Sử dụng chỉ thị phân tử trong việc xác định giống mang gen kháng bệnh mốc sương phục vụ cho công tác chọn tạo giống khoai tây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC PHƯƠNG ĐÔNG
Đồ án tốt nghiệp
Khoa: Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường
Đề tài:
Sử dụng chỉ thị phân tử trong việc xác định ging mang gen kháng bệnh mc sương phục vụ cho công tác chọn
tạo ging khoai tây

GVHD : TS. Lê Hùng Lĩnh
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VỀ CÂY KHOAI TÂY
NỘI DUNG ĐỒ ÁN
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu:
Tạo được giống khoai tây mang gen kháng bệnh mốc sương, phục vụ cho công tác
chọn tạo giống.
Nội dung:
Đánh giá vật liệu bố mẹ và sử dụng chỉ thị phân tử trong việc xác định giống mang
gen kháng bệnh mốc sương phục vụ cho công tác chọn tạo giống cây khoai tây.
Chương 1: Tổng quan về cây khoai
Tên khoa học Solanum tuberosum L.
Giới : Plantae.
Bộ : Solanales.
Họ : Solanaceae.
Chi : Solanum.
Loài : S.tuberosum.
Là loại cây lương thực ngắn ngày và chứa nhiều chất dinh dưỡng

Có nguồn gốc từ Nam Mỹ và sau đó được trồng khá phổ biến trên Thế Giới.
1.1. Bộ phận của cây khoai tây
Thân cây khoai tây có 2
loại là thân bò và loại
thân đứng.

Hoa màu trắng phớt tím,
quả mọng hình cầu .
Rễ khoai tây phân bố chủ yếu ở tầng đất sâu
30cm, phình to lên thành củ.
1.2. Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam
Khoai tây được nhập vào Việt Nam năm 1890.
Từ năm 1980, khoai tây được quan tâm và đã có đề tài
nghiên cứu cấp Nhà nước mà Viện Khoa học và kỹ thuật Nông
nghiệp Việt Nam là cơ quan chủ trì. Nhờ vậy, năng suất khoai tây
đã được nâng cao, trước thường là 8 tấn/ha, cao nhất là 18-20
tấn/ha.
Từ năm 1981 đến nay, năng suất bình quân đạt gần 12
tấn/ha, cao nhất đạt 35-40 tấn/ha.
1.3. Bệnh mốc sương hại khoai tây
Nguyên nhân: Bệnh do nấm phytophthora thuộc bộ sương mai, lớp nấm tảo khuẩn gây ra.
Bệnh phá hoại tất cả các bộ phận lá, thân, cành, củ
và kể cả lúc đang tồn trữ.
1.4. Nghiên cứu về chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam
Theo đánh giá ở một vùng ngoại thành Hà Nội những năm 1965, thiệt hại do bệnh mốc sương gây ra cho
ruộng trồng khoai tây trung bình từ 30– 70% đã gây mất năng suất hoàn toàn cho vụ khoai tây.
Nhiều biện pháp phòng trừ và chữa bệnh cho cây khoai tây nhưng đều không mang lại hiệu quả như mong
muốn.
Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học, nhờ việc kết hợp chỉ thị phân tử với phương pháp chọn giống
truyền thống, các nhà khoa học đã dễ dàng chuyển nạp các gen kháng bệnh vào các giống mới cho năng suất,

chất lượng tốt, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí nghiên cứu
1.5. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống khoai tây
kháng bệnh mốc sương.
Gene kháng bệnh mốc sương đầu tiên được lập bản đồ và giải trình tự ở khoai tây là R1 trên nhiễm
sắc thể số 5.
Ở Việt Nam, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương có
rất ít công trình nghiên cứu. Việc chọn giống kháng trên khoai tây trong nước chủ yếu được tiến hành
theo phương pháp truyền thống.
Chương 2:Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu thực vật gồm: 9 giống khoai tây : Giống 11-106; Giống 11-113; Giống
11-115; Giống 11-116; Giống 11-119; Giống 11-129; Giống 11-140; Giống Solara và
Giống KT3.
Các cặp mồi : chỉ thị phân tử LP2, LP3
Bảng 1
Tên chỉ thị phân tử Loại chỉ thị phân tử
Trình tự
Chiều dài (bp) Nhiệt độ ngắn mồi (
0
C)
LP2 SNP F: CAA TTG ATT CAT TTT ATG TAG CGA G
R: TCT TGA CGC AAA CCT CTG CGA G
510 56
LP3 SNP F: GTA GTA CAT CAA CAT ACA TTT TGC GG
R: CTC AGA ATT CAG AGC TTC AAC TGA TG
510 58
Bản đồ phân tử locus gen R1 và vị trí của các chỉ thị phân tử
Hình 1
LP4
STI 0032

