ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
www.hsph.edu.vn
ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. coli
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
www.hsph.edu.vn
MỤC TIÊU
• Trình bày được nguyên lý của phương
pháp MPN (Most Probable Number)
• Trình bày được phạm vi áp dụng của thử
nghiệm
• Nêu và thực hiện được các bước của qui
trình định lượng Coliforms và E. coli bằng
phương pháp MPN
www.hsph.edu.vn
PHƯƠNG PHÁP MPN
(Phương pháp số có xác suất
cao nhất)
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN
• Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số
lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện
diện trong một thể tích mẫu
• Được thực hiện dựa trên nguyên tắc xác
suất thống kê sự phân bố VSV trong các
độ pha loãng khác nhau của mẫu
• Thông thường các độ pha loãng được
chọn liên tiếp nhau
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
• Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại nhiều
lần (3 lần hoặc 5 lần)

• Kết quả thống kê tính trên số lần dương
tính của mỗi độ pha
• Định lượng được mật độ vi sinh vật thấp
trong một thể tích mẫu lớn
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
B1: Chuẩn bị các ống
nghiệm có chứa môi
trường thích hợp cho
sự tăng trưởng của
đối tượng VSV cần
định lượng
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
B2: Cấy một thể tích
chính xác dung dịch
mẫu ở 3 nồng độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp
B3: Ủ mẫu đã cấy ở
nhệt độ thích hợp
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
B4: Ghi nhận sự phát
triển của vi sinh vật
trong MT
B5: ghi nhận số ống
dương tính
3

www.hsph.edu.vn
Lựa chọn các độ pha loãng
Thứ tự ưu tiên chọn từ 1→4
1.Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống (+) →
chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính, ví dụ1; nếu có
nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này
không có ống (+) → chọn nồng độ lớn nhất
không có ống (+) và 2 nồng độ lớn hơn để tính,
ví dụ 4, 5
2.Nếu các nồng độ nhỏ hơn nồng độ lớn nhất có
tất cả các ống (+) → chọn 3 nồng độ mẫu nhỏ
nhất trong cả dãy. Ví dụ 2
3.Chọn 3 nồng độ thấp nhất trong cả dãy, trong
đó có ít nhất 1 ống (+). Ví dụ 3
4.Chỉ nồng độ đầu tiên có ống (+) chọn thêm 2
nồng độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi
2 nồng độ này không có ống (+) nào, ví dụ 6, 7
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
B6: Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV
3
KẾT QUẢ
www.hsph.edu.vn
Phương pháp MPN (tt)
Kết quả:
• Số VSV (MPN/g) = kết quả tra bảng x
(f/10)
• f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10
n
)

www.hsph.edu.vn
MPN calculator software
www.hsph.edu.vn
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG
COLIFORMS/E. coli GIẢ ĐỊNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN
www.hsph.edu.vn
Coliforms
• Trực khuẩn gram âm
• Không sinh bào tử
• Hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý,
• Có khả năng lên men lactose sinh acid
và sinh hơi ở 37
0
C trong 24 – 48 giờ
www.hsph.edu.vn
Coliforms (tt)
• Gồm 4 giống:
E. coli
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
• Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật
chỉ thị vệ sinh, trong đó có vệ sinh ATTP
www.hsph.edu.vn
Coliforms (tt)
• Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có
khả năng lên men lactose sinh hơi trong
khoảng 24h khi ủ ở 44
0

C trong môi trường
canh EC
• Coliform phân: Coliforms chịu nhiệt có khả
năng sinh indole khi ủ khoảng 24h ở 44
0
C
trong canh Trypton
• E. coli là một Coliforms phân
www.hsph.edu.vn
Phạm vi áp dụng
• Thực phẩm, thức ăn chăn nuôi
• Các mẫu môi trường khu vực sản xuất và
xử lý thực phẩm
www.hsph.edu.vn
Nguyên lý của phương pháp
• Coliforms: Định lượng vi sinh vật lên men
lactose sinh khí khi nuôi cấy trong môi
trường tăng sinh chọn lọc ở 30
o
C, 37
o
C và
phù hợp trong phép thử khẳng định.
• E. coli: là nhóm coliforms phân, được xác
định dựa trên khả năng lên men lactose
sinh khí và tạo thành Indol từ Tryptophan
khi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh
chọn lọc ở 44
o
C

www.hsph.edu.vn
TIẾN HÀNH
www.hsph.edu.vn
Chuẩn bị môi trường
• Canh thang LTS
• Canh thang
Brilient green
• Canh thang EC
• Canh thang
Trypyon
www.hsph.edu.vn
Dụng cụ thí nghiệm
• Bình tam giác
• Ống nghiệm
• Pipet
• Đầu côn
• Que cấy
• Đèn cồn
• Găng tay, khẩu trang
www.hsph.edu.vn
Chủng chuẩn
• Chứng âm: Salmonella typhimurium ATCC
14028
• Chứng dương: Escherichia coli ATCC
25922
Các chủng phải ở trạng thái hoạt hoá
www.hsph.edu.vn
Coliforms and E. coli
Bước 1: Đồng nhất mẫu
• Cân 10 g/10ml mẫu

• Đồng nhất mẫu trong 90 ml dd NMSL
trong bình tam giác → nồng độ 10
-1
www.hsph.edu.vn
Coliforms and E. coli
Bước 2: Pha loãng mẫu
• Hút 1ml mẫu đã đồng nhất ở trên
• Pha loãng mẫu trong 9ml dd NMSL trong
ống nghiệm → nồng độ 10
-2
• Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ
10
-3
và 10
-4
…