Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh protein g ứng dụng trong tách chiết igg làm nguyên liệu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học bệnh cho vật nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI




BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP VIỆN NĂM 2014





PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ
NĂNG SINH PROTEIN G ỨNG DỤNG TRONG TÁCH CHIẾT IgG
LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ TẠO SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HỌC BỆNH CHO VẬT NUÔI

MÃ SỐ: V2014 - 17






Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ Sinh học
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Thu Hiền

Hà Nội - 2014


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

STT Họ và tên Chức vụ Đơn vị công tác
1 ThS. Nguyễn Thị Thu Hiền Giảng viên Khoa CNSH – Viện ĐH Mở HN
2 TS. Phạm Thị Tâm Giảng viên Khoa CNSH – Viện ĐH Mở HN
3 TS. Bùi Thị Hải Hòa Giảng viên Khoa CNSH – Viện ĐH Mở HN

Đơn vị phối hợp chính: Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà
Nội

MỤC LỤC


PHẦN I. MỞ ĐẦU 1

I. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. 1
II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2
III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3
IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1. Đại cương về protein G 3
1.1. Cấu trúc của Protein G 4
1.1.1. Cấu trúc của tiểu đơn vị α. 5
1.1.2. Cấu trúc của tiểu đơn vị βγ. 5
1.2. Cơ chế gắn kết IgG của Protein G 6
1.3. Ứng dụng của Protein G 7
1.4. Tình hình nghiên cứu protein G trong nước và quốc tế. 9
2. Vi khuẩn Streptococcus sp 10
2.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp 11
2.1.1. Đặc điểm hình thái 11
2.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa. 11
2.2. Đặc điểm sinh trưởng và khả năng sinh độc tố của Streptococcus sp 13
2.2.1. Đặc điểm sinh trưởng 13
2.2.2. Cấu trúc kháng nguyên 15
2.2.3. Các enzym và độc tố. 16
2.3. Tình hình nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protein G từ Streptococcus sp 18
V. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
1. Đối tượng nghiên cứu 19
2. Vật liệu nghiên cứu 20
2.1 Hóa chất và thiết bị 20
2.1.1 Thiết bị 20
2.1.2. Hoá chất trong thí nghiệm 21
2.2 Môi trường nuôi vi sinh vật 21
2.2.1. Môi trường phân lập 21
2.2.2. Môi trường lên men 21
3. Phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Phương pháp vi sinh 22
3.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptococcus sp 22
3.1.2 Các phương pháp sinh hóa. 23
3.2. Phương pháp hóa sinh 25
3.2.1 Quy trình tách chiết, tinh sạch protein G từ vi khuẩn Streptococcus sp 25
3.2.2. Phương pháp thu nhận protein G thô từ Streptococus sp 26
3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Bradforfd 26
3.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50 27
3.2.5. Phương pháp SDS-PAGE 28
3.3. Phương pháp Elisa gián tiếp kiểm tra khả năng gắn kết kháng thể
động vật của Protein G 31
PHẦN II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32
1. Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus sp 32
1.1. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn có hình cầu, gram dương 32
1.2. Đặc điểm hình thái tế bào và đặc tính sinh lí, sinh hoá của các chủng
vi khuẩn Streptococcus sp phân lập được 34
2. Kết quả tách chiết và làm sạch protein G từ 7 chủng Streptococcus sp 38
2.1. So sánh hiệu quả kết tủa Protein G bằng aceton và (NH
4
)
2
SO
4
bão
hoà 60% 39
2.2. Kết quả làm sạch Protein thu nhận từ chủng Streptococcus sp S
8.1.1
bằng sắc kí lọc gel 42

3. Kết quả kiểm tra khả năng gắn kết với kháng thể động vật của
protein G 43
4. Tinh sạch và thu nhận IgG 45
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
1. Kết luận 48
2. Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


BHIA : Brain Heart Infusin Agar
BSA : Bovine Serum Albumin
CAMP : Christie, Atkins, Munchpeterson
cAMP : Cyclic Adenosine Monophosphate
DAG : diacyglycerol
DNA : Deoxylribonucleic aicd
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
GTP : Guanosine triphosphate
IgG : Immunoglobulin G
IP3 : Inositol trisphotphate
KIA : Kligler Iron Agar
KLPT : Khối lượng phân tử
LB : Luria-Bertani
MR :Methyl Red
OD : Độ đục
PBS : Phosphate Buffer Saline
PLC : Phospholipase C
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophores

TSA : Tryticase Soy Agar
V.P : Voges-Proskauer






DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh khả năng gắn kết kháng thể đơn dòng và đa dòng ở động vật có vú
của protein G và protein A sử dụng phản ứng ELISA 8
Bảng 1.2 Hiệu suất thu hồi IgG tinh sạch sử dụng protein G Sepharose Fast
Flow 10
Bảng 1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp 12
Bảng 2.1: Kết quả phân lập 24 chủng vi khuẩn hình cầu, Gram dương 32
Bảng 2.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên 24 chủng vi khuẩn đã sàng lọc 36
Bảng 2.3: Kết quả dựng đường chuẩn BSA 40
Bảng 2.4: Kết quả thu hồi Protein G theo hai phương pháp kết tủa bằng
aceton và (NH
4
)
2
SO
4
bão hoà 60% 41
Bảng 2.5. Giá trị OD với các nồng độ khác nhau của kháng thể đa dòng (Pab)
phủ
giếng
47

