Nghiên cứu định lượng đồng thời amoxicilin và cloxacilin trong viên nang lamlox bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
:|cỉỊc:|c:l;4e4cỉ|c4e:|c:|c
LƯU THỊ GẤM
NGHIÊN CỨU DỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI AMOXICILIN
^ VÀ CLOXACÌLIN TRONG VIÊN NANG LAMLOX
BẰNG PHƯDNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NANG CAO
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001-2006)
GIÁO VIÊN HƯÓNG DẪN : THỖ. NGUYỄN THANH PHƯƠNG
THÔ. NGUYỄN TDUNG HẾU
NƠI THỰC HIỆN : PHÒNG PHÂN TÍCH n -
TDUNG TÂM KIỂM NGHIỆM DP, MP HÀ NỘI
THÒI GIAN THỰC HIỆN ; 1/2006 - 5/2006
HÀ NỘI - 2006
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới T h .s Nguyễn Thanh
Phương và T h .s Nguyễn Trung Hiếu đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện
thành công đề tài này.
Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình
của các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Phân tích II - Trung tâm Kiểm
nghiệm Dược phẩm Mỹ phẩm Hà Nội - nơi em thực hiện đề tài, cũng như
các thầy cô thuộc bộ m ôn H oá phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quỹ báu đó.
Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy cô giáo
các bộ môn đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời
gian học tập vừa qua.
Em xin tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè - nhữhg người luôn động sát
cánh bên em trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, tháng 05 năm 2006
SV: Lưu Thi Gấm

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ể 1
PHẨN I- TỔNG Q UA N 3
1.1- Amoxicilin 3
1.1.1- Đại cương 3
1.1.2- Các phương pháp định lượng 4
1.2- Cloxacilin 6
1.2.1- Đại cương 6
1.2.2- Các phương pháp định lượng 7
1.3- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8
1.3.1- Khái niệm 8
1.3.2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cộ t
9
1.3.3- Pha tĩnh, pha động và detector trong HPLC 9
1.3.4- Hệ thống HPLC 11
1.3.5- Các thông số dặc trưng của quá trình sắc ký 12
1.3.6- Các cách đánh giá pic 15
1.3.7. Các cách tính kết quả 15
PHẦN II- THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QU Ả 17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17
2.1.2. Thiết bị và hoá chất 17
a. Hoá chất 17
b. Thiết bị - dụng cụ 17
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 18
a. Nội dung 18
b. Phương pháp nghiên cứu 18
2.1.4- Các đặc trưng thống kê để sử lý kết quả phân tích 18
2.1.5- Các cách tính kết q uả 19

2.3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
21
2.3.1- Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời
Amoxicillin và Cloxacillin bằng phương pháp HPLC 21
a. Lựa chọn pha động 21
b. Lựa chọn tốc độ dòng 23
c. Lựa chọn bước sóng để phát hiện hai chất 23
2.3.2- Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng 25
a. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý 25
b. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 26
c. Khảo sát độ lặp lại của phương p h á p 29
d. Khảo sát độ đúng của phương pháp 31
e. Khảo sát, đánh giá độ ổn định của chế phẩm với phương pháp sắc ký đã
chọn 35
2.3.3- ứng dụng định lượng chế phẩm Lamlox 37
2.3.4- Bàn luận về kết quả 39
PHẦN III - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 41
3.1- Kết luận 41
3.2- Đề xuất 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AM:
B.P;
CL:
DD:
E.P;
J.P:
HPLC:
P.C:
RP:

S.HPLC.M.D:
SK:
TB:
U.S.P:
Amoxicilin.
British Pharmacopoeia
Cloxacilin.
Dung dịch.
European Pharmacopoeia Fourth Edition (2002).
The Japanese Pharmacopoeia.
High Performance Liquid Chromatography.
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao).
Pharmacopoeia of the people’s republic of China (2000).
Reversed phage
Quanyun A. Xu, Lawrence A. Trissel, Stability Indicating
HPLC Methods for Drug Analysis.
Sắc ký.
Trung bình.
The United Stater Pharmacopoeia
ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay cùng với sự gia tăng, biến đổi không ngừng của các chủng vi
khuẩn gây bệnh, nên nhóm thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một nhóm
thuốc quan trọng.
Bên cạnh đó, việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn ngày càng gặp nhiều khó
khăn. Một nguyên nhân quan trọng gây nên tình trạng đó là sự kháng thuốc tự
nhiên của các chủng vi khuẩn gây bệnh. Ví dụ điển hình ở nhóm beta lactam
là sự sinh men penicilinase của một số chủng vi khuẩn đã làm mất hiệu lực
của một số kháng sinh [2]. Mặt khác, với mỗi bệnh nhiễm khuẩn thường
không chỉ do một chủng vi khuẩn, cho nên việc sử dụng kháng sinh đơn thành
phần nhiều khi không đạt hiệu quả điều trị. Mặc dù việc phối hợp các thuốc

