Phân lập, tuyển chọn một số xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn và phân giải cellulose

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
NGUYỄN NHẬT TIÊN
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ
KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ
PHÂN GIẢI CELLULOSE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đà Lạt
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ
KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ
PHÂN GIẢI CELLULOSE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 33
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn: Th.S Nguyễn Khoa Trưởng
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Nhật Tiên
Đà Lạt
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả và số liệu
nghiên cứu hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi
xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu này.
Đà Lạt
LỜI CÁM ƠN
Tôi xin chân thành cám ơn Th.S Nguyễn Khoa Trưởng – người đã trực tiếp
hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài
khóa luận tốt nghiệp đại học này.
Tôi chân thành cám ơn Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt, các thầy cô Khoa
Sinh học – trường Đại học Đà Lạt đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và tạo điều
kiện học tập tốt nhất cho tôi trong suốt 4 năm học vừa qua.

Tôi chân thành cám ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hành để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
MỤC LỤC


 !"#$%%&'()*"+,-
./01+22"3435+6 3 57+6895*:53;

.</01+22"3435+6 3 57+6895*:53
=5>?@A2#B*C5
DEFFGDHI/HJK%
DANH MỤC BẢNG


DEFFGDHI/HJK%
DANH MỤC BIỂU ĐỒ


DEFFGDHI/HJK%
DANH MỤC HÌNH


DEFFGDHI/HJK%
MỞ ĐẦU
Hiện nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của lĩnh vực chế biến nông sản
nhằm phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu, một lượng lớn phế phụ phẩm nông
nghiệp như bã mía, vỏ cà phê, rơm rạ, xơ dừa,… đã được tạo ra. Thành phần chính của
các loại phế phụ phẩm này là cellulose. Đây là một chất hữu cơ rất khó phân hủy. Hầu
hết các nguồn phế phụ phẩm này được thải bỏ trực tiếp vào môi trường ở dạng thô tự

nhiên hoặc đốt, gây ô nhiễm môi trường trầm trọng.
Quá trình phân hủy cellulose gồm một chuỗi các phản ứng phức tạp, xảy ra dưới
tác động của enzyme cellulase. Tuy nhiên, chỉ có enzyme cellulase ở các loài vi sinh
vật mới có khả năng phân hủy hoàn toàn cellulose.
Mặt khác, Việt Nam là một nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng
ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, đặc biệt là các loài vi sinh
vật gây bệnh cây trồng. Vì vậy, việc sử dụng các loại hóa chất bảo vệ thực vật từ lâu
đã rất phổ biến ở nước ta. Song việc này sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi
trường cũng như sức khỏe con người. Do đó, việc sử dụng các tác nhân sinh học để ức
chế các quần thể vi sinh vật gây hại đã và đang được chú trọng nghiên cứu. Trong đó,
xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase ngoại bào và khả
năng kháng khuẩn cao. Đặc biệt, khi kết hợp với một số chủng vi khuẩn, nấm mốc sẽ
cho hiệu suất phân giải cellulose và các dẫn xuất của cellulose như carboxymethyl
cellulose, hydroxyethyl cellulose khá cao.
Hiện nay, trong số 8000 chất kháng sinh hiện được biết đến trên thế giới thì có
đến trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [1]. Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn
gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Một số chất kháng sinh như
streptomycin, neomycin, tetracylin, cloramphenicol, erythromycin… có khả năng
kháng khuẩn mạnh, đặc biệt chúng còn có khả năng kháng nhiều loài vi khuẩn kháng
penicillin. Chính vì vậy, các chất kháng sinh này được sử dụng rất phổ biến và hiệu
quả trong nhiều lĩnh vực như y học, chăn nuôi, thú y, thủy sản…
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân
lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn và phân giải
cellulose” nhằm tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh để xử lý phế
phụ phẩm và phòng chống một số bệnh do vi sinh vật gây hại trong nông nghiệp.
Nội dung nghiên cứu:
1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn tại Đà Lạt.
2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn.
3. Khảo sát khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn.
4. Khảo sát điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của