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ


Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn Streptococcus sp 22
Sơ đồ 2: Quy trình tách chiết và tinh sạch protein G từ vi khuẩn Streptococcus sp 25

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của Protein G 4
Hình 1.2 Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp 11
Hình 1.3 Tan máu alpha trên MT thạch máu 5% của S. pneumoniae 14
Hình 2.1: Đặc điểm hình thái và sinh hóa của một số chủng Streptococcus sp đã sàng
lọc 37
Hình 2.2: Dịch vi khuẩn sau 72 giờ lên men và ly tâm thu tế bào 38
Hình 2.3: Kết quả phản ứng giữa protein G với dung dịch Bradford 39
Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn BSA 40
Hình 2.5: Hình ảnh điện di protein ở các bước tinh sạch của chủng S
8.1.1
42
Hình 2.6: Kết quả phản ứng lai Western blot 43
Hình 2.7: Kết quả ELISA đánh giá khả năng gắn kết với IgG của một số loài động
vật 44



1
PHẦN I. MỞ ĐẦU

I. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI.

IgG (Immunoglobulin G) là lớp kháng thể chính trong máu và dịch ngoại
bào, có chức năng kiểm soát và bảo vệ cơ thể với hiện tượng nhiễm trùng.
IgG có thể tạo liên kết với tác nhân gây bệnh như: virus, vi khuẩn, nấm thông
qua các phương thức: i) ngưng kết và opsonin hóa từ đó thu hút tế bào thực
bào, kích thích quá trình thực bào; ii) hoạt hóa hệ thống bổ thể theo con
đường cổ điển tạo dòng thác bổ thể để loại bỏ tác nhân gây bệnh; iii) trung
hòa độc tố; iv) gây độc trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC) và
phân giải protein nội bào qua kháng thể trung gian. Lớp kháng thể này bắt đầu
xuất hiện 24-48 giờ sau kích thích kháng nguyên, có khả năng nhận biết đặc
hiệu kháng nguyên kích thícTrong chẩn đoán bệnh ở người, động vật, thậm
chí trên cả thực vật, IgG được xác định là công cụ phát hiện tác nhân gây
bệnh với độ đặc hiệu cao, đưa ra kết quả chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện
trên số lượng mẫu lớn vì vậy lớp kháng thể này thường được sử dụng trong
hầu hết các chẩn đoán sàng lọc trong giám sát dịch bệnh. Trong các sinh
phẩm chẩn đoán miễn dịch học như ELISA, IFAT, Western blot, hóa mô
miễn dịch, ngưng kết, miễn dịch so màu… IgG được sử dụng là yếu tố chuẩn
để phát hiện kháng nguyên (tác nhân gây bệnh) hoặc là kháng thể cộng hợp để
phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Hiện tại, trên thế giới có hàng
ngàn loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học, trong thành phần tất cả các
sinh phẩm này đều sử dụng IgG. Ở Việt Nam, IgG được sử dụng trong các hệ
thống chẩn đoán miễn dịch học đã được thiết lập để xác định bệnh trên người
như HIV, viên gan B, ung thư, Trên động vật, IgG được sử dụng trong phản
ứng ELISA giám sát huyết thanh học các bệnh: cúm gia cầm, tai xanh ở lợn,
thậm chí xác định type virus gây lở mồm long móng trên trâu bò,… Trên thực
vật, IgG được sử dụng để phát hiện bệnh làng lùn, lùn xoắn lá ở lúa, bệnh
Greening ở cây có múi, bệnh ở khoa tây xoăn lá, nhăn lá, khảm lá ở cây khoai
2
tây do Potato Leaf Roll Virus (PLRV) và Potato Virus X, Y (PVX,
PVY)…Tuy nhiên, hầu như các hệ thống chẩn đoán miễn dịch học được thiết
lập trong nước chưa được thương mại hóa với lý do chính là chưa có hệ thống

tinh sạch IgG có hiệu quả dẫn tới giá thành không hợp lý.
IgG có thể được tách chiết bằng các phương pháp như: kết tủa bằng
muối amon sulfate, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực với protein A/G. Trong
đó, phương pháp ái lực với protein A hoặc G là phương pháp có hiệu quả tách
chiết và tinh sạch cao hơn các phương pháp còn lại.
Protein A là thành phần cấu tạo màng tế bào của một số chủng vi khuẩn
Staphylococcus aureu, có trọng lượng 42,000 Da, có khả năng liên kết đặc
hiệu với mảnh Fc của IgG. Mặc dù protein này không liên kết với IgG của
chuột lang, IgG3 của người, IgG1 của chuột nhắt trắng tuy nhiên nó lại có ái
lực mạnh với IgG của thỏ vì vậy thường được sử dụng để tách kháng thể
trong huyết thanh của loài này.
Protein G là yếu tố cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Streptococci chủng
G, có khả năng liên kết với IgG tại các mảnh Fc và Fab. Protein G tự nhiên có
hai vùng liên kết với các Ig và các vùng liên kết với albumin cũng như bề mặt
tế bào.
Việc phát hiện được một chủng vi khuẩn Streptococcus sp có khả
năng sản sinh protein G là cơ sở để thu nhận và sản xuất protein G làm
nguyên liệu tách chiết IgG sử dụng trong công tác điều trị và chẩn đoán bệnh
trên người và động vật. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập
và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh protein G ứng dụng
trong tách chiết IgG làm nguyên liệu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán miễn
dịch học bệnh cho vật nuôi”.
II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn Streptococcus sp có
khả năng sinh tổng hợp protein G
3
- Xác định đặc tính sinh lí, sinh hóa chủng vi khuẩn Streptococcus sp
phân lập được.
- Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch protein G Streptococcus sp
- Xác định khả năng gắn kết của protein G Streptococcus sp với

