Cao thịt

0,5g


NaCl

0,5g

NaCl

0,5g

Nướ
c máy vđ
100ml

Nướ
c máy vđ
100ml

2.1.4. Máy móc và dụng cụ
Danh sách thiết bị sử dụng được đưa ra trong bảng 2.2

15

Bảng 2.2: Thiết bị được sử dụng
Tên Nguồn gốc (Hãng) Tên Nguồn gốc (Hãng)

Tủ cấy vô trùng Italia (UV Bioair) Máy lắc Đức (Bioshaker)
Tủ ấm, tủ sấy Đức (Memmert) Cân phân tích Đức (Satorius)
Nồi hấp tiệt trùng

Nhật (ALP) Cân kỹ thuật Đức (Satorius)
Lò vi sóng Hàn Quốc (Daewoo) Máy đo pH Đức (Presica)
Tủ lạnh Nhật (Toshiba) Máy UV - VIS Nhật (Hitachi)
Máy li tâm Đức (Universal) Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd)
Máy li tâm Đức (Rotofix) Máy đông khô Đức (Alpha Christ)

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri
nhựa (đường kính 8,8cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết
protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto
 Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto
 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B.
subtilis natto
 Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis
natto
2.2.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được
 Tinh chế protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75
 Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế
 Sơ bộ thử khả năng phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto
a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường thạch thường (theo phần 2.1.3), đun cho đồng nhất. Chia đều
môi trường vào trong các ống nghiệm (5 – 6ml/ống), nút kín. Hấp tiệt khuẩn ở điều
kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để
nguội cho thạch đông lại. Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi
16

trường mới theo hình ziczac. Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ủ ở 37
0
C/24 giờ.
Bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở 4 – 5
0
C. Việc cấy truyền được thực hiện
1 – 2 tháng/lần. [4],[10]
b) Phương pháp nhân giống trong bình nón
Pha 20ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 50ml,

nút kín. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để
môi trường nguội xuống dưới 40
0
C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống
giống vào môi trường. Nuôi trên máy lắc ở 37
0
C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút.
[4],[10]
c) Phương pháp lên men
Pha 100ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 250ml,
nút kín. Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để
môi trường nguội xuống dưới 40
0
C, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi
trường mới với tỷ lệ cấy truyền là 10%. Nuôi trên máy lắc ở 37
0
C/24 giờ, tốc độ lắc
100 vòng/phút. [4],[10]
2.3.2. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym
a) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính protease
Nguyên tắc: Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein
của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch. [4]
Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có
mỏ 200ml, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16ml
dung dịch trên vào các đĩa petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường
kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 37
0
C/24 giờ và
đọc kết quả. [15]
b)Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính amylase

Nguyên tắc: amylase có khả năng phân giải tinh bột thành các oligosaccharid
và đường đơn không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I
2
). Dùng tinh bột làm cơ
chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính amylase có trong dịch chiết enzym.
[4]
17

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% tinh bột và 2% thạch trong cốc có
mỏ 200ml, khuấy đều và đun cho đồng nhất. Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa
petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch
thử vào giếng thạch. Ủ trong tủ ấm 37
0
C/24 giờ. Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch
để quan sát vòng phân giải tinh bột. [4]
c) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính cellulase
Nguyên tắc: Cellulase có khả năng phân giải CMC thành các oligosaccharid
không bắt màu với thuốc thử Lugol (KI + I
2
). Dùng CMC làm cơ chất xác định sự
tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính cellulase có trong dịch chiết enzym. [4],[10]
Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 0,5% CMC và 2% thạch trong cốc có
mỏ 200ml (chú ý ngâm cho CMC trương nở hoàn toàn), đun cho đồng nhất. Đổ
16ml dung dịch trên vào các đĩa petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có
đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 37
0
C/24
giờ. Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải CMC. [4]
2.3.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease
Xác định pH của dịch nghiên cứu. Sau đó phân phối dịch vào các cốc có mỏ

(10ml/1 cốc). Điều chỉnh pH đến giá trị pH nghiên cứu bằng cách thêm từng giọt
dung dịch NaOH 0,1M hoặc HCl 0,1M (có kết hợp khuấy từ). Để ổn định 1 giờ ở
nhiệt độ phòng. Tiến hành thử khả năng phân giải casein của dịch nghiên cứu trước
và sau khi đã điều chỉnh pH theo mục a phần 2.3.2. [67]
2.3.4. Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease
a) Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat
Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein enzym; tính tan của
protein enzym tăng nhẹ (salting in) ở nồng độ muối thấp và giảm mạnh (salting out)
ở nồng độ muối cao. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá
trình solvat hóa, giảm tính hòa tan của protein enzym dẫn đến sự tủa. [5],[26]
Tiến hành:
 Khảo sát nồng độ amoni sulfat sử dụng để kết tủa enzym