xạ khuẩn.
1
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất
rộng rãi trong tự nhiên. Chúng tồn tại trong đất, nước, trong các cơ chất hữu cơ (phân
chuồng, bùn, rác…), thậm chí trong cả những cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không
phát triển được.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ
khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật trong đất [4].
Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh
tác và thảm thực vật. Ngoài ra, sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào pH
môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu
(pH từ 6,8 - 7,5). Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong
các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong
năm.
1.1.2. Đặc điểm của xạ khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm chung
Trước thế kỷ XIX, xạ khuẩn được xếp vào nhóm nấm. Về sau với những nghiên
cứu sâu hơn về mặt tế bào học, người ta nhận thấy xạ khuẩn có nhiều nét khác biệt so
với nấm mốc nhưng lại giống vi khuẩn:
- Kích thước xạ khuẩn nhỏ bé tương tự kích thước của vi khuẩn. Đường kính sợi
khoảng 1- 2μm (nhỏ hơn nhiều so với đường kính sợi nấm 7 - 9μm).
- Nhân của xạ khuẩn giống với nhân của vi khuẩn, nhân chưa phân hóa.
- Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitine mà chứa hợp chất điển
hình của vi khuẩn là glucopeptide.
- Xạ khuẩn sinh sản phân bào theo kiểu amitose (phân bào không tơ). Đây là một
tính chất đặc trưng của vi khuẩn.
- Xạ khuẩn không có giới tính, nghĩa là không phân thành tế bào đực và tế bào
cái, có thể hình thành hợp tử từng phần nhờ tiếp hợp, tải nạp và biến nạp.

- Xạ khuẩn cũng bị phage tấn công (Actinophage).
Xạ khuẩn là một trong những loại vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự
nhiên. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong tự
nhiên. Ngoài ra, xạ khuẩn có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzyme (cellulase,
protease, amylase, chitinase, invertase…), một số vitamine và acid hữu cơ.
Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích vẫn tồn tại một số xạ khuẩn sinh ra
những chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật, hoặc có thể gây bệnh cho người
và động vật [3].
1.1.2.2. Khuẩn lạc
2
Cũng giống như vi khuẩn, nấm mốc và nấm men, khi nuôi cấy trên môi trường
đặc xạ khuẩn cũng tạo thành khuẩn lạc.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung
tơ hay dạng màng dẻo.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều
kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, … Đường kính mỗi khuẩn
lạc khoảng 0,5 - 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn
[5]. Khuẩn lạc xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài cùng có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp hơn, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh hóa
khác nhau. Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như các chất kháng sinh, độc tố,
các loại enzyme, các acid amine, các acid hữu cơ cũng được tích lũy một cách khác
nhau ở mỗi lớp. Khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng,
nâu, hồng, xám, trắng, tím tùy thuộc từng loài và điều kiện nuôi cấy [3].
1.1.2.3. Khuẩn ty
Khi nuôi cấy trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ
chất (cắm sâu vào bề mặt thạch) có chức năng hút nước, chất dinh dưỡng và khuẩn ty
khí sinh (phát triển trên bề mặt thạch) đảm nhận chức năng sinh sản.
Một đặc điểm dễ nhận biết của xạ khuẩn đó là xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát
triển giống như hệ khuẩn ty của nấm mốc, phân nhánh và không có vách ngăn. Tuy
nhiên, khuẩn ty của xạ khuẩn mảnh hơn nhiều so với khuẩn ty của nấm mốc.

Các loại xạ khuẩn đều có cùng một kiểu cấu tạo khuẩn ty, nhưng kích thước dài
hay ngắn, thẳng hay lượn sóng, phân nhánh nhiều hay ít là tùy thuộc vào từng loài xạ
khuẩn. Khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng
tâm. Nguyên nhân của hiện tượng này là do bản thân xạ khuẩn sản sinh ra các chất ức
chế khuếch tán ra môi trường xung quanh và tạo thành các vùng bất lợi đối với sự sinh
trưởng của xạ khuẩn. Tại những vùng này, khuẩn ty phát triển yếu ớt, chúng chỉ tạo
thành những sợi mảnh, riêng lẻ. Các sợi này sau đó lan sang vùng môi trường không
có chất ức chế và tiếp tục phát triển mạnh mẽ. Sau đó chúng lại tiếp tục sản sinh ra các
chất ức chế. Khác với vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng phân nhánh. Đầu tiên, trên bề
mặt sợi xuất hiện những mấu lồi, sau đó chúng lớn lên thành chồi và từ đây sẽ kéo dài
ra thành nhánh mới [3, 21].
1.1.3. Bào tử và sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty
khí sinh (cuống sinh bào tử). Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình
thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất để phân loại xạ
khuẩn.
Cuống bào tử có thể khác nhau ở số vòng xoắn, đường kính của các vòng xoắn,
mức độ xoắn và chiều xoắn.
Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmentation)
hoặc do sự cắt khúc (segmentation) của cuống sinh bào tử [8].
Bào tử hình thành có thể dạng hình cầu, hình ovan, hình viên trụ, hình que với
mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông.
3
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng Glycosaminoglycan dày khoảng 300 –
400Å , chia thành 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của
điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, pH, …
Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những đặc điểm
tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy
nhiên, những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên
môi trường có nguồn nitơ khác nhau.