kháng sinh đơn thành phần trong một phác đồ điều trị đã thu được kết quả
nhất định. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự phối hợp này không được
khuyến khích do có thể gặp một số tương tác bất lợi [l]. Vì vậy, việc phối
hợp hai hay nhiều kháng sinh trong cùng một chế phẩm không những nới rộng
phổ, tăng hiệu quả điều trị, giảm tỷ lệ kháng thuốc mà cơ bản giúp thuận tiện
trong điểu trị [1], [2 ].
Trong những năm gần đây, ngành công nghệ bào chế đã nghiên cứu và cho
ra đời nhiều chế phẩm thuốc đa thành phần. Chế phẩm viên nang Lamlox do
công ty LYKA LABS LIMITED sản xuất là sự kết hợp của hai kháng sinh
nhóm penicilin: Amoxicilin trihydrat (tương đương với 250mg amoxicilin) và
cloxacilin natri (tương đương với 250mg cloxacilin).
Lamlox được chỉ định trong các trường hợp: Nhiễm trùng đường hô hấp do
vi khuẩn nhạy cảm; các loại nhiễm khuẩn da, mô mềm; nhiễm khuẩn huyết do
Staphylococcus, nhiễm khuẩn tiết niệu .[8 ], [12].
Trong quá trình lưu hành, một trong những khó khăn gặp phải là vấn đề
kiểm nghiệm chất lượng thuốc. Trong khi các Dược điển hiện hành [6 ], [18],
[22], [23], [25], [26] chỉ có chuyên luận kiểm nghiệm cho các chế phẩm đơn
thành phần chứa amoxicilin và cloxacilin. Bên cạnh đó, việc xác định hàm
lượng từng thành phần theo tiêu chuẩn cơ sở đôi khi khó thực hiện. Mặt khác,
nếu sử dụng phương pháp HPLC định lượng riêng từng thành phần theo một
số dược điển [18], [22], [23], [25], [26] thì tốn nhiều hoá chất, thời gian. Vì
vậy, để đảm bảo chất lượng cho mỗi lô sản phẩm cũng như tiết kiệm thòi gian,
chi phí cần phải có một phương pháp thích hợp để định lượng đồng thời hai
hoạt chất này trong cùng một chế phẩm.
Qua quá trình nghiên cứu thử nghiệm, chúng tôi quyết định lựa chọn
phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Với ưu điểm về độ nhanh,
độ nhạy, độ chính xác cao và dễ dàng triển khai tại các cơ sở kiểm nghiệm có
trang bị máy HPLC, đặc biệt trong việc định lượng chế phẩm đa thành phần,
[4], [5], [9], [11], [12], [14]. Do vậy phương pháp HPLC đang được sử dụng
rộng rãi trong kiểm nghiệm dược phẩm.

Vì vậy, chúng tồi đã tiến hành khoá luận ''Nghiên cứu định lượng đồng
thời amoxicilin và cloxacilin trong viên nang Lamlox bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao” vói các mục tiêu:
> Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời amoxicilin và
cloxacilin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
> ứng dụng phương pháp đã nghiên cứu để định lượng đồng thời hỗn
hợp hai chất này trong chế phẩm viên nang Lamỉox.
PHẦN I - TỔNG QUAN
1.1. AMOXICILIN:
1.1.1. Đại cương:
• Công thức: [6].
H H H
HO
CigHi^N.OsS. 3H2O
p.t.l; 419,4
Tên khoa học: Acid (6R)-6-(a-D-4-hydroxyphenylglycylamino) penicilanic
trihydrat, phải chứa từ 95,0 đến 100,5% CJ6H19N3O5S, tính theo chế phẩm
khan.
• Tính chất: Amoxicilin là một chất phân cực có bản chất acid [2], [6 ].
- Thể chất: Amoxicilin ở dạng bột kết tinh trắng hay gần như trắng.
- Độ tan : ít tan trong nước (4mg/ml), trong ethanol. Không tan trong
chloroform, ether. Tan tốt trong các dung dịch acid loãng và kiềm loãng.
- pH = 3,5 - 5,5
- Góc quay cực riêng: = +290 ^ +315
- Khả năng hấp thụ quang học: Do phân tử có các dây nối đôi liên hợp
trong vòng benzen nên phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại.
• Tác dụng dược lý: [2], [3], [7].
Amoxicilin là kháng sinh nhóm penicilin có hoạt phổ rộng:
> Với vi khuẩn Gr(+): Tác dụng kém penicilin và cũng bị mất hoạt tính
bởi men beta lactamase. Amoxicilin chủ yếu tác dụng trên các tụ cầu

