Kỹ thuật phân tích vi sinh SHIGELLA

GVHD: Văn Hồng Thiện
Nhóm 5
Lớp DHPT7
Kỹ thuật phân tích Vi sinh:
SHIGELLA
Kỹ thuật phân tích Vi sinh:
SHIGELLA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA
BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH
Nội dung

5. Báo cáo kết quả
4. Quy trình xác định
3. Môi trường và hóa chất
2. Nguyên tắc xác định Shigella
1. Tổng quan về Shigella
1. Tổng quan về Shigella
−
Bệnh lỵ trực khuẩn đã có từ rất lâu.
−
Nhưng phải tới năm 1896 trong một vụ dịch lỵ trực khuẩn ở Nhật, tác giả Shiga
đã phát hiện mầm bệnh là Shigella shiga.
−
Năm 1900 Flexneri và Strong đã tìm ra Shigella flexneri.
−
Sau này Boyd, Lentz và nhiều tác giả khác đã tìm ra các chủng lỵ khác gây bệnh
ở người.
1.1 Lịch sử hình thành
1.1 Định nghĩa về Shigella
+

Là Trực khuẩn Gram âm
+
Hiếu khí và kị khí tùy ý
+
Lên men glucose không sinh hơi
+
Hầu hết các loài không lên men và tạo axit từ lactose, dulcitol
+
Không sinh H
2
S
+
Không có enzym lysine decarboxylase
1.3 Phân loại Shigella
−
Shigella có kháng nguyên thân O, không có kháng nguyên H. Dựa vào kháng nguyên O và tính chất
sinh hoá, Shigella được chia thành 4 nhóm với nhiều typ huyết thanh:
+
Nhóm A: S.dysenteriae: có 15 typ huyết thanh, đáng chú ý là S.dysenteriae typ 1 (Sh.shiga).
+
Nhóm B: S.flexneri (có 8 typ huyết thanh).
+
Nhóm C: S.boydii (có 19 typ huyết thanh).
+
Nhóm D: S.sonnei (có 1 typ huyết thanh).
Nhóm A: Shigella dysenteriae
−
Không lên men được Mannitol.
−
Trong các chủng Shigella cần chú ý đến Sh. dysenteriae typ 1 (Shigella Shiga). Shigella shiga khác với

những Shigella khác về 3 điểm quan trọng:
+
Thường gây nên những vụ dịch lớn và kéo dài.
+
Kháng kháng sinh xảy ra phổ biến hơn các chủng khác.
+
Thường gây bệnh lỵ nặng hơn, kéo dài hơn và gây tử vong nhiều hơn chủng khác.
Nhóm C: Shigella boydii
Nhóm D: Shigella sonnei
−
Có khả năng lên men Mannitol và sinh axit
1.4 Nguồn ô nhiễm Shigella vào thực phẩm
−
Nguồn nước
−
Nguồn nguyên liệu
−
Công nhân chế biến
Các thực phẩm dễ nhiễm Shigella:
1.5 con đường lấy nhiễm

2. Nguyên tắc xác định Shigella
3. Môi trường và hóa chất

Canh Tryptose soya

Môi trường Tergitol – 7 Agar (T7A)

Canh Gram Negative (GN)


Thạch macConkey (MAC)

Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)

Lysine Decarboxylase Broth (LD)

Thạch Hektoen Enteric (HE)

Thạch Deoxycholate Citrit Agar

3. Môi trường và hóa chất

Mannitol Phenol red Broth (MPR)

Ducitol Phenol Red Broth (DPR)

Thuốc thử oxidase

Thuốc thử catalase

Thạch Triple Sugar Iron (TSI)

Môi trường thử nghiệm tính di động

Kháng huyết thanh: bốn loại kháng huyết thanh đa giá polyvalent A, B, C, D

Đồng nhất 25g mẫu trong 225 mL TSB, pH=7,2, ủ 37
o
C, 16
- 20h

Đồng nhất 25g mẫu trong 225 mL TSB, pH=7,2, ủ 37
o
C, 16
- 20h
Cấy 0,1 mL dịch tăng sinh sang 10mL môi trường GN, ủ
37
o
C, 16 - 20h
Cấy 0,1 mL dịch tăng sinh sang 10mL môi trường GN, ủ
37
o
C, 16 - 20h
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc
phân biệt (T7A, MAC, XLD,HE, DC,…), ủ 37
o
C, 16 - 20h
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc
phân biệt (T7A, MAC, XLD,HE, DC,…), ủ 37
o
C, 16 - 20h
Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Shigella, cấy sang BHI hay
TSA, ủ qua đêm ở 37
o
C
Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Shigella, cấy sang BHI hay
TSA, ủ qua đêm ở 37
o
C
Thử nghiệm sinh hóa chuyên biệt và thực hiện ngưng kết
huyết thanh để phân loại

