Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



LƯƠNG THỊ PHẤN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG
HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯƠNG THỊ PHẤN
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG
HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS.Nguyễn Tiến Vững
2. TS.Nguyễn Thị Thuận

Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa Dược- Trường ĐH Dược Hà Nội
2. Khoa Y Dược, ĐHQGHN

HÀ NỘI – 2014


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững - Viện Pháp y Quốc gia, TS. Nguyễn Thị Thuận -
giảng viên bộ môn Hóa dược- Trường ĐH Dược Hà Nội và ThS. Vũ Đức Lợi-
khoa Y Dược, ĐHQGHN, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn hóa
dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Dược Trường Đại học Quốc gia
Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại trường.
Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều
kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cám ơn các thầy cô trường Đại học Dược
Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa
qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ,
động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lương Thị Phấn

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………
1

Chương 1. TỔNG QUAN…………………………………………
3

1.1. Hợp chất strychnin……………………………………………………… 3

1.1.1. Công thức cấu tạo………………………………………… 3

1.1.2. Tính chất……………………………………………………………… 3

1.1.3. Dược động học…………………………………………………………. 3

1.1.4. Tác dụng……………………………………………………………… 4

1.2. Hợp chất brucin……………………………………………………………

4

1.2.1. Công thức cấu tạo………………………………………… 4

1.2.2. Tính chất……………………………………………………………… 4

1.2.3. Dược động học…………………………………………………………. 4

1.2.4. Tác dụng……………………………………………………………… 5

1.3. Nguồn gốc của strychnin và brucin……………………………………… 5

1.3.1. Tên khoa học……………………………………………… 5

1.3.2. Thành phần hóa học……………………………………… 5



1.3.3. Công dụng của mã tiền…………………………………… 5

1.4. Phương pháp định lượng strychnin và brucin…………… 6

1.5. Phương pháp HPLC……………………………………………………….

9

1.5.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………………….

9

1.5.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký………………………………………. 10

1.5.3. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký…………………………. 10

1.5.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký…………………… 10

1.5.5. Ứng dụng của phương pháp HPLC……………………… 11

1.6. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương………………………………. 12

1.6.1. Tủa protein…………………………………………………………… 12

1.6.2. Chiết lỏng- lỏng…………………………………………… 12

1.6.3. Chiết pha rắn……………………………………………… 13

1.7. Thẩm định phương pháp định lượng……………………………………. 13

1.7.1. Tính thích hợp hệ thống……………………………………………… 13

1.7.2. Độ chọn lọc…………………………………………………………… 13

1.7.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính………………………………… 13

1.7.4. Giới hạn định lượng dưới…………………………………………… 14

1.7.5. Độ đúng…………………………………………………… 14

1.7.6. Độ chính xác…………………………………………………………… 14

1.7.7. Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 14

1.7.8. Độ ổn định…………………………………………………

14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị……………………………………………… 15

2.1.1. Nguyên vật liệu………………………………………………………… 15

2.1.2. Trang thiết bị , dụng cụ…………………………………… 15



2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. 15

2.2.1. Chuẩn bị các mẫu huyết tương……………………………………… 15

2.2.2. Xác định điều kiện sắc ký………………………………… 17

2.2.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương……………… 18

2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích…………………………………… 19

2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả……………………………………………. 22

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………

23

3.1. Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết

tương bằng HPLC…………………………………
23

3.1.1. Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp 23

3.1.2. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương……… 26

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích……………………………………… 28

3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống…………………………………………… 28

3.2.2. Độ đặc hiệu- chọn lọc………………………………………………… 29

3.2.3. Đường chuẩn- khoảng tuyến tính…………………………………… 31

3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……………………………………. 33

3.2.5. Độ đúng- độ chính xác trong ngày và khác ngày…………………… 34

3.2.6. Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 37

3.2.7. Độ ổn định của mẫu huyết tương………………………… 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………

42

1. Kết luận……………………………………………………………………… 42

2. Kiến nghị………………………………………………………………… 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………
43





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHƯ VIẾT TẮT
ACN

: Acetonitril

BR

: Brucin

ESI

: Ion hóa electrospray (Electrospray ionization).