{Staphylococcus), trừ các tụ cầu tiết beta lactamase, các liên cầu
(Steptococcus), phế cầu (Pneumococcus), trực khuẩn
> Với vi khuẩn Gr(-): Amoxicilin tác dụng tốt trên các chủng vi khuẩn
hiếu khí Gr(-) như: Escherichia coli, Enterococi, Salmonella, Shigella
• Chỉ định: [2], [3], [7],
> Điều trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp trên do các vi khuẩn nhạy cảm:
Viêm xoang, viêm tai giữa, viêm phế quản cấp và mạn tính
> Các nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng do E.coli, Enterobacter
> Các nhiễm khuẩn khác: Nhiễm khuẩn tiêu hoá, nhiễm khuẩn huyết
1.1.2. Các phương pháp định lượng amoxicilin:
• Định lượng bằng phương pháp đo thế: [3], [6 ],
- Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của amoxicilin được tính bằng cách
lấy hàm lượng phần trăm của penicilin toàn phần trừ đi hàm lượng phần trăm
của sản phẩm phân huỷ.
Penicilin toàn phần: Hoà tan chế phẩm trong dung dịch đệm boric pH 9,0
và anhydride acetic, sau đó thuỷ phân bằng kiềm và trung hoà dung dịch.
Chuẩn độ bằng thuỷ ngân (II) nitrat 0,02M, tiến hành trong đệm acetate pH
4,6. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế.
Sản phẩm phân huỷ: Hoà tan chế phẩm trong dung dịch đệm boric pH 9,0
và anhydride acetic. Chuẩn độ bằng thuỷ ngân (II) nitrat 0,02M, tiến hành
trong đệm acetate pH 4,6. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế.
Điện cưc so sánh: Điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) sulíat.
Điện cực chỉ thị: Điện cực platin (hoặc điện cực thuỷ ngân).
• Phương pháp đo iod (định lượng viên nang, viên nén amoxicilin): [6 ]
- Nguyên tắc: Sau khi thuỷ phân amoxicilin bằng kiềm, sản phẩm phân huỷ
của amoxicilin tác dụng với iod. Định lượng iod dư bằng natri thiosulíat
0,0IN, chỉ thị hồ tinh bột cho vào thời điểm gần kết thúc định lượng. Tiến
hành song song với mẫu trắng. Kết quả tính theo phương pháp thừa trừ.
• Phương pháp đo quang phổ tử ngoại: [16]
- Nguyên tắc; Dựa trên cơ sở định luật Lambert-beer (Độ hấp thụ tỷ lệ với

nồng độ chất phân tích).
Định lượng trực tiếp amoxicilin: Amoxicilin sau khi được pha loãng
trong dung môi, được đo ở bước sóng Ằ = 325nm. Tiến hành song song với
mẫu chuẩn.
• Phươngpháp HPLC: [3], [18], [22], [24], [25], [26].
- Nguyên tắc: Dung dịch chế phẩm amoxiciỉin đưa qua van bơm mẫu và
pha động kéo qua cột phân tách nhờ một bơm cao áp. Tại cột, xảy ra quá trình
tách amoxicilin khỏi các thành phần khác nhờ sự tương tác giữa pha tĩnh và
pha động, sau đó được chuyển đến detertor và cho tín hiệu định lượng là diện
tích hoặc chiều cao pic. Tiến hành song song với mẫu chuẩn.
Bảng 1.1-Một số phương pháp HPLC định lượng amoxicilin:
Tài liệu
trích
dẫn
Điều kiện sác ký
Pha tĩnh
(Cột SK)
Pha động
Detector
(A)
Tốc độ
dòng
Thể tích
tiêm
JP XIV
30cmx 4mm,
lO^im (C,,)
MeOH: DD
NaCH.COO 0,0 IM
(5:95)

254nm
l,5ml/
phút
lOịil
U.S.P28
25cm x4mm,
3-10^m(Ll)
Acetonitril: DD
KH2PO4 45% w/w
(4:96)
230nm
l,5ml/
phút
lOịil
E.p
25cmx4,6mm
5fxm (C,ịị)
Acetonitril: DD
KH2PO4 0,05M
pH 5,0 (1:99)
254nm
l,Oml/
phút
50^1
B.p
2005
25cmx4,6mm
5ịim (C|x)
Acetonitril: DD
KH2PO4 0,05M

pH 5,0 (1:99)
254nm
l,Oml/
phút
50 ^il
p.c
25cmx4,6mm
5ịim (Ciịị)
Acetonitril: DD
KH2PO4 45% kl/kl
(4:96)
254nm
l,Oml/
phút
20^11
s. HPLC
M.D
lOOcm x2mm,
5 Ị4.m
MeOH : DD đệm
phosphat 0,05M
pH7,0 (3:97)
230nm
0,4ml/
phút
2 0 (il
1.2. CLOXACILIN:
1.2.1. Đại cương:
• Công thức: [6 ].
p.t.i: 475,9