1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ
là một tế bào gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh
chất, chất nhân và các thể ẩn nhập [3, 4].
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm, có tác dụng
duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
- Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120Å, khi già có thể đạt tới 150 - 200Å.
- Lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50Å.
- Lớp trong dày khoảng 50Å.
Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N -
acetyl glucozamin liên kết với N - acetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucoside. Khi
xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucoside bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo
thành thể sinh chất (protoplast). Cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn
hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipid khác. Điều này chứng tỏ lớp ngoài
cùng có cấu tạo bằng lipid. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cenllulose và chitin
nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận
chuyển vật chất qua màng tế bào [3, 5].
Căn cứ vào thành phần hoá học thành tế bào, xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm
chính [1, 4]:
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là acid L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glycine. Thuộc về nhóm này có các giống Streptomyces,
Streptoverticillium, Chainia, Actinopycnidium, Actinosporangium, Elytrosporangium,
Microellobosporia, Sporichthya, Intrasporangium.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6
-diaminopimelic (m - ADP) và glycine. Thuộc về nhóm này có các giống
Micromonospora, Actinoplanes, Amorphosporangium, Ampullariella, Dactylospor-
angium.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6
-diaminopimelic. Thuộc về nhóm này có các giống Actinomadura, Microbispora,
Thermoactinomyces, Actinobifida, Streptosporangium, Spirillospora, Planomono-

spora, Dermatophilus, Geodermatophilus.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là acid meso - 2,6 -
diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc về nhóm này có các giống
Mycobacterium, Nocardia, Micropolyspora, Pseudonocardia, Thermomonospora.
4
Ngoài ra, còn có một số giống xạ khuẩn có thành phần chính của thành tế bào
không giống với các nhóm trên.
Bên dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo
chủ yếu bởi 2 thành phần là phospholipid và protein giống như tế bào các vi sinh vật
khác. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình
hình thành bào tử của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào
vi khuẩn. Điểm giống nhau cơ bản giữa xạ khuẩn và vi khuần là chưa có nhân điển
hình. Trong tế bào chất của xạ khuẩn có thể nhân, hạt volutin, không bào, các thể ẩn
nhập và các cơ quan con khác. Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh
vật prokaryote là ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%,
trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [3, 22].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong
nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (plasmid). Các plasmid
đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải
một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh,
chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn.
Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng. Nguồn cacbon chúng thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein,
pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn… Tuy nhiên,
khả năng đồng hoá các chất này ở các loài hay các chủng xạ khuẩn khác nhau là khác
nhau.
1.2. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
Hiện nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng và mạnh mẽ của sinh học phân
tử, hóa sinh học, lý sinh học , việc định danh một chủng xạ khuẩn được tiến hành

tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số,
nghiên cứu chủng loại phát sinh Tuy nhiên, việc định danh xạ khuẩn vẫn chủ yếu
dựa vào các đặc điểm về hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn
dịch.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng
để phân loại xạ khuẩn. Người ta nuôi cấy các chủng xạ khuẩn cần định danh trên môi
trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện và thời gian nhất định để chúng biểu
hiện các đặc điểm mà ta quan tâm.
Tiến hành quan sát, mô tả và ghi lại những đặc điểm về hình thái và tính chất
nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử.
Các đặc điểm về hình thái và tính chất nuôi cấy được coi là những dữ liễu cơ
bản để phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, xạ khuẩn không bền vững về mặt di truyền,
chúng thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có
thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay ngược lại, các loài khác nhau có thể giống
nhau về mặt hình thái [8]. Vì vậy, để phân loại được chính xác, người ta phải dùng
5
thêm các chỉ tiêu bổ sung khác như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học, sinh
học phân tử.
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong 20 năm trở lại
đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng
thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật [6]. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc
điểm sau:
- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amine trong thành phần peptide
và đường trong thành tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của
mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các mắc xích của PG.
- Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium và corynebacter. Đây là đặc điểm phân loại