kháng thể IgG của một số động vật.
- Nghiên cứu ứng dụng IgG trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn con.
III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên phải tiến hành một số chuyên đề
cụ thể sau:
Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn được vi sinh vật có khả năng sinh
protein G
Nội dung 2: Tinh sạch và tách chiết được protein G
Nội dung3:. Đánh giá độ gắn kết của protein G với IgG của một số
động vật nuôi (thỏ, gà).
Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng IgG trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy
ở lợn con.
IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Đại cương về protein G
Protein G là yếu tố cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Streptococci
chủng G, có khả năng gắn kết với IgG tại các mảnh Fc và Fab. Protein G tự
nhiên có hai vùng gắn kết với các Ig và các vùng gắn kết với albumin cũng
như bề mặt tế bào. Protein G được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin
Rodbell năm 1971 về sự kích hoạt cAMP bởi glucagon. Nhờ thí nghiệm này
Martin Rodbell đã phát hiện ra sự hiện diện của GTP là rất quan trọng trong
phản ứng này. Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide.
Với bản chất là một dị phân tử nằm trong màng tế bào chất, protein G
gắn kết với các nucleotit Guanine là GDP và GTP. Được cấu tạo từ ba loại
tiểu đơn vị khác nhau, protein G có dạng heterotrime gắn kết với bề mặt bên
4
trong của màng plasma và các thụ thể nhận biết xuyên màng của các
hormone, được gọi là các thụ thể gắn kết với protein G.
1.1. Cấu trúc của Protein G
Protein G được gồm 3 thành phần: tiểu đơn vị α có KLPT ~39–45
kDa, tiểu đơn vị β có KLPT ~37 kDa và tiểu đơn vị γ có KLPT ~8 kDa

[4][12]. Có khoảng 20 gen mã hóa nhiều loại tiểu đơn vị α, 6 gen đối với tiểu
đơn vị β và 12 gen cho tiểu đơn vị γ. Ở trạng thái trimer hóa, Protein G bám
vào mặt trong của màng tế bào thông qua đuôi kị nước của tiểu đơn vị
α và γ (myristoyl và palmitoyl trên α, farnesyl hoặc geranylgeranyl trên γ).
Tiểu đơn vị β và γ được nối lại với nhau bởi gắn kết giữ lõi với lõi để tạo
nên βγ-dimer; tiểu đơn vị β của βγ-dimer này sẽ bám vào tiểu đơn vị α bằng
theo kiểu bổ sung ở vùng gắn kết peptide trên 2 protein và sự tương tác với
đuôi kị nước. Khi Protein G được kích hoạt, gắn kết giữa tiểu đơn vị α và β bị
đứt, trimer bị phân ly thành tiều đơn vị monomeric α và tiểu đơn vị dimeri
βγ. Tiểu đơn vị α và βγ đều bám vào màng tế bào nhưng cũng dễ dàng tách
khỏi màng khi cần.


Hình 1.1 Cấu trúc không gian của Protein G
5
1.1.1. Cấu trúc của tiểu đơn vị α.
Tiểu đơn vị α là các protein có trọng lượng phân tử từ 39-52 kDa và có ít
nhất 20 loại tiểu đơn vị α khác nhau. Căn cứ vào các trình tự các acid amin
tương đồng mà người ta chia Gα thành 4 loại chính:
- G
αs
kích thích adenylate cyclase. Nó được gắn kết vào các thụ thể đối
với nhiều loại hormon như: adrenaline, glucagon, các hormon tạo thể vàng
(LH), các tuyến cận giáp (PTH), các hormon kích vỏ trên thận (ACTH)
- G
αq
hoạt hóa phospholipase C (PLC) - chất tạo ra chất truyền tín hiệu
thứ hai là inositol trisphophate (IP3) và diacyglycerol (DAG). Bao gồm G
αq
,

G
α11
, G
α16
.
- G
αi
là protein ức chế adenylate cyclase, qua đó làm giảm nồng độ
cAMP trong tế bào. G
αi
bị hoạt hóa bởi thụ thể của somatostatin. Bao gồm
G
αi-1,
G
αi-2
, G
αi-3
và G
α0
(chiếm ưu thế là các tiểu đơn vị α thần kinh); G
αt
, G
αt2
(các tiểu đơn vị α võng mạc) và G
αz
. Tất cả các thành viên của nhóm này,
ngoại trừ αz có thể bị biến đổi bởi chất độc pertussis.
- Loại thứ tư đó là G
α12
, G