Tên khoa học: Natri (6 R) - 6 - 3 - (2- clorophenyl) - 5- methylisoxazol- 4
- carboxamido) penicilat monohydrat. Phải chứa từ 95,0 đến 101,0%
C|9Hi7ClN3Na0 5 S theo chế phẩm khan.
• Tính chất: [2], [6 ]
- Thể chất: Bột kết tinh trắng, hoặc gần trắng,có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm.
- Độ tan; Dễ tan trong nước, methanol. Tan trong ethnol. Không tan trong
ethylacetat
- pH = 5,0 - 7,0
- Góc quay cực riêng; ttp = +160 +169
- Khả năng hấp thụ quang học: Do phân tử có các dây nối đôi liên hợp
trong vòng benzen nên phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại.
• Tác dụng dược lý: [2], [7].
Cloxacilin là kháng sinh diệt khuẩn, ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn
như benzyl penicilin nhưng kháng penicilinase của Staphylococcus. Vì vậy
thuốc có hoạt tính chống Staphylococcus sinh hoặc không sinh penicilinase .
(cloxacilin không có hoạt tính với Staphylococcus aureus kháng methicilin do
vi khuẩn này có những protein gắn penicilin biến đổi). Hoạt tính với
Stretococcus pyogenes, s. pneumoniae thấp hơn benzyl penicilin. Cloxacilin
không có hiệu lực với Enterococcus.
• Chỉđịnh: [2], [3], [7],
- Dạng tiêm: Điều trị nhiễm khuẩn nặng do Staphtlococcus sinh
penicilinase như; Nhiễm khuẩn xương khớp, viêm nội tâm mạc, viêm phúc
mạc, viêm phổi, nhiễm khuẩn da-mô mềm, nhiễm khuẩn phẫu thuật
- Dạng uống: Không dùng để điều trị nhiễm khuẩn nặng, thường dùng
điều trị tiếp sau khi đã diều trị bằng tiêm.
1.2.2. Các phương pháp định lượng:
• Phương pháp chuẩn độ đo thê: [6 ], [23].
- Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của cloxacilin được tính bằng cách lấy
hàm lượng phần trăm của penicilin toàn phần trừ đi hàm lượng phần trăm của
sản phẩm phân huỷ.

Penicilin toàn phần; Hoà tan chế phẩm trong nước, sau đó thuỷ phân bằng
kiềm và trung hoà dung dịch. Chuẩn độ bằng dung dịch thuỷ ngân (II) nitrat
0,02M, tiến hành trong đệm acetat pH 4,6. Xác định điểm kết thúc bằng
phương pháp đo thế.
Sản phẩm phân huỷ: Hoà tan chế phẩm trong nước và dung dịch đệm
acetate pH 4,6. Chuẩn độ bằng dung dịch thuỷ ngân (II) nitrat 0,02M. Xác
định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế
Điện cực chỉ thị: Điện cực thuỷ ngân, hoặc điện cực Platin.
Điện cực so sánh: Điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) Sulfat.
• Phương pháp định lượng bằng vi sinh vật: [25]
- Nguyên tắc; Hàm lượng cloxacilin được tính dựa vào tính chất; Đường
kính vòng vô khuẩn của mẫu thử và mẫu chuẩn tỷ lệ thuận với lượng
cloxacilin tương ứng có trong mẫu.
- Chủng chỉ thị: Bacillus subtilis ATCC 6633
• Phương pháp đo quang (Dùng để định lượng nang cloxacilin): [6], [16]
- Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở của định luật Lambert-beer. Cloxacilin được
định lượng gián tiếp qua việc tạo phức với imidazol thuỷ ngân. Sau đó đo độ
hấp thụ của phức tạo thành Ở Ằ - 346nm . Tiến hành song song với mẫu trắng
của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
• Phương pháp HPLC: [18], [22], [24], [26]
- Nguyên tắc: Dung dịch cloxacilin đưa qua van bơm mẫu và pha động kéo
qua cột phân tách nhờ một bơm cao áp. Tại cột, xảy ra quá trình tách
cloxacilin khỏi các thành phần khác nhờ tương tác giữa pha tĩnh và pha động.
Sau đó được chuyển đến detertor và cho tín hiệu định lượng là diện tích hoặc
chiều cao pic. Tiến hành song song với mẫu chuẩn.
Bảng 1.2- Một sô phương pháp HPLC định lượng cloxacilin:
Tài liệu
trích
dẫn
Điều kiện sắc ký

Pha tĩnh
(Cột SK)
Pha động
Detector
(A)
Tốc độ
dòng
Thể tích
tiêm
u.s.p 28
25cm X 4mm,
3-10|im (Ll)
Acetonitril: DD
KH2PO4 0,02M
pH 6,8 (20:80)
225nm
l,Oml/
phút
2 0 |al
E.p
25cm X 4mm,
5ịim (C J
Acetonitril: DD
KH2PO4 2,7 g/ì
pH5,0 (25:75)
225nm
l,Oml/
phút
2 0 ^ 1
B.p