cơ bản cho các chi đó.
- Acid béo thường được sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa mạch thẳng
và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử
cacbon thứ 10. Sự có mặt của acid 10 - metylloctade canoit (acid tubereulostearinoic)
là đặc điểm để phân loại đến chi.
- Photpholipid (gồm 5 typ photpholipid: PI, PII, PIII, PIV, PV) là thành phần đặc
trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì Typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi
muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể
nào không xác định thành tế bào.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh
lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất
kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme,
nhu cầu về oxy, pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi
trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất
đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các
sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cùng với
đặc điểm nuôi cấy dễ biến động [8]. Do đó, chúng ít có giá trị về mặt phân loại.
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh
hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phương pháp này dựa trên
sự đánh giá về mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm,
chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa [21].
6
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ
số giống nhau (hệ số S - Similarity). Có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng.
7
 Công thức của Sokal và Michener (S

SM
)
100 X
)(
dSS
SS
SM
NNN
NN
S
AB
++
+
=
−+
−+
Trong đó:
)( AB
SM
S
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
+
S
N
: Số các tính trạng giống nhau.
d
N
: Số các tính trạng khác nhau.
−
S

N
: Số các tính trạng đối lập nhau.
 Công thức của Jacard (S
J
)
100 X
)(
dS
S
J
NN
N
S
AB
+
=
Trong đó:
)( AB
J
S
: mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
S
N
: Tổng số các đặc điểm giống nhau của hai chủng so sánh.
d
N
: Tổng số các đặc điểm khác nhau của hai chủng so sánh (tổng số các đặc điểm
dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ cây") của
các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm.

1.3. Cellulose và cellulase
1.3.1. Cellulose
Cellulose là polyme sinh học nhiều nhất và bền vững nhất trong tự nhiên
(Murashima, 2002), là thành phần cấu tạo chủ yếu của thành tế bào thực vật.
1.3.1.1. Cấu trúc
Cellulose là một polysaccharide mạch thẳng, gồm nhiều đơn vị β - D- Glucose
nối với nhau bằng liên kết β - 1, 4 - glucoside. Công thức cấu tạo là (C
6
H
10
O
5
)
n
hay
[C
6
H
7
O
2
(OH)
3
]
n
, trong đó n có thể nằm trong khoảng 5.000 - 14.000. Do đó, trọng
lượng của phân tử cellulose dao động từ 50.000 – 2.500.000 Dalton tùy thuộc nguồn
gốc loài thực vật [9].
8
Cấu trúc của cellulose không đồng nhất và thường có 2 vùng:

Vùng kết tinh: độ trật tự rất cao, bền với tác động của các điều kiện bên ngoài.
Do đó, enzyme cellulase chỉ tác động trên bề mặt của vùng này.
Vùng vô định hình: cấu trúc không chặt chẽ, dễ dàng bị tác động bởi các yếu tố
bên ngoài. Khi gặp nước, chúng sẽ trương lên nên enzyme cellulase dễ dàng tác động
và làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen, người ta đã xác định cellulose
có cấu tạo dạng sợi. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibrin).
Các vi sợi này kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi lớn hơn có thể nhìn thấy dưới
kính hiển vi quang học.
Hình 1.1. Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian
1.3.1.2. Tính chất
Cellulose không tan trong nước nhưng có thể trương lên khi hấp thụ nước. Đặc
biệt, cellulose dễ dàng hòa tan trong dung dịch (Cu(NH
3
)
4
(OH)
2
) và hàng loạt các dung
dịch là phức chất của đồng, niken, kẽm, cadmin…
Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nhiệt độ cao. Tuy
nhiên, cellulose sẽ bị phân hủy dưới tác động của enzyme cellulase ở 30 – 50
0
C.
Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin,
lignin. Cấu trúc này ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt động phân hủy cellulose của
enzyme cellulase.
1.3.2. Cellulase và cơ chế thủy phân cellulose
1.3.2.1. Cấu trúc
Cellulase là enzyme thủy phân cơ chất cellulose, enzyme này không có ở động