α13
nhưng chưa biết rõ chức năng [1]
1.1.2. Cấu trúc của tiểu đơn vị βγ.
Dựa vào trình tự acid amin của β có thể khẳng định rằng nó có hai kiểu
cấu trúc khác nhau. Cụ thể là: 39 acid amin ở vùng đầu N cấu thành nên xoắn
α lưỡng cực có liên quan đến sự tương tác cuộn xoắn nhằm giữ cho βγ gắn
vào α. Xoắn α ở vùng đầu N của tiểu đơn vị α là cần thiết cho sự hình thành
dạng heterotrimer vì sự đột biến của arginine số 9 trong chuỗi xoắn giả α
thành proline không ảnh hưởng đến sự hình thành này. Phần protein β còn lại
tạo thành đoạn lặp với mỗi đoạn xấp xỉ 43 acid amin. Các đoạn lặp giống
nhau được tìm thấy trong nhiều protein không có chức năng thực hiện quá
trình tải nạp tín hiệu khác.
Sự tồn tại của 4 tiểu đơn vị β khác nhau và có ít nhất 7 tiểu đơn vị γ đã
cho thấy có ít nhất 28 tổ hợp khác nhau của tiểu đơn vị βγ. Thực tế cho thấy
6
không phải tất cả các cặp βγ có khả năng đều được hình thành. Tiến hành
phân tích các tố hợp bằng phương pháp dịch mã trong điều kiện phòng thí
nghiệm và bằng biểu hiện không bền trong các tế bào COS cho thấy: β1 có
khả năng tương tác với γ1, γ2 nhưng chỉ có thể hình thành nên cấu trúc dimer
với riêng γ2 (giống với β2)
Trong tiều đơn vị βγ không có các gắn kết cầu disulfide S-S, sự ổn định
của βγ được phản ánh trong mối tương tác không đồng hóa trị giữa các đoạn
cấu trúc lặp lại của tiểu đơn vị β. Mặc dù chúng không hình thành trọn vẹn
các vùng hoạt động chức năng riêng biệt nhưng 2 đoạn bị phân chia bởi
Trypsin rất thuận lợi cho sự tương tác với α và γ. Phân đoạn có khối lượng 14
kDa ở vùng đầu N có thể gắn kết chéo với γ nhờ bismaleimidebexane hay
phenanthroline đồng. Trong khi, phân đoạn có khối lượng 26kDa ở vùng đầu
C lại có thể gắn kết chéo với α nhờ bismaleimidehexane. Tuy nhiên vị trí
chính xác trên β có thể gắn kết chéo với α vẫn chưa được xác định [1]
1.2. Cơ chế gắn kết IgG của Protein G

Cấu trúc của protein G Streptococcal gồm có 83 chuỗi axit amin và
được chia thành 2 vùng chính là B1 và B2. Vùng B1 bao gồm 56 chuỗi, vùng
B2 gồm 13 chuỗi, kèm theo là 14 chuỗi axit amin còn lại. Các axit amin thuộc
vùng B1 và B2 lặp lại tại 6 vị trí: Ile6 – Val, Leu7 – Ile, Glu19 – Lys, Ala24 –
Glu, Val29 – Ala và Glu42 – Val. Cấu trúc không gian của vùng B1 bao gồm
4 cấu trúc gấp nếp β và 1 cấu trúc xoắn α, trong khi cấu trúc không gian vùng
B2 bao gồm chủ yếu là cấu trúc gấp nếp β. Nhờ có cấu trúc 2 chuỗi B1 và B2,
người ta đã tìm hiểu được cơ chế gắn của IgG với protein G. Nhằm mục đích
tìm hiểu cặp axit amin nào là yếu tố quan trọng trong gắn kết với IgG, người
ta đã tiến hành so sánh vị trí của 6 cặp axit amin giữa 2 vùng B1, B2 và tìm ra
axit amin không tham gia đến quá trình gắn là Leu7. Quá trình gắn của
protein G với mảnh Fc của IgG có sử dụng mảnh peptid tách ra từ vùng gắn
kết với IgG của protein G, kết hợp với 11 cặp axit amin bao quanh tạo thành
7
cấu trúc xoắn α. Một trong những axit amin không có tính bảo thủ giữa vùng
B1 và B2 là Glu42 – Val có thể là nguyên nhân sự thay đổi ái lực gắn IgG
giữa hai vùng B1, B2. Những nghiên cứu này cho thấy, protein G gắn kết với
mảnh Fab của IgG yếu hơn so với mảnh Fc.
1.3. Ứng dụng của Protein G
Protein G được hai nhà khoa học Alfred G. Gilman và Martin Rodbell
tìm ra và giải thích vai trò của chúng trong quá trình truyền tin bên trong tế
bào và nhờ đó được trao giải Nobel Y học 1994. Qua các nghiên cứu và phát
hiện, protein G được xem là chất trung gian rất quan trọng giúp truyền dẫn
các tín hiệu hóa học.
Ngoài ra, việc cố định protein G từ các chủng vi khuẩn đã được sử
dụng trong nhiều năm để làm sạch kháng thể từ một loạt các loài (Hjelm et
al., 1972).Dựa vào tính chọn lọc cao và ổn định, protein G đã được dùng phổ
biến để tinh chế kháng thể từ một loạt các nguồn mẫu, bao gồm huyết thanh,
dịch nổi tế bào,… Kháng thể động vật có vú được phân thành các loại chính:
IgA, IgD, IgE, IgG và IgM. IgG là lớp chủ yếu của kháng thể trong huyết