GC/MS

: Sắc ký khí/ detector khối phổ (Gas Chromatography/Mass
Spectrometry).
HPLC

: Sắc ký lỏng hiệ
u năng cao (High Performance Liquid
Chromatography).

HPLC/DAD

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector diod array (High Performance
Liquid Chromatography/Diode Array Detection).
HPLC/MS

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector khối phổ (High Performance
Liquid Chromatography/Mass Spectrometry).
HPLC/UV

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector UV ((High Performance
Liquid Chromatography/Ultraviolet).
HQC

: Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High quality control).

HT

: Huyết tương
IS

: Chất chuẩn nội (Internal standard).
LC/MS

: Sắc ký lỏng/ detector khối phổ (Liquid Chromatography/Mass
Spectrometry).
LLOQ

: Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification).

LQC

: Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control).



MeOH

: Methanol

MQC

: Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Middle Quality Control).

QC

: Mẫu kiểm chứng (Quality Control).

r

: Hệ số tương quan.
RP-HPLC

: Ngược pha sắc ký lỏng hiệu năng cao (Reversed Phase- High
Performance Liquid Chromatography).
RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation).
SKĐ

: Sắc ký đồ

ST

: Strychnin

ULOQ

: Giới hạn định lượng trên (Upper Limit of Quantification).

UPLC

: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid
Chromatography).












DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên Bảng
Trang

Bảng 1.1.
Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin
6
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
28
Bảng 3.2a: Sự tương quan giữa nồng độ strychnin trong HT và tỷ lệ
đáp ứng pic strychnin/IS
31
Bảng 3.2b. Sự tương quan giữa nồng độ brucin trong HT và tỷ lệ đáp
ứng pic brucin/IS
32
Bảng 3.3a. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của strychnin
(LLOQ)
33
Bảng 3.3b. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của brucin
(LLOQ)
33
Bảng 3.4a: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của
Strychnin
34
Bảng 3.4b. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của
brucin
35
Bảng 3.5a: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày của
strychnin
36
Bảng 3.5b: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày của
brucin
36

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết IS (900ng/ml)
37
Bảng 3.7a: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ST
38
Bảng 3.7b: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết BR
39


Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ
đông-rã
39
Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu HT thời gian ngắn
40
Bảng 3.10: Kết quả ổn định mẫu huyết tương thời gian dài
41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị Trang
Hình 3.1: Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch ST và BR 1000 ng/ml
trong dung môi ACN:Đệm pH9 (38:62).
23
Hình 3.2: SKĐ với tỷ lệ pha động ACN: Đệm pH9 (38:62). 24
Hình 3.3: SKĐ dung dịch chuẩn nội ibuprofen trong pha động 25
Hình 3.4: SKĐ dug dịch chuẩn nội cloramphenicol trong pha động 25
Hình 3.5: SKĐ dung dịch chuẩn nội cafein trong pha động 25
Hình 3.6: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng MeOH 26
Hình 3.7: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng ACN 26
Hình 3.8: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng acid
percloric
27
Hình 3.9: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã được chiết lỏng- lỏng bằng
chloroform
27
Hình 3.10: SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã chiết lỏng –lỏng bằng
ethylacetat
27
Hình 3.11a: SKĐ mẫu HT trắng 29
Hình 3.11b: SKĐ mẫu HT có IS 29
Hình 3.11c: SKĐ mẫu HT có ST 30
Hình 3.11d: SKĐ mẫu HT có BR 30
Hình 3.11e: SKĐ mẫu HT có ST, BR và IS 30
Hình 3.12a: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ

ST trong HT và tỷ lệ diện tích pic ST/IS.
31
Hình 3.12b: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ
BR trong HT và tỷ lệ diện tích pic BR/IS.
32