vật hay thực vật như những enzyme khác, nó được tổng hợp bởi vi sinh vật. Enzyme
cellulase bao gồm 3 loại:
- Exoglucanase :
Enzyme này còn có tên gọi khác là exo – β - 1, 4 - glucanase, cellulase C1,
cellobiohydrolase, CBH1, cellobiosidase, exo - cellobiohydrolase, avicelase, exo - β -
glucancellobiohydrolase, β - 1, 4 - glucancellobiosidase…
Enzyme này thủy phân liên kết β - 1, 4 - glucoside từ đầu không khử của chuỗi
cellulose tạo thành cellobiose. Emzyme này không thủy phân cellulose dạng kết tinh
và dạng hòa tan mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, nhưng chúng có thể
thủy phân được cellulose đã được cắt ngắn [9].
9
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của exoglucanase
- Endoglucanase
Enzyme này còn có tên gọi khác là endo - β - 1, 4 - glucanase, endocellulase,
CMCase, C
x
, β - 1, 4 - endoglucanhydrolase, celludextrinase, cellulosin AP, alkali
cellulase, cellulase A, pancellase SS…
Enzyme này thủy phân liên kết β - 1, 4 - glucoside một cách ngẫu nhiên bên
trong chuỗi cellulose giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose. Nó tác động mạnh
đến cellulose vô định hình nhưng tác động yếu đến cellulose kết tinh [9].
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của Endoglucanase
- β – glucosidase
Enzyme này còn có tên gọi khác là cellobiase β – D - glucosidase, β - 1, 6
-glucosidase, salicinase…
Enzyme này thủy phân cellobiose và các cello-oligosacchride mạch ngắn thành
glucose [9].
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của β-glucosidase
Như vậy, để thủy phân hoàn toàn cellulose cần sự có mặt của cả 3 loại enzyme trên.
1.3.2.2. Tính chất

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl
cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulose cắt liên kết β - 1, 4 -
glucoside trong cellulose, lichenin và các β – D - glucan của ngũ cốc.
10
Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.
Cellulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, pH tối thích từ 3 – 5.
Nhiệt độ hoạt động tối ưu từ 40
o
C – 50
o
C. Cellulase mất hoạt tính hoàn toàn ở
80
o
C trong 10 – 15 phút.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose và bị ức
chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại như Mn,
Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ [9].
1.3.2.3. Cơ chế thủy phân cellulose
Quá trình thủy phân cellulose phải có mặt đầy đủ 3 loại enzyme: exoglucanase,
endoglucanase, β - glucosidase. Nếu thiếu bất kỳ loại enzyme nào trong 3 loại trên thì
quá trình phân hủy cellulose không thể diễn ra hoặc phân hủy không hoàn toàn.
Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của 3 loại enzyme
cellulase này trong quá trình phân hủy cellulose. Tuy nhiên, cách giải thích của
Erikson là được nhiều người công nhận hơn cả.
Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơ chế tác động của chúng như sau:
Giai đoạn 1: dưới tác động của enzyme endoglucanase vào các vùng vô định
hình trên bề mặt cellulose, các liên kết β - 1, 4 - glucoside bị cắt tạo thành các đầu
mạch tự do.
Giai đoạn 2: dưới tác động của enzyme exoglucanase, các sợi polysaccharide bị
cắt thành các disaccharide ở dạng cellobiose.

Giai đoạn 3: dưới tác động của enzyme β - glucosidase, các cellobiose bị thủy
phân thành các gốc glucose.

Hình 1.5. Cơ chế thủy phân cellulose
11
1.3.3. Sự hình thành cellulase từ xạ khuẩn
Hệ enzyme ở vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có thể đồng hóa hầu
hết các chất trong tự nhiên, từ các hợp chất đơn giản như N
2
, CO
2
, CH
4
… đến các hợp
chất hữu cơ phức tạp như tinh bột, lipid, protein, cellulose… Điều này chứng tỏ trong
tế bào vi sinh vật phải chứa những hệ enzyme tương ứng.
Enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính lớn hơn rất nhiều so với enzyme từ động vật
và thực vật, vì chúng có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. Vi sinh vật sinh trưởng và
phát triển rất nhanh, hàm lượng enzyme trong cơ thể tương đối lớn. Do đó, với quy mô
sản xuất công nghiệp ta có thể thu được một lượng lớn enzyme sau một thời gian lên
men ngắn.
Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của xạ khuẩn đã được con người
nghiên cứu từ rất lâu. Ngay từ năm 1930, Jensen đã phân lập được nhiều loài
Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase. Năm 1965, Enger và
Sleeper đã chứng minh được enzyme cellulase do Streptomyces antibiolicus sinh tổng
hợp thuộc loại C
x
, và bằng phương pháp điện di, tác giả cũng chứng minh được
enzyme này có 3 thành phần khác nhau.
Trong những năm gần đây, nhóm xạ khuẩn đang được các nhà khoa học trên