thanh và được tạo ra với số lượng lớn trong các phản ứng miễn dịch thứ cấp.
Các lớp kháng thể IgG được chia thành các lớp con mà thay đổi tùy thuộc
theo loài và các thuộc tính của các thành phần chuỗi nặng. Có bốn lớp con của
IgG ở người( IgG
1
, IgG
2
, IgG
3
và IgG
4
). Các mối quan hệ của protein A cho
IgG thay đổi đáng kể giữa các loài và IgG phân nhóm và đã được đặc trưng
rộng rãi( Duhamel et al., 1979, Schwartz 1990). Ở người, protein A có ái lực
cao với IgG
1
, IgG
2
và IgG
4
, nhưng kém với IgG
3
. Trong số bốn phân nhóm
IgG ở chuột, Protein A có ái lực yếu nhất cho IgG
1
trong khi protein G có ái
lực với tất cả bốn lớp IgG. Vì vậy, ngoài chức năng là một chất trung gian dẫn
truyền tín hiệu, protein G còn được biết đến với khả năng tinh sạch kháng thể.
Protein G có khả năng gắn với vùng Fc của IgG ở nhiều loài động vật
có vú và cả vùng Fab của IgG, do vậy sử dụng protein G tinh sạch IgG có

8
đem lại hiệu quả tốt hơn so với dùng protein A tinh sạch IgG Mặc dù đều
được sử dụng làm vật liệu tinh sạch IgG nhưng protein G và protein A khác
nhau ở vị trí gắn kết với IgG, nguyên do bởi khả năng gắn kết đặc hiệu của
bản thân từng loại IgG. Protein G không chỉ có khả năng gắn kết mạnh với
kháng thể đa dòng IgG, ví dụ kháng thể của bò sữa, cừu và ngựa…mà còn
gắn kết được với kháng thể đa dòng IgG của chuột, IgG
3
của người…
Bảng 1.1 So sánh khả năng gắn kết kháng thể đơn dòng và đa dòng
ở động vật có vú của protein G và protein A sử dụng phản ứng ELISA



9
1.4. Tình hình nghiên cứu protein G trong nước và quốc tế.
Các nghiên cứu về protein G trong nước còn rất ít, trong khi đó trên thế
giới, các nghiên cứu về khả năng gắn kết với IgG của protein G khá là phổ
biến. Theo Langone, 1982, các protein gắn kết liên tục với vùng Fc của IgG
thì nằm trên bề mặt của các chủng Staphylococci và Streptococci. Protein A
từ chủng Staphylococcus aureus được biết đến với khả năng gắn kết IgG đã
được khai thác trong nhiều phương pháp hóa miễn dịch (Goding, 1978;
Langone, 1982). Protein G là phân tử protein của nhóm G và C Streptococcus
và được gắn kết với IgG của phần lớn các loài khác (Akerstrom et al., 1985;
Guss et al., 1986; Reis et al., 1986). Ngược lại với protein A từ
Staphylococcus aureus, thì protein G từ chủng G148 Strep có khả năng gắn
kết được với bốn lớp con của IgG người, trong khi protein A không có khả
năng găn kết với IgG
3
(Guss et al., 1986). Tuy nhiên, protein A có ái lực với

IgG đa giá của người cao hơn protein G (Guss et al., 1986; Eliasson et al.,
1988). Protein G đã được chứng minh là tương tác với vùng Fab của IgG,
nhưng nó lại được xác định là có ái lực tương tác thấp hơn 10 lần so với vùng
Fc (Bjorck và Kronvall, 1984) và đã được báo cáo là gắn kết với mảnh F(ab’)
của IgG (Erntell et al., 1988). Trên phân tử protein G còn có những vùng gắn
kết độc lập và riêng biệt cho các mảnh Fab và Fc của IgG, ngoài ra nó còn có
những cấu trúc dài, cho phép gắn đồng thời cả hai mảnh Fab và Fc (Erntell et
al., 1988).
Hiện tại trên thế giới, người ta đã sử dụng protein G Streptococcal tái
tổ hợp để sản xuất kit tinh sạch IgG như gắn protein G vào gel Sepharose 4
fast flow và sử dụng Sepharose 4 fast flow để phân lập và tinh sạch IgG.
Protein G tái tổ hợp của E.Coli có điểm đẳng điện pI 4,1 và dải pH hoạt động
từ 2 – 10, cấu trúc bao gồm 2 vùng gắn kết IgG, vùng gắn kết albumin của
protein G đã được loại bỏ nhằm tránh phản ứng gắn kết chéo với albumin.
10
Phần lớn IgG của các loài động vật đểu gắn kết với protein G
Sepharose 4 Fast Flow ở pH trung tính và có tính ion hoá mạnh. Khả năng
gắn kết của protein G Sepharose 4 Fast Flow phụ thuộc đặc tính của globulin
miễn dịch của từng loài. Tuy nhiên hiệu suất thu hồi phụ thuộc vào một số
yếu tố, ví dụ tốc độ dòng chảy của mẫu, nồng độ mẫu và dung dịch đệm.
Bảng 1.2 Hiệu suất thu hồi IgG tinh sạch sử dụng protein G Sepharose Fast Flow