2 0 0 1
25cm X 4mm
5ịim (C|ịị)
Acetonitril : DD
KH2PO4 0,05M
pH=5,0 (1:99)
225nm
l,Oml/
phút
2 0
s. HPLC
M.D
RP CijỊ (25 cm
x4,2mni, 5|im)
Acetonitril : DD
H,PƠ4 0,05M
(35:75)
230nm
2 ,0 ml/
phút
20^1
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO (High
Performance Liquid Chromatography-HPLC) [4], [5], [12], [15], [17], [17],
[19], [20], [27]
1.3.1. Khái niệm:
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần
của hỗn hợp dựa trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc nhưng
không hoà lẫn vào nhau: Một pha động, một pha tĩnh.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) còn gọi là phương pháp
sắc ký lỏng cao áp, dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh

chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động (dung môi rửa giải) dưới áp
suất cao.
1.3.2. Nguyên tắc của quá trình sác ký trong cột;
Khi tiêm mẫu cần phân tích gồm hỗn hợp các chất (A+B+C) vào cột, quá
trình rửa giải các chất lần lượt được thực hiện. Kết quả là các chất được tách
ra khỏi hỗn hợp khi đi qua cột.Thời gian lưu giữ của từng chất phụ thuộc vào
> Tương tác giữa chất tan với pha tĩnh (Fi).
> Tương tác giữa chất tan với pha động (F2).
> Tương tác giữa pha tĩnh với pha động (p,).
Tổng hợp ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước khi
lực lun giữ của nó là nhỏ nhất và ngược lại. Trong đó Fi, p2 là yếu tố quyết
định, còn p3 ảnh hưởng không nhiều. Fị, p2 khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất
của pha tĩnh, của chất cần phân tích, cũng như bản chất, thành phần, tốc độ
của pha động. Kết quả của hiệu lực lưu giữ là khác nhau đối với từng chất
1.3.3. Pha tĩnh, pha động và detector trong HPLC.
<♦ Pha tình trong HPLC (Statỉonnenary phase) : Là chất nhồi cột làm nhiệm
vụ tách sắc ký chất cần phân tích. Nó có thể là một chất rắn đã được phân chia
dưới dạng tiểu phân hoặc là một chất lỏng được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là một chất mang rắn đã được biến đổi bằng các liên kết hoá
học với các nhóm hữu cơ khác nhau.
❖ Pha động trong HPLC (Mobile phage) : Là dung môi rửa giải chất tan
(chất cần phân tích) ra khỏi cột để thực hiện quá trình sắc ký. Pha động có thể
là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi trộn lẫn theo tỷ lệ nhất định.
• Tương ứng với từng loại pha tĩnh (chất nhồi cột) và pha động ta có một kỹ
thuật sắc ký riêng:
- Sác ký hấp phu: Gồm sắc ký hấp phụ pha thuận, pha đảo. Trong kỹ thuật
sắc ký này, chất tan bị lưu giữ (hấp phụ) trên bề mặt pha tĩnh và bị dung môi
pha động đẩy ra (phản hấp phụ).
- Sắc ký trao đổi và tao căp ion: Cơ chế chính xảy ra trong cột tách là sự
trao đổi giữa ion trong hỗn hợp phân tích và các ion trao đổi của pha tĩnh.

- Sắc ký phân bố: Bản chất của sự tách là quá trình phân bố động trong
dòng chảy của chất phân tích giữa hai pha. Gồm có sắc ký phân bố pha đảo và
sắc ký phân bố pha thuận.
- Sác ký rây phân từ: Cơ chế tách dựa theo kích thước của phân tử chất
phân tích được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh. Các phân
tử có kích thước nhỏ sẽ chui sâu vào trong nên thời gian lưu giữ lâu hơn.
❖ Detector:
Trong kỹ thuật phân tích HPLC, các chất được tách ra với thời gian lun
khác nhau và được pháp hiện nhờ bộ phân detector. Việc phát hiện mang tích
chất định lượng các chất tuân theo điều kiện tuyến tính trong một vùng nồng
độ nhất định của chất phân tích, thông qua biểu thức liên hệ : A = k.c
Trong đó: A: Tín hiệu đo của chất
k: Hằng số thực nghiêm.
C: Nồng độ chất cần phân tích.
ứng với các tín hiệu đo A ta có các loại detector sau:
- Detector phổ hấp thụ quang phân tử u v hay UV-VIS
- Detector phổ huỳnh quang.
10
- Detector phổ phát xạ nguyên tử (ICP-ASE) hay hấp thụ nguyên tử (AAS).
- Detector điện hoá đo vòng và cực phổ.
- Detector đo điện thế.
- Detector đo độ dẫn điện, hay điện trở.
-Detector đo chiết xuất.
- Detector đo hiệu ứng nhiệt.
- Detector đo độ dẫn nhiệt
Hiện nay detector UV-VIS được dùng phổ biến hơn. Nguyên tắc của việc
phát hiện định lượng dựa trên cơ sở của định luật Lambert-beer. Detetor trong
HPLC khác với detector trong phương pháp đo quang: Chỉ dùng một bước
sóng đơn sắc và phát hiện từng đơn chất riêng biệt sau khi rửa giải, nên độ
chính xác cao hơn. Trong HPLC, với các chất có hàm lượng rất nhỏ, thì qua