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Mã tiền (Semen Strychni) là một vị thuốc quý được sử dụng từ lâu trong cả đông
y và tây y. Vị thuốc này cũng được đưa vào một số Dược điển của các nước như: Dược
điển Trung Quốc 1997, Dược điển Nhật 1996, Dược điển Anh 1980… Mã tiền được
chế từ hạt chín phơi hay sấy khô của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica).
Vị thuốc này đã được y học dân gian Trung Quốc sử dụng hiệu quả trong giảm
bớt tình trạng viêm, đau khớp, triệu chứng dị ứng và điều trị các bệnh thần kinh. Tuy
nhiên do độc tính của hạt rất cao nên không được phép sử dụng trực tiếp mà phải qua
chế biến. Alcaloid được biết đến là thành phần thể hiện hoạt tính sinh học của loài cây
này, trong đó strychnin và brucin là hai alcaloid có nhiều nhất trong hạt mã tiền và có
ảnh hưởng quan trọng đến tác dụng cũng như độc tính của hạt. Một mặt, Strychnin và
brucin có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống ung thư, nhưng bên cạnh đó chúng có
thể dẫn tới các rối loại vận động, tăng trương lực cơ, tăng hoạt động cảm giác, ở liều
cao có thể gây co giật hệ thống thần kinh trung ương và dẫn đến tử vong do liệt hô hấp,
liệt cột sống hoặc ngừng tim. Ngoài ra, strychnin còn được sử dụng làm thuốc diệt
chuột và một số loài động vật gặm nhấm. Nó cũng được biết đến là một trong những
chất đầu tiên được sử dụng để nâng cao hiệu suất trong thể thao. Strychnin tác dụng
chọn lọc và đối kháng cạnh tranh với glycin trên receptor glycin ở tủy sống. Liều cao
tác động cả lên receptor glycin ở não. Ngộ độc strychnin có thể gây tử vong cho người
và động vật. [12][30][23]

Brucin cũng là một alcaloid mà từ lâu được sử dụng như một loại thuốc truyền thống
để điều trị ung thư biểu mô tế bào gan. Nó còn được chứng minh có hiệu quả giảm đau
và chống viêm. Độ độc của brucin thấp hơn strychnin nhưng cũng có thể gây co giật hệ
thống thần kinh ngoại biên. Do có độc tính mạnh như vậy nên phạm vi sử dụng hai
chất này bị giới hạn đáng kể và được kiểm soát chặt chẽ bởi pháp luật ở nhiều nước
2

trên thế giới. Mặc dù vậy vẫn có những trường hợp ngộ độc strychnin được phát hiện,
nguyên nhân có thể do bị nhầm lẫn, đầu độc hoặc tự sát. [41] [35]
Đây là hai thành phần có độc tính rất mạnh, chỉ với một liều lượng nhỏ cũng có
thể gây nguy hiểm đến tính mạng con người. Do vậy để giúp cho việc chẩn đoán, phát
hiện nhanh nguyên nhân gây độc và có biện pháp cấp cứu kịp thời, nâng cao hiệu quả
cứu chữa nạn nhân cũng như phục vụ cho công tác pháp y thì đòi hỏi phải có phương
pháp phân tích nhanh các mẫu bệnh phẩm. Vì vậy việc xác định hai alcaloid này là vô
cùng quan trọng trong giám định độc chất.
Trong những năm gần đây, trên thế giới có nhiều phương pháp được đề xuất để
xác định strychnin và brucin trong dịch sinh học như: HPLC/DAD[14], HPLC/MS[32],
LS-ESI-MS[42], HPLC-UV[15], UPLC-MS/MS[41]… Tuy nhiên những phương pháp
này chưa phù hợp với tình hình thực tế tại Việt Nam. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng
phương pháp HPLC’’ với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết
tương chuột bằng HPLC.
2. Thẩm định phương pháp định lượng strychnin và brucin vừa xây dựng.