2. Vi khuẩn Streptococcus sp
Giới: Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Streptococcaceae
Chi :Streptococcus
Streptococcus sp được phân loại theo kiểu tan máu đó là α-hemolytic, β-

hemolytic và γ-hemolytic. Dựa vào các kiểu tan máu này, người ta chia
Streptococcus sp ra thành nhiều nhóm, như:
- α-hemolytic: gồm có phế cầu và nhóm viridans;
- β-hemolytic: gồm có các nhóm A, B, C, G, F, H và D
11
Cho đến nay, nhiều liên cầu khuẩn thuộc D đã được phân loại và đặt
trong chi Enterococcus.
2.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp
2.1.1. Đặc điểm hình thái
Streptococcus sp là chi vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc hình trứng, có
kích thước đường kính nhỏ hơn 2µm. Chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi
hạt, với độ dài ngắn không đều nhau (từ 2-10 vi khuẩn hoặc có thể dài hơn),
cũng có khi chúng đứng riêng lẻ hoặc thành từng cặp. Streptococcus sp bắt
màu gram dương (+), chúng không có khả năng sinh bào tử, không có khả
năng di động , một số dòng có khả năng tạo vỏ nhày [20]

Hình 1.2 Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp
(A)- Ảnh Streptococcus sp bắt màu Gram dương
(B)- Ảnh chuỗi các vi khuẩn Streptococcus sp
2.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa.
Vi khuẩn Streptococcus sp là một loại vi khuẩn dễ bị tiêu diệt bởi nhiều
chất sát trùng như: phenol, iod, hypochloride, axit phenic 3-5% diệt vi khuẩn
trong vòng 3-15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút. Vi khuẩn
còn bị diệt bởi cồn 70% trong vòng 30 phút.
Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu rất quan trọng để phân lập một loài vi
khuẩn cụ thể. Đặc điểm sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp chất,
A

B
12

khả năng tiết enzyme để thủy phân các chất có trong môi trường của vi khuẩn.
Streptococcus sp khi được nuôi trong môi trường tổng hợp hoặc bán tổng
hợp sẽ sử dụng các hợp chất có sẵn để phục vụ cho nhu cầu sinh trưởng và
phát triển. Người ta đã xác định được một số đặc tính sinh hóa của
Streptococcus sp như có phản ứng catalase, oxydase, indol và H
2
S âm tính (-
).Streptococcus sp còn có khả năng lên men đường glucose, ribose, trehalose,
maltose, saccharose… và không lên men đường galactose, ngoài ra trên môi
trường thạch máu 5%, Streptococcus sp gây dung huyết cả ba kiểu tùy từng
loài cụ thể. Streptococcus sp không thủy phân tinh bột, không bị ly giải bởi
muối mật, tức thử nghiệm optochin âm tính
Bảng 1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp
Các phản ứng sinh hóa Streptococcus sp
Catalase (-)
Oxydase (-)
Indol (-)
H
2
S (-)
Lactose (-)
Glucose (+)
M.R (+)
V.P (-)
Kiểu tan huyết α / β / γ

Để phân biệt được các loại liên cầu khuẩn khác nhau, người ta phải dựa
trên một số tính chất sinh hóa. Theo TS.BS.Trần Quang Cảnh (Khoa xét
nghiệm-HMTU) thì có một số thử nghiệm để phân biệt các loại liên cầu như
CAMP test, thử nghiệm Bile Esculin, canh thang chứa muối NaCl 6,5%. Liên

13
cầu nhóm B được xác định bởi thử nghiệm CAMP (viết tắt của Christie,
Atkins và Munch-peterson). Liên cầu nhóm B sản xuất một chuỗi peptide hay
chất CAMP có hoạt động phối hợp với hemolysin gây tan máu β được sinh ra
bởi một số chủng Staphylococcus aureus, tạo ra hiệu quả tan máu tăng lên rõ
rệt. Sau khi nuôi cấy và ủ, kết quả tác dụng là vùng tan máu có dạng β, tức là
hình thành vòng tan máu có màu trong suốt xung quanh khuẩn lạc.Những liên
cầu không phải nhóm B không có phản ứng này.
Trong thử nghiệm Bile Esculin, với sự xuất hiện của muối mật, liên cầu
nhóm D thủy phân glycoside esculin hành 6,7-dihydroxycoumarin, chất này
sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường để tạo ra màu nâu cho đến màu
đen sau khi nuôi cấy và ủ. Nếu không xuất hiện màu tối này trên môi trường,
thì đó không phải là liên cầu khuẩn nhóm D. Một thử nghiệm khác nữa để có
thể phân biệt liên cầu nhóm D, đó là chúng có khả năng tồn tại và phát triển
trên môi trường canh thang 6,5% NaCl, trong khi đó, các cầu khuẩn không
thuộc họ đường ruột khác không có khả năng này [23]
2.2. Đặc điểm sinh trưởng và khả năng sinh độc tố của Streptococcus sp
2.2.1. Đặc điểm sinh trưởng
Streptococcus sp thuộc nhóm liên cầu hiếu khí, kị khí tùy tiện và
thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết
thanh, đường… Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-
10% CO
2
. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 30-37
o
C, một số phát triển ở 10-
40
o
C như liên cầu đường ruột, không phát triển ở 45
o