quá trình rửa giải nó vẫn được detetor phát hiện và cho tín hiệu sắc đồ.
• Các đặc trưng của quá trình sắc kỷ: Pha tĩnh, pha động đều ảnh hưởng
đến kết quả của sự tách sắc ký;
- Độ phân giải của hai pic kề nhau.
- Thời gian lưu giữ của chất tan.
- Sự cân xứng pic.
- Độ rộng của pic sắc đồ
1.3.4. Hệ thống máy HPLC:
x>í*tííi
TSẼSTÌ
Ü
Waste
c ollector
ỂI©-w s aacsiia;:»
A .U to
M P IL C ; C
i aa Oní-eEt
Hình 1.1- Sơ đồ chung cho các máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện đại
11
1- Bình chứa dung môi gắn với bơm cao áp 2- Hệ thống xử lý mẫu tự động
3- Hệ tiêm mẫu 5- Bộ phận ghi sắc đồ
4- Detecter 6 - Máy vi tính
1.3.5- Các đại lượng đặc trưng;
<♦ Thời gian lưu (Retention time - tp): Là khoảng thời gian cần thiết để
một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu, qua cột sắc ký, tới khi xuất hiện đỉnh của
pic. Biểu thức tính thời gian lưu hiệu chỉnh: t’R = tR-t() (1.1)
Trong đó:
- 1(|: Là thòi gian chết (thời gian lưu của chất không bị lun giữ): nghĩa là tốc
độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của phân tử dung môi.
- t^: Là thời gian lưu của chất cần phân tích, ír càng lớn thì tốc độ di

chuyển của chất đó càng chậm.
- Là thời gian lưu hiệu chỉnh, hay thời gian luu thực của chất đó.
Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố: bản chất của pha tĩnh được nhồi trong
cột, bản chất, thành phần, tốc độ, pH của pha động.
Ý nghĩa của Íịị'. Với điều kiện sắc ký nhất định, tp đặc trưng và hằng định
cho mỗi chất, nên nó có ý nghĩa định tính. Nếu quá nhỏ (< 0,5 phút) thì khả
năng tách kém, nhiều tạp. Còn nếu Ir quá lớn (t^ > 20phút) thì pic doãng, độ
lặp lại kém, thời gian phân tích kéo dài do đó không phù hợp cho một qui
trình định lượng.
❖ Hê số phân bố (K): Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan
giữa pha động và pha tĩnh. Nếu ta cho pha động dừng lại để phân bô' đạt tới
c
trạng thái cân bằng ta có; K=—^ (1.2 )
Trong đó: Cg! Là nồng độc chất tan trong pha tĩnh ở thời điểm cân bằng.
Cị^: Là nồng độ chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
Ý nghĩa: K lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh, và ngược lại.
12
❖ Hê số dung lương (k’): Là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất
tan trong hai pha kết hợp với sức chứa của cột. Do đó k’ được tính như sau:
o V t -t„ V -V
k’= - ^ = K x - ^ = ^ - ^ = — ^ (1.3)
Qm to
Trong đó: Qs ,Qm là lượng chất tan có trong pha tĩnh, động.
Vs ,Vm là thể tích pha tĩnh, pha động.
Ý nghĩa: k’ không những phụ thuộc vào bản chất các pha, bản chất của
chất cần phân tích, vào nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của cột. Nếu
k’ quá nhỏ thì tp, cũng nhỏ và sự tách các píc kém, pic xuất hiện sófm và dễ lẫn
với pic của tạp. Nếu k’ quá lớn thì pic bị doãng, độ nhạy kém. Do đó, để phân
tích một hỗn hợp các chất thưòfng chọn điều kiện sắc ký sao cho k ’= 1-^8 .
<♦ Hê số chon loc (ạ ): Là tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất, khi hai chất có

k’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc:
_ í 'r .b
^ = ^ = (1.4)
^ B ^ R,A
Ý nghĩa: a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký (quy ước chất B bị
lưu giữ mạnh hơn chất A), vì vậy a >1. Để tách riêng hai chất ta thường chọn
các điều kiện sắc ký sao cho l,05<a<2,00.
Nếu a quá bé thì khả năng tách của hai chất khỏi nhau kém. Nếu a lớn thì
hai chất tách khỏi nhau tốt, song nếu a quá lớn thời gian phân tích kéo dài.
❖ Hê số bất đối AF: Là thông số để đánh giá tính thích hợp của phương pháp
sắc ký. Biểu thức tính AF; AF - — (1 .5 )
Trong đó: b; Là chiều rộng phía sau của pic đo ở 1/10 chiều cao pic.
a: Là chiều rộng phía trước của pic đo ở 1/10 chiều cao pic
Một chất nhồi cột tốt sẽ có AF trong khoảng 0,9 ^1,1.
❖ Số đĩa lý thuyết (N) và chiéu cao của đĩa (H):
13
Công thức tính: N = 16;
w
= 5,54x
w
(1.6)
N
(1.7)
Trong đó: W: Là chiều rộng đo ở đáy pic
Wi/2: Là chiều rộng đo ở 1/2 chiều cao của pic.
L: Là chiều cao của cột sắc ký.
Ý nghĩa: N, H phản ánh hiệu lực tách của cột. Cột có N càng lớn, H càng
nhỏ là cột có hiệu lực cao. Trong quá trình sử dụng, N phải được đánh giá lại.
*1* Đổ phân giải giữa hai pic liền ké nhau (Rc):
Là đại lượng biểu thị mức độ tách hai chất khỏi nhau trong cùng một điều