LP3
R1
LP6
STI 0006
STI 0038
STI 0049
STM 1056
STM 5146
STM 5149
STPoAc58
STPoAc85
Pota1
Pota3
Pota6
Pota8
Pota 11
Pota 12
Pota 14
Pota 16
Pota 20
Pota6
LP2
Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
- T
ách DNA tổng số
- Kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA thu được
- Xác định nồng độ DNA và kiểm tra chất lượng DNA(kiểm tra độ nguyên vẹn)
- Tiến hành phản ứng PCR
- Phân tích kết quả PCR bằng kỹ
thuật điện di trên gel polyacrylamide

2.2. phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng
- Chuẩn bị đất trồng và làm đất
- Chuẩn bị khoai giống
- Gieo trồng
- Bón phân
- Bón thúc
- Tưới nước
Máy soi gel
Máy nghiền mẫu
Máy điện di
Máy PCR
3.1. Đánh giá mức độ nhiễm bệnh mốc sương của các giống khoai tây trồng tại Sa Pa- Lào Cai (ngày trồng
3/4/2013, ngày thu hoạch 16/7/2013)
Bảng 2
TT Việt Nam code
Ngày sau trồng
35 42 49 56 63 70 77 84
1
11-106
0 3 3 5 5 5 5 5
2
11-113
0 0 0 1 5 5 10 15
3
11-115
0 5 7 8 10 15 20 30
4
11-116
0 0 1 2 5 5 5 5

5
11-119
0 0 0 1 5 5 10 25
6
11-129
0 0 0 5 5 8 8 8
7
11-140
0 5 5 5 5 10 10 20
8
solara
0 5 5 10 10 15 20 40
9
KT3
0 3 3 5 10 15 23 50
Chương 3: Kết quả và thảo luận
3.2. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống khoai tây được trồng tại Sa Pa –
Lào Cai
Bảng 2
Việt Nam code
Số củ
/khóm
Năng suất củ
(tấn/ha)
Tỉ lệ cỡ củ (%)
>50mm 30-50mm <30mm
11-106 2,7 6,50 11 85 4
11-113 3,9 10,25 15 78 7
11-115 4,7 13,50 17 78 5
11-116 4,5 9,50 34 50 16

11-119 2,9 5,50 18 64 18
11-129 3,9 14,00 9 86 5
11-140 3,1 8,25 36 55 9
Solara 6,5 16,00 16 78 6
KT3 4,8 18,00 56 38 6
3.3
. Kết quả đánh giá mức độ nhiễm bệnh của khoai tây ngoài đồng ruộng tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển cây có Củ -
Viện Cây Lương thực và Cây Thực phẩm, Thanh Trì- Hà Nội (ngày trồng 30/10/2013, ngày thu hoạch 20/1/2014)
Bảng 3
TT
Giống
30 ngày sau mọc 45 ngày sau mọc
60 ngày sau mọc
Virus (%)
Héo
xanh (%)
Đốm lá (1-9)
Mốc sương
(1-9)
Virus (%)
Héo
xanh (%)
Đốm lá (1-9)
Mốc sương (1-9)
Virus (%)
Héo
xanh (%)
Đốm lá (1-9)
Mốc sương (1-
9)

1 11-129 33,3
0 1 1
33,3
0 1 3
33,3
0 3 3
2 11-113 3,3
0 1 1
3,3
0 1 3
3,3
0 5 3
3 11-116 26,7
0 1 1
26,7
0 1 3
26,7
0 3 3
4 11-106 1,7
0 1 1
1,7
0 1 3
1,7
0 5 3
5 11-140 35,0
0 1 1
36,0
0 1 3
35,0
0 5 3