C, pH của nước vôi
(pH=12) có thể ức chế và tiêu diệt vi khuẩn trong 15-30 phút [23]
Trong môi trường lỏng (canh thang), liên cầu dễ tạo thành những chuỗi
dài không bị gẫy, sau đó tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông
rồi lắng xuống đáy môi trường nuôi cấy. Do đó, sau 24 giờ nuôi cấy, môi
trường trở nên trong và có lắng cặn.
14
Trong môi trường đặc, liên cầu có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, khô, màu
hơi xám trong, những chủng có vỏ khuẩn lạc lầy nhầy.
Trên môi trường thạch máu, liên cầu phát triển tốt, có thể làm tan máu
dưới ba hình thức α, β và γ tùy thuộc từng nhóm liên cầu ( Ray, C.George và
cộng sự, 2004)
+ Tan máu (α): Đây là tan máu không hoàn toàn, vòng tan máu có xuất
hiện màu xanh. Liên cầu tan máu α, loài Streptococcus viridans thường là loại
không gây bệnh. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, chúng có khả năng gây
các bệnh nhiễm trùng ở người, như viêm nội tâm mạc bán cấp (subacute
endocarditis) có thể dẫn đến tổn thương van tim và suy tim nếu không điều
trị. Streptococcus pneumoniae là căn nguyên viêm phổi thùy (lobar
pneumonia).

Hình 1.3 Tan máu alpha trên MT thạch máu 5% của S. pneumoniae
+ Tan máu (β): Đây là tan máu hoàn toàn, vòng tan máu trong suốt và
có đường kính gấp 2-4 lần đường kính khuẩn lạc. Những Streptococcus sp có
khả năng gây tan máu β phần lớn có khả năng gây bệnh. Tan máu β chủ yếu ở
liên cầu nhóm A, ngoài ra có thể gặp ở nhóm B, C, D.
+ Tan máu (γ): Đây là kiểu tan máu không có vòng tan huyết xung
quanh khuẩn lạc. Hầu hết các Streptococcus sp gây tan máu γ không mang
tính độc lực. Tan máu kiểu này đối với liên cầu nhóm D.
15
Theo Trịnh Phú Ngọc và cs, Tạp chí thú y, 1999, thì khi kiểm tra tính

chất mọc của Streptococcus sp trên môi trường, thì cho kết quả sau:
+ Môi trường thạch thường: Khuẩn lạc mọc yếu, khuẩn lạc màu trắng,
trong, tròn gọn.
+ Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi tím, lồi, tròn,
gọn, mịn, dung huyết.
+ Thạch Edward: Khuẩn lạc nhỏ mịn, ướt, tròn, gọn, trong, mặt hơi lồi,
màu hơi tím.
+ Thạch Shapman: Không mọc, màu đỏ tươi.
+ Nước thịt 5% huyết thanh: Khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi đục.
Vi khuẩn Streptococcus sp, khi nuôi trên môi trường BHIA ( Brain
Heart Infusin Agar) ở 28-30
o
C, sau 24 giờ, thì đa số các khuẩn lạc mọc trên
đĩa thạch BHIA đều có hình tròn, rìa đều, bóng, lồi thấp, tâm hơi đậm, đường
kính 0,5-0,7mm. Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu 5%, sau
24 giờ nuôi cấy, trên đĩa thạch mọc lên khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn rìa đều,
tâm hơi đậm, khuẩn lạc tạo vòng dung huyết β hoặc γ nhỏ, trong suốt, rìa
không rõ ràng. Các liên cầu khuẩn Streptococcus sp, bị ức chế nếu sống trong
môi trường có nồng độ muối NaCl 6,5% [6][7]
2.2.2. Cấu trúc kháng nguyên
+ Kháng nguyên C đặc hiệu nhóm: Năm 1930, Lancefield dựa vào
kháng nguyên C (cacborhydrat) của vách tế bào vi khuẩn xếp liên cầu khuẩn
thành các nhóm từ A, B, C,…R. Liên cầu nhóm A và D có khả năng gây bệnh
cho người. Các nhóm khác (B, C) gây bệnh cho gia súc hoặc không gây bệnh.
+ Kháng nguyên M đặc hiệu typ: Kháng nguyên M (protein M) cũng
nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên này, Lanceifeld xếp liên
cầu nhóm A thành 80 typ huyết thanh khác nhau. Protein M nằm trên bề mặt
tế bào nên dễ dàng kết hợp với kháng thể kháng protein M. Kháng nguyên M
16
có khả năng chống lại sự thực bào vì vậy nó liên quan trực tiếp tới độc lực của