Thử nghiệm sinh hóa chuyên biệt và thực hiện ngưng kết
huyết thanh để phân loại
Kết luận: Shigella dương tính/âm tính trong 25g mẫu
Kết luận: Shigella dương tính/âm tính trong 25g mẫu
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
-
KIA hoặc TSI:
đỏ/vàng/H2S(-)/gas(-)
-
Di động trong thạch mềm, không di động
-
Oxydase
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
-
KIA hoặc TSI:
đỏ/vàng/H2S(-)/gas(-)
-
Di động trong thạch mềm, không di động
-
Oxydase
4. Quy trình phát hiện và định danh Shigella trong thực phẩm
4.1 Tăng sinh

−
Có thể pha loãng mẫu trong bình tam giác,
sau khi chỉnh pH, ủ các bình này ở điều kiện kỵ khí ở
nhiệt độ và thời gian như trên
−

Sau đó chuyển sang tăng sinh chọn lọc:
Chuyển 0.1mL canh tăng sinh GN, ủ ở 37
o
C trong
16-20h
25g mẫu
Đồng nhất mẫu, chỉnh pH về
7
Buộc miệng túi. Ủ ở 37
o
C, 16-
20h
225mL canh Tryptone
4.2 Phân lập
Khuẩn lạc Shigella trong các môi trường
•
T7A: màu ban đầu có màu đục như sữa màu xanh hơi vàng sau đó chuyển màu xanh
nhat
•
MAC: có màu đỏ, trong suốt
4.2 Phân lập
Khuẩn lạc Shigella trong các môi trường
•
XLD: có màu đỏ, trong suốt
4.2 Phân lập
Khuẩn lạc Shigella trong các môi trường
•
Deoxycholate Citrat Agar: môi trường có màu đỏ cam hơi đục sau đó chuyển sang màu
đỏ nhạt
•

HE: có màu xanh nhạt
4.3 Thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh

Từ khuẩn lạc nghi ngờ, lấy ít nhất 5 khuẩn lạc cấy vào môi
trường không chọn lọc TSA, ủ 37
0
C trong 20 -24 giờ.

Thử nghiệm sàng lọc:cấy vào môi trường TSI, ủ 37
0
C trong
24 giờ.

4.3 Thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh

Thử nghiệm khẳng định:

Thử nghiệm hóa sinh Kết quả Thử nghiệm hóa sinh Kết quả
Simmon citrate - Salicine -
Arginine decarboxylase - Xylose -
Lisine decarboxylase - Cellobiose -
Urease - Adonitol -
Malonate - Dulcitol -
MR + Inositol -
VP -

Thực hiện phản ứng sinh hóa đặc trưng:

4.3 Thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh
Đặc trưng sinh hóa S.dysenteriae S.flexneri S.boydii S.sonnei

Sinh khí từ glucose
- - - -
β-galactose
+/- - +/- +
Ornithin decarboxylate
- - - +
Indol
+/- +/- - -
Acid từ dulcitol
- - - -
Lactose
- - - +
Mannitol
- + + +
Raffinose
- +/- - +
Saccharose
- - - +
Xylose
- - - -
4.4 Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh
−
Các huyết thanh đa giá được nuôi từ môi trường không chọn lọc, tiến hành các đối chứng (-) với
nước muối sinh lý.
−
Lưu ý: một số Shigella tạo thành kháng nguyên bề mặt (K) che đi kháng nguyên O làm phản ứng
ngưng kết không diễn ra, vì thế cần đun sôi dịch vi khuẩn trong khoảng 30 phút để loại bỏ kháng
nguyên bề mặt. Sau đó tiến hành thử nghiệm ngưng kết.

Khuẩn lạc Shigella

5. Báo cáo kết quả
Kết quả được báo cáo dưới dạng phát hiện hay không phát hiện Shigella trong 25 g mẫu.
Shigella là nhóm chứa dòng gây
bệnh nguy hiểm có thể gây triệu
chứng ở mật độ xâm nhiễm rất
thấp
Chú ý
Tuân thủ triệt để các biện pháp an
toàn khi làm việc với chủng
Salmonella đối chứng (+) và phân lập.
Hấp khử trùng môi trường và mẫu vật
trước khi rửa
Tài liệu tham khảo

Bải giảng lỵ trực khuẩn (shigellosis) http://
www.dieutri.vn/bgtruyennhiem/2-11-2012/S2971/Bai-giang-ly-tr
uc-khuan-shigellosis.htm

Thank You !