thế giới quan tâm nghiên cứu. Nhìn chung có khá nhiều nghiên cứu, đánh giá, phân
loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces với mục đích thu nhận được nguồn enzyme
cellulase cao nhất.
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase
1.3.4.1. Nguồn carbon
Để vi sinh vật tổng hợp enzyme cellulase thì trong môi trường nuôi cấy phải có
celllulose. Đây vừa là chất cảm ứng, vừa là nguồn cung cấp carbon.
Những nguồn carbon thường được sử dụng và có hiệu quả khi nuôi cấy là giấy
báo, giấy lọc, bông thấm nước, các phế phụ phẩm nông nghiệp như lõi ngô, bã mía, bã
củ cải đường, bột rơm, cám…
Các nguồn carbon khác như glucose, cellobiose, acetate, oxalate, succinate, acid
citric, các sản phẩm trung gian của chu trình Krebs… sẽ kìm hãm quá trình sinh tổng
hợp enzyme cellulase của vi sinh vật. Tuy nhiên, nếu bổ sung vào môi trường glucose
với một nồng độ thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của vi sinh vật cũng như sự tổng
hợp enzyme cellulase của chúng.
1.3.4.2. Nguồn nitơ
Đây là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase
của vi sinh vật. Nguồn nitơ thường sử dụng là các hợp chất hữu cơ phức tạp như bột
đậu nành, dịch thủy phân casein… Các hợp chất này có ảnh hưởng không giống nhau
đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của các loài vi sinh vật khác nhau.
Nitơ vô cơ trong thành phần môi trường có thể ở dạng các muối amôn và nitrat.
Các muối amôn ít có tác dụng nâng cao hoạt lực của enzyme cellulase, thậm chí còn
ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. Nguyên nhân là sau khi đồng hóa
NH
4
+
trong môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ làm giảm pH môi trường. Điều này
12
không những ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase mà còn làm mất hoạt
tính enzyme sau khi tạo thành.

Muối nitrat là thành phần thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme
cellulase. Muối nitrat làm kiềm hóa môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sinh
tổng hợp enzyme cellulase. Người ta thường sử dụng NH
4
NO
3
làm nguồn nitơ cho
nhiều loại môi trường nuôi cấy.
1.3.4.3. Các nguyên tố khoáng
Các nguyên tố khoáng như Mg, P, K, Mn, Zn và các nguyên tố vi lượng là một
yếu tố không thể thiếu cho sự sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme
cellulase của vi sinh vật.
1.3.4.4. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp cũng
như hoạt tính enzyme của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một ngưỡng
nhiệt độ khác nhau.
Các chủng xạ khuẩn có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với các loại nấm sợi.
Enzyme cellulase từ xạ khuẩn cũng có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao hơn
so với enzyme từ các loại nấm sợi.
1.3.4.5. Thời gian nuôi cấy
Các loài vi sinh vật khác nhau có thời gian nuôi cấy khác nhau để thu được
lượng enzyme nhiều nhất.
Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase dài
hơn so với các chủng nấm sợi thông thường. Các chủng nấm sợi này chỉ mất 24 – 36
giờ là đã có hoạt lực enzyme khá mạnh, còn xạ khuẩn phải mất ít nhất 72 giờ.
1.3.4.6. pH
Mỗi loại vi sinh vật phát triển trong những điều kiện pH khác nhau.
Sự thay đổi pH phụ thuộc vào sự trao đổi chất của vi sinh vật và khả năng đệm
của cơ chất. pH tối thích cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc là
4 - 6, xạ khuẩn là trong môi trường kiềm yếu.