liên cầu.
Ngoài ra, còn có những kháng nguyên khác của liên cầu như:
+ Kháng nguyên T là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá hủy bởi
nhiệt độ ở pH axit.
+ Kháng nguyên P bản chất là nucleoprotein, kháng nguyên này có
phản ứng chéo với nucleoprotein của tụ cầu.
+ Kháng nguyên R bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Có
một số typ M của liên cầu A và kháng nguyên vỏ axit hyaluronic có ở những
liên cầu có vỏ của nhóm A.
2.2.3. Các enzym và độc tố.
a, Các enzym (men).
Enzym streptokinase, thường có ở liên cầu nhóm A, C, G. Enzym này
là một kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể anti
Streptokinase (ASK). Streptokinase có khả năng làm tan tơ huyết, hoạt hóa
xung quanh vùng tổn thương tạo điều kiện cho vi khuẩn lan tràn.
Một loại enzym thứ hai đó là streptodornase ( Deoxyribonuclease).
Streptodornase có khả năng thủy phân DNA, do đó làm lỏng mủ nhưng chỉ có
tác dụng khi có mặt của ion Mg. Enzym streptodornase có 4 loại A, B, C, D
và đều là những kháng nguyên kích thích cơ thể hình thành những kháng thể
đặc hiệu.
Ezym thứ ba đó là hyaluronidase, enzym này có tác dụng thủy phân
axit hyaluronic của tổ chức, tạo điều kiện cho vi khuẩn lan truyền sâu rộng
vào các mô. Enzym này cũng có tính kháng nguyên kích thích cơ thể sinh ra
kháng thể anti Streptohyaluronidase
17
Một enzym có ở liên cầu khuẩn nhóm A, C và G khác nữa là enzym
diphospho pyridine nucleotidase (DPNase), enzym này có độc tính với tế bào
bạch cầu và gây chết bạch cầu. Đây cũng là enzym có tính kháng nguyên và
kích thích cơ thể hình thành kháng thể. Ngoài ra, còn có proteinase, có tác
dụng phân hủy protein và kích thích cơ thể hình thành kháng thể [20]

b, Khả năng sinh độc tố của Streptococcus sp
Các liên cầu khuẩn tan máu β nhóm A (Group A β-hemolytic
streptococcus) có phương thức xâm nhập ngoại bào, chúng phá vỡ các rào cản
của tổ chức để phát tán các tác nhân gây bệnh đến các vị trí khác trong cơ thể
trong khi bản thân chúng vẫn tồn tại bên ngoài tế bào vật chủ. Sau khi xâm
nhập, Streptococcus sp tiết ra các enzym phá hủy các phân tử của tế bào vật
chủ như: hyaluronidase để cắt đứt các proteoglycan ở tổ chức gắn kết,
streptokinase phá hủy các cục fibrin,…
Ngoài ra, một số Streptococcus sp còn có khả năng tạo vỏ vi khuẩn
(capsule), khả năng này là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất của vi
khuẩn về phương diện xâm nhập tại vị trí viêm. Vỏ vi khuẩn này giúp chúng
chống lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng như để kháng kháng sinh.
Streptococcus sp nguy hiểm có khả năng tạo vỏ đó là Streptococcus
pneumoniae.
Theo Kennet Todar (2002), thì Streptococcus sp có 2 loại dung huyết
tố, đó là Streptolysin O và Streptolysin S. Hầu hết liên cầu tan máu β đều có
khả năng sinh ra men này. Chúng bị mất hoạt tính bởi oxy nên trên môi
trường nuôi cấy chúng gây tan máu ở phía sâu trong thạch. Độc tố này mang
tính chất của một ngoại độc tố, có tính kháng nguyên mạnh nên kích thích cơ
thể hình thành kháng thể ( anti Streptolysin O). Việc định lượng kháng thể
này có giá trị trong chẩn đoán bệnh liên cầu đặc biệt trong bệnh thấp tim và
viêm cầu thận cấp.
18
Bên cạnh đó, nhiều liên cầu tiết ra Streptolysin S, men này gây tan máu
ở bề mặt môi trường nuôi cấy, tính kháng nguyên yếu nên không kích thích
cơ thể hình thành kháng thể, nó còn làm ảnh hưởng đến chức năng của tế bào
lympho T (Lewis W.Wannamaker, 1983).
Ngoài ra, độc tố hồng cầu còn được gọi là độc tố sinh đỏ của Streptococcus
sp, cũng là căn nguyên của một số loại bệnh tật. Độc tố này có bản chất là protein,
gây phát ban trong bệnh tinh hồng nhiệt (Lewis W.Wannamaker, 1983).

Các độc tố erythrogenic cũng được nhắc đến trong các tài tiệu như
Streptococcus sp gây sốt Exotoxin loại A, B, C (Patrick M Schlievert, 1989).
2.3. Tình hình nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protein G từ Streptococcus sp
Hiện nay, vấn đề nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protein G từ
Streptococcus sp còn khá mới mẻ, hầu như không có hoặc có rất ít các công trình
nghiên cứu khoa học về khả năng sinh tổng hợp protein G từ Streptococcus sp.
Các công trình nghiên cứu trên đối tượng là Streptococcus sp hầu như
là các nghiên cứu về mặt bệnh học mà liên cầu khuẩn này gây ra, như các
nghiên cứu về: đặc điểm mô bệnh học cá rô (ANABAS TESTUDINEUS)
nhiễm khuẩn Aeromonas hydrophila và Streptococcus sp trong điều kiện thực
nghiệm (Đặng Thụy Mai Thy và cs, Tạp chí Khoa học, 2012); Phân lập và
xác định khả năng gây bệnh xuất huyết trên cá rô đồng (ANABAS
TESTUDINEUS) của vi khuẩn Streptococcus agalactiae ( Đặng Thị Hoàng
Oanh và cs, Tạp chí Khoa học, 2012); Phân lập và xác định đặc điểm của vi
khuẩn Streptococcus agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp) bệnh phù
mắt và xuất huyết ( Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, Tạp
chí Khoa học, 2012)…
Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về protein G và Streptococcus
sp chủ yếu là các nghiên cứu về cấu trúc của protein G, biểu hiện và tinh sạch
protein G. Như các công trình nghiên cứu Streptococcal Protein G (Ulf