6 11-115 45,0
0 1 1
45,0
0 1 3
45,0
0 3 3
7 Solara 5,7
0 1 1
1,7
0 1 3
1,7
0 3 3
8 KT3 5,0
0 1 1
5,0
0 1 3
5,0
0 3 3
3.4. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống khoai tây ngoài đồng ruộng tại Thanh Trì- Hà
Nội, năm 2013 .
Bảng 4
TT Giống
Số củ/
khóm
Năng suất
(tấn/ha)
Tỉ lệ cỡ củ ( %)
>5 cm 3-5 cm <3 cm
1 11-129 7,2 15,83 11,0 54,8 34,2
2 11-113 4,9 9,00 8,4 47,4 44,2

3 11-116 5,0 19,42 30,3 52,6 17,1
4 11-106 6,4 15,71 13,5 58,4 28,1
5 11-140 12,6 26,25 13,1 63,4 23,5
6 11-115 9,4 14,67 9,8 60,7 29,5
7 Solara (đ/c) 11,5 21,08 10,1 57,6 32,3
3.5. Kết quả nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bệnh mốc sương của các
giống khoai tây
Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
Hình 2
Bước tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA thu được
sau khi tách bằng phương pháp quang phổ kế.
Bảng 5
STT Tên mẫu Nồng độ (ng/µl) Chỉ số độ tinh sạch A260/A280
1
11-106 908,7 1,90
2
11-113 1096,1 1,92
3
11-115 1269,6 1,92
4
11-116 849,5 1,91
5
11-119 731,7 1,88
6
11-129 1114,8 1,92
7
11-140 782,0 1,80
8
Solara 699,1 1,85
9

KT3 977,1 1,90
3.6. Nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử liên kết locus gen kháng bệnh mốc sương
Để xác định chỉ thị phân tử liên kết locus gen R1 kháng bệnh mốc sương trong thí nghiệm này, chúng tôi đã chọn
lọc những cặp mồi SNP từ kết quả nghiên cứu công bố trên tạp chí quốc tế và các bản đồ liên kết gen cây khoai tây đã
công bố để xác định giống mang gen kháng bệnh mốc sương R1.
Kết quả chúng tôi đã xác định và sử dụng chỉ thị phân tử SNP, gồm có chỉ thị LP2 và chỉ thị LP3 đây là những
chỉ thị phân tử thiết kế đặc hiệu dựa trên trên trình tự các Nucleotic của gen kháng bệnh mốc sương.
3.7. Kết quả xác định gen kháng bệnh mốc sương R1 trên 9 giống khoai tây bằng chỉ thị phân tử LP2
Ký hiệu
1: Giống 11-47; 2: Giống 11-106; 3: Giống 11-113; 4: Giống 11-115; 5: Giống 11-116; 6: Giống 11-119; 7: Giống 11-
124; 8: Giống 11-129; 9: Giống 11-140; 10: Giống Solara; 11: Giống KT3.
Kết quả đánh giá phân tích di truyền tính kháng bệnh mốc sương
Bảng 6
Dòng/giống Chỉ thị phân tử
LP2
Chỉ thị phân tử
LP3
11-106 + +
11-113 - -
11-115 + -
11-116 + +
11-119 - +
11-129 + -
11-140 + -
Solara - -
KT3 - -
KẾT LUẬN
Sau khi kết thúc nghiên cứu đề tài đã đánh giá được các đặc điểm nông sinh học, khả
năng kháng bênh mốc sương của giống khoai tây tham gia thí nghiệm được trồng trong nhà
lưới tại Trung tâm nghiên cứu cây có củ tại Sa Pa – Lào Cai và khi được trồng với điều kiện ở

ngoài đồng ruộng tại Thanh Trì – Hà Nội. Chúng tôi đã thu được kết quả:
Có 4 giống khoai tây chịu bệnh mốc sương tốt có thể sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho
chọn tạo giống là : giống 11-113, giống 11-116, giống 11-106 và giống 11-129.