1.3.4.7. Độ ẩm
Mỗi loại vi sinh vật thích hợp với một môi trường độ ẩm nhất định. Đối với xạ
khuẩn và nấm mốc độ ẩm thích hợp là 60 – 65%.
1.3.4.8. Độ thoáng khí
Vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cellulase thường hiếu khí. Do đó, độ thoáng
khí ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của chúng. Trong
nuôi cấy bán rắn, độ xốp của cơ chất và bề dày của lớp môi trường là 2 yếu tố quan
trọng nhất.
13
1.4. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn
1.4.1. Chất kháng sinh
Theo khái niệm cũ, chất kháng sinh là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật mà
ngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác một
cách chọn lọc (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…).
Thuật ngữ antibiotic được bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, “bios”
là sự sống. Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt
penicillin với sulfonamit đã được phát hiện vào những năm 1930. Thuật ngữ này được
thay đổi sau khi penicillin và những chất kháng khuẩn khác được cải tiến và đổi mới
trong phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng phổ biến để chỉ các
hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, tổng hợp hay bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở
nồng độ thấp.
Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng
kháng virus, tế bào ung thư…
Tất cả các chất kháng sinh đều có tính độc chọn lọc, mỗi chất kháng sinh
thường chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [7].
1.4.2. Cơ chế tác động của chất kháng sinh lên vi khuẩn
Vi khuẩn là một tế bào hoàn chỉnh, có khả năng sống riêng biệt và phát triển
không phụ thuộc vào tế bào chủ. Mỗi thành phần trong cấu trúc tế bào vi khuẩn có cấu
tạo thích hợp, trở thành “đích tác động” cho kháng sinh nhắm đến, gắn vào và cho tác
dụng.

Dựa vào đặc tính này người ta nghiên cứu từng loại kháng sinh tác động vào
một trong các thành phần của tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn không thể phát triển
và không tồn tại được.
Mỗi một nhóm kháng sinh có tác dụng khác nhau lên vi khuẩn.
Có 4 cơ chế chính của kháng sinh tác động vào tế bào vi khuẩn [24, 26]:
- Ức chế quá trình tổng hợp vỏ của vi khuẩn. Các nhóm kháng sinh gồm có
penicillin, bacitracin, vancomycin. Chúng tác động lên quá trình tổng hợp vỏ tế bào
làm cho vi khuẩn dễ dàng bị các đại thực bào tiêu diệt do thay đổi áp suất thẩm thấu.
- Ức chế quá trình trao đổi chất của màng tế bào. Các nhóm kháng sinh gồm có:
colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Chúng ức chế quá trình trao đổi chất
của màng tế bào làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị đẩy ra ngoài, gây
chết tế bào vi khuẩn.
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. Do đó, vi khuẩn không thể sinh sản tạo
tế bào mới.
Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
14
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm
ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA.
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch
đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p - aminobenzonic acid) có tác dụng
cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin
làm ức chế quá trình tạo acid nucleic.

1.4.3. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để
phân loại xạ khuẩn.
Có nhiều quan niệm khác nhau về việc hình thành chất kháng sinh. Một số tác
giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là do cơ chế nhằm giúp vi sinh vật tồn tại
trong tự nhiên. Số khác cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là do sự cạnh tranh
trong môi trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng chất kháng sinh là sản
phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân
bằng của chu kỳ sinh trưởng [2].
Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và được hình thành bởi các
chủng vi sinh vật khác nhau nhưng quá trình tổng hợp chúng lại tuân theo một số con
đường nhất định:
- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một
chuỗi phản ứng enzyme.
- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hay ba chất chuyển hóa sơ cấp khác
nhau.
- Chất kháng sinh được hình thành từ con đường polyme hóa các chất chuyển
hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục chuyển hóa qua các phản ứng enzyme khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp hai hay nhiều chất kháng sinh có
cấu trúc hóa học và tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh
phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene. Ngoài các gene chịu trách nhiệm sinh tổng
hợp chất kháng sinh còn có các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme
và cofactor.
1.4.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Đa số các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn.
Streptomycin: được Waksman phát hiện vào năm 1943, có nguồn gốc từ xạ
khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các vi khuẩn Gram (+) khá mạnh.
Streptomycin được sử dụng rất hiệu quả trong điều trị các bệnh dịch hạch, ho gà. Quan
trọng hơn cả là được sử dụng để điều trị bệnh lao [1].
15