kiện sắc ký. Độ phân giải của hai chất liền kề nhau được tính theo công thức:
Rs=-
(1.8)
(Wb+wJ
Ý nghĩa: Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhiều.
Rs = 1,00 hai pic tách tương đối tốt, song vẫn còn xen phủ 4%.
Rs = 1,50 hai pic tách gần như hoàn toàn chỉ còn xen phủ 0,3%-
Các yếu tố ảnh hưởns tới R^: Xét cách khác để tính Rg.
Vn a - l k’e
Rs =
a
1 + k'
(1.9)
Để tăng Rs ta có thể thực hiện theo các cách sau:
• Tăng N: Dùng cột dài hơn, khi đó áp suất, thời gian và độ rộng cột cũng
tăng theo. Hoặc có thể giảm tốc độ dòng.Tuy nhiên việc tăng N ít có hiệu quả.
• Tăng k ’g. Thay đổi thành phần pha động, Rg rõ rệt. Nếu k’e đã quá lốfn
thì việc tăng k’g ít có hiệu quả vì khi đó pic doãng, giảm độ nhạy phân tích.
• Tăng a: Bằng cách thay đổi thành phần pha động, hoặc thay cột. Việc
tăng a ảnh hưỏỉng mạnh đến Rs, nên trong phân tích ta thường chọn cách này.
❖ Sư doãng pic: Là kết quả của sự di chyển nhanh chậm khác nhau của các
phân tử của cùng một chất khi đi qua cột sắc ký.
14
Sự doãng pic phụ thuộc vào nhiều quá trình nhiệt động học xảy ra trong cột:
- Sự khuếch tán của chất tan ngang và dọc theo dòng pha động.
- Tốc độ hữu hạn của sự thiết lập cân bằng phân bố chất tan vào hai pha.
- Sự khuyếch tán chất tan trong pha tĩnh.
- Sự không đồng nhất của các dòng chảy
1.3.6. Cách đánh giá pic; [4], [4], [9], [12], [19], [27],
<♦ Đánh giá diên tích pic:

Phương pháp này dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả các pic
bị trôi đường nền. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và điểm cuối của pic
được nhận ra chính xác. Việc đánh giá diện tích pic cho kết quả chính xác và
được áp dụng phổ biến trong định lượng với nồng độ chất phân tích thấp,
trung bình, hoặc cao.
❖ Đánh giá chiéu cao pic:
Điều kiện để áp dụng cho việc đánh giá bằng chiều cao pic là các chỉ số K’
hằng định. Với các pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì xác định chiều
cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn xác định diện tích pic.
1.3.7- Các kỹ thuật định lượng trong phương pháp HPLC: [4], [5], [9],
[12].
Nguyên tắc: Nồng độ của chất cần phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện
tích của chất đó. Dựa trên nguyên tắc này, ta có các kỹ thuật định lượng;
> Phươn2 vháv chuẩn nsoai: Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh
diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn và mẫu thử được phân tích trong
cùng điều kiện sắc ký. Chất chuẩn ngoại là chất phân tích tinh khiết đã biết
hàm lượng và đạt yêu cầu của chất chuẩn theo quy định.
- Chuẩn hoá một điểm (so sánh trực tiếp).
- Chuẩn hoá nhiều điểm (xác định khoảng tuyến tính).
> Phươỉi2 vháv chuẩn nôi:
15
Nguyên tắc: Là phương pháp thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng
chất chuẩn không đổi. Chất chuẩn thứ hai này được gọi là chất chuẩn nội và
thường có cấu trúc, tính chất gần giống chất cần phân tích.
Tương tự ta có phương pháp chuẩn hoá một điểm và chuẩn hoá nhiều điểm.
> Phươns pháp thêm chuẩn:
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề
ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ như các loại tá dược), hoặc khi xác định tỷ
lệ tìm lại (xác định độ đúng). Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác
định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và chuẩn

phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký.
> Phươfi2 pháp chuẩn hoá diên tích:
Nguyên tắc: Phần trăm hàm lượng chất phân tích được tính bằng cách xác
định phần trăm diện tích của chất đó so với tổng diện tích các pic, trừ pic dung
môi và các thành phần có đáp ứng dưới giới hạn phát hiện của chất đó.
16
PHẦN II - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1- NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM.
2.1.2- Đối tượng nghiên cứu:
• Viên nang Lamlox 500mg do công ty LYKA LABS LIMITED sản xuất
- VISA: VN-5537-01
- Mẫu M,: SKS: AL 158E - HD: 02/2008.
- Mẫu M2: SKS: AL 160E - HD: 12/2008.
- Công thức viên nang Lamlox:
Amoxicilin: 250mg
Cloxacilin: 250mg
Tá dược: vđ
2.1.2- Thiết bị và hoá chất
a. Hoá chất:
• Các chất chuẩn quốc gia:
- Amoxicilin trihydrat: Hàm lượng; 98,40%, độ ẩm: 13,20%
- Cloxacilin natri: Hàm lượng: 98,30%, độ ẩm: 4,37%
• Các hoá chất và dung môi khác:
- Kali dihydrophosphat (KH2PO4) loại tinh khiết phân tích
- Acetonitril, loại dùng cho máy HPLC.
- Dung dịch aicd phosphoric để điều chỉnh pH.
b. Thiết bị - dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU, với detector UV-VIS, cột
Lichrosorb RP18 (250 X 4,6mm, 5Ịxm).
- Bộ dụng cụ lọc nước Elga để chạy sắc ký.

- Máy lắc siêu âm Bransonic.
- Máy đo pH Metrohm
- Bộ lọc mẫu Satorious với màng lọc 0,45Ịim.
- Cân phân tích Metler chính xác ± 0,lmg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong
2.1.3- Phương pháp nghiên cứu
a. Nội dung:
> Khảo sát và xây dựng chương trình sắc ký định lượng đồng thời
amoxicilin và cloxacỉlin trong chế phẩm hỗn hợp:
- Lựa chọn cột sắc ký.
- Lựa chọn pha động.
- Lựa chọn bước sóng đo (detector ƯV-VIS).
- Lựa chọn tốc độ dòng.
- Lựa chọn thể tích tiêm mẫu.
> Đánh giá phương pháp:
- Xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Xác định khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích.
- Xác định độ lặp lại của phương pháp.
- Xác định độ đúng của phương pháp.
- Khảo sát độ ổn định của amoxicilin và aloxacilin trong dung môi pha
động bằng phương pháp HPLC
> ứng dụng phương pháp trên để định lượng chế phẩm Lamlox.
b. Phưong pháp nghiên cứu
- Bằng thực nghiệm kết hợp với tài liệu tham khảo tiến hành xây dựng qui
trình định lượng hỗn hợp amoxicilin và cloxacilin bằng phương pháp
HPLC.
- Thu thập số liệu và sử lý thống kê để đánh giá kết quả.
2.1.4- Các đại lượng thống kê để xử lý kết quả thực nghiệm:
- Giá tri trung bình: X =(21)
n ,^|

18
- Phương sai: s = ^

(2.2)
1=1
___________
n - 1
- Độ lệch chuẩn: s = y —

(2.3)
i(x,-xy
i = i
_________
n - ĩ
s
- Sai số chuẩn: s (x)= ự= (2.4)
t s
- Sai số tưcmg đối: s(%)= (2 .5 )
X
- Khoảng tin cậy: ỊI = X ± (2.6)
- Chuẩn Fisher: Ftn = ^ (2.7)
___
s
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%)==.100 (2.8)
X
- Chuẩn Student: t|,
- Độ lệch chuẩn chung: s, = (2.9)
• • ^ ^ ỵ N,+N^-2 ^N, ^ ^
- Sai số chung: £j = t|t.Sj (2.10)
2.1.5- Cách đánh giá kết quả

• Định tính:
Do thời gian lun đặc trưng cho từng chất, nên thời gian lưu của từng chất
trong mẫu thử phải giống với thời gian lưu của từng chất tương ứng trong mẫu
chuẩn trên sắc ký đồ thu được trong cùng điều kiện sắc ký ở phần định lượng.
• Định lượng
Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau:
- Tính hàm lượng (mg/viên) của từng chất theo công thức:
19
X(mg/viên) = (2.11)
- Tính hàm lượng phần trăm của từng chất trong chế phẩm theo công thức;
s. X xC(l-H)xn. X mxiooo
P(%) = , 1 0 0 (2.12)
X X h X
Trong đó:
s, ,s^. : Diện tích hoặc chiều cao của mẫu thử, mẫu chuẩn
m^.: Lượng chuẩn đã cân của từng chất (mg).
: Khối lượng trung bình của 20 viên (g).
m,: Khối lượng bột viên chất thử (g).
c : Hàm lượng phần trăm chuẩn tương ứng trên nhãn (%).
H : Hàm ẩm của chất chuẩn ghi trên nhãn (%).
iit: Độ pha loãng của dung dịch thử.
n^.: Độ pha loãng của dung dịch chuẩn.
h: Hàm lượng amoxicilin (cloxacilin) của chế phẩm Lamlox (mg).
20