Neomycin: là chất kháng sinh phổ rộng, có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Streptomyces fradiae. Tác dụng lên cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Đặc
biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn kháng penicillin và streptomycin [10].
Gentamycin: là chất kháng sinh phổ rộng, có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Micromonospora purpurea. Tác dụng lên vi khuẩn Gram (+) như tụ cầu khuẩn, phế
cầu khuẩn đã kháng penicillin và vi khuẩn Gram (-) như màng não cầu, lậu cầu. Chủ
yếu được sử dụng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [1].
Tetracyclin: là kháng sinh phổ rộng, được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số
chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Tác dụng trên cả vi khuẩn Gram (-) và vi
khuẩn Gram (+). Ngoài sử dụng trong y học, tetracycin còn được sử dụng trong chăn
nuôi, thú y [1, 7].
Cloramphenicol: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuela. Được
phát hiện năm 1947, có tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Ngoài
việc được sử dụng trong y học, chất kháng sinh này còn được sử dụng trong chăn nuôi,
thú y và thủy sản [1].
Erythromycin: là chất kháng sinh có phổ rộng đối với vi khuẩn Gram (+), có
nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus. Được sử dụng nhiều nhất trong điều trị
bệnh viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [1].
Novobicin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và
Streptomyces niverus. Có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn Gram (+). Đặc
biệt có khả năng kháng các tụ cầu khuẩn đã kháng penicillin và một số chất kháng sinh
khác [1, 20].
Amphoterycin B: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces nodosus. Được dùng
để điều trị các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [20].
Dactinomycin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces antibiticus. Có tác
dụng kìm hãm sự phát triển của các khối u ác tính. Được sử dụng để điều trị một số
bệnh ung thư [20].
Daunorubixin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces coeruleorubidus. Được
dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [20].
1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

1.4.5.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất
kháng sinh của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28
o
C – 30
o
C,
nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng 18
o
C –
28
o
C [2].
 pH môi trường
Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi
trường. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các
enzyme. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là trung tính, pH
kiềm hay acid đều ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh [2, 19].
16
 Độ thông khí
Xạ khuẩn là loài vi sinh vật cần độ thông khí cao hơn so với các loài vi sinh vật
khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình
nuôi cấy) [21]. Do vậy, để đảm bảo thông khí tốt người ta thường bổ sung vào môi
trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả năng hòa tan oxy. Nồng độ oxy thích
hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh là 2 – 8ml O
2
/100ml môi trường lên men [3].
1.4.5.2. Tuổi giống
Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên

men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống cấy
truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh chất kháng sinh cao nhất thường là
24 giờ tuổi. Lượng giống cấy truyền khoàng 2 – 10% [14].
1.4.5.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
Chất kháng sinh là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp chất kháng
sinh phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường. Quan trọng nhất là nguồn carbon,
nitơ, tỷ lệ C/N, các chất khoáng [7, 12].
 Nguồn carbon
Các hợp chất carbon có ý nghĩa hàng đầu đối với sự sinh trưởng và hình thành
chất kháng sinh. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn carbon thích hợp là tinh bột.
Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các nguồn đường là khác
nhau. Có những chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucose, mannose,
fructose…, có những chủng sử dụng tốt các loại đường đôi như sucrose, maltose…
Ngoài ra, một số chủng còn có khả năng sử dụng một số loại acid hữu cơ và chất béo
làm nguồn carbon trong lên men chất kháng sinh.
 Nguồn nitơ
Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh đều đòi hỏi cả 2 nguồn nitơ
vô cơ và hữu cơ. Nguồn nitơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột
đậu tương, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng
phosphate cao trong cao ngô sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh [21].
Nguồn nito vô cơ thường được sử dụng là muối amôn. Muối nitrat không thích hợp
cho sinh tổng hơp chất kháng sinh ở nhiều loài xạ khuẩn.
 Nguồn phosphate vô cơ
Phosphate vô cơ đóng vai trò như chất điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng
sinh. Nồng độ phosphate thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường không
vượt quá 10mg/ml. Nồng độ phosphate ban đầu cao sẽ làm tăng lượng acid nucleic dẫn
tới kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến
làm giảm hay ngưng hẳn quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh.
 Các yếu tố vi lượng
Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men. Nếu môi trường

lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn.
Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường lên men sẽ làm thay đổi
đáng kể khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn.
17
 Hình thức lên men
Trong sinh tổng hợp chất kháng sinh, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong
những yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan
sát thấy và chất kháng sinh được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng. Quá trình sản
xuất chất kháng sinh thường được tiến hành nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cánh
khuấy và bộ phận sục khí.
18