3

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1. Hợp chất strychnin
1.1.1 Công thức cấu tạo

Công thức phân tử: C
21
H
22
N
2
O
2
Phân tử lượng: 334,41
Tên khoa học: (4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,15bR)-4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15b,16-
decahydro-2H-4,6-methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3-h]quinoline-
14-one.
1.1.2. Tính chất
Là tinh thể không màu hoặc màu trắng, không mùi, vị rất đắng. Nhiệt độ nóng
chảy: 270°C. Khối lượng riêng 1,36 g/cm
3
. PH của dung dịch bão hòa: 9,5.
Độ tan trong: nước là 1/6400 (g/ml), nước sôi là 1/3100 (g/ml), rượu là 1/150
(g/ml), chloroform là 1/35 (g/ml), benzen là 1/180 (g/ml), toluen là 1/200 (g/ml),
methanol là 1/260 (g/ml), glycerol là 1/320 (g/ml), rất ít tan trong ether. [33][39][28]

1.1.3. Dược động học
Strychnin hấp thu nhanh chóng từ đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường tiêm và
da nguyên vẹn. [28][25]
Strychnin dễ dàng được chuyển hóa trong cơ thể, chủ yếu bởi cytochrome P450 2B ở
gan, và hầu như không có ảnh hưởng tích lũy. Thời gian bán thải là 10-12 giờ.[28]
4

Một vài phút sau khi uống, strychnin được bài tiết không đổi trong nước tiểu, và
chiếm khoảng 5% một liều gây chết trong vòng hơn 6 giờ. Thuốc được thải trừ chủ yếu
qua thận và gần như hoàn toàn trong 48 đến 72 giờ. [13][26][28]
1.1.4. Tác dụng
Đối với thần kinh trung ương và ngoại vi có tác dụng kích thích với liều nhỏ, và
tác dụng co giật với liều cao. Làm tăng biên độ và tần số hô hấp, tăng tuần hoàn khi các
trung tâm này bị ức chế. Liều độc kích thích mạnh tủy sống làm tăng phản xạ và gây
cơn co giật giống như co giật do uốn ván. [10][12]
1.2. Hợp chất brucin
1.2.1. Công thức cấu tạo

Công thức phân tử: C
23
H
26
N
2
O
4

Phân tử lượng: 394,46
Tên khoa học: (4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,15bR)-10,11-dimethoxy-4a,5,5a,7,8,13a,15,
15a,15b,16-decahydro-2H-4,6-methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3-

h]quinoline-14-one.

1.2.2. Tính chất
Tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi, vị cay đắng. pH của dung dịch nước bão
hòa 9,5. Nhiệt độ nóng chảy: Dạng khan: 178°C; dạng hydrat: 105°C.
Độ tan: Trong methanol 1/0,8 (g/ml); trong chloroform 1/5 (g/ml), trong ethyl
acetate 1/25 (g/ml); trong glycerol 1/36 (g/ml); trong ether 1/187 (g/ml); trong nước
1/1320 (g/ml); trong nước sôi 1/750 (g/ml).[29]
1.2.3 Dược động học
5

Thí nghiệm trên chuột cho thấy: sau khi uống brucin được hấp thu nhanh (T
max

< 0,5h). Sự gia tăng AUC cho thấy tỷ lệ thuận với sự gia tăng liều. Sinh khả dụng
đường uống (F) không thay đổi theo liều. Giá trị C
max
được tính toán là 0,73±0,23
µg/ml.[16][17][27]
1.2.4. Tác dụng
Brucin có tác dụng tương tự strychnin nhưng yếu hơn. Nó gây liệt dây thần
kinh ngoại biên và tạo ra cơn co giật dữ dội. Brucin có thể gây buồn nôn, nôn, phấn
khích, co giật và co giật với liều lượng lớn. Ngoài ra brucin còn có tác dụng giảm đau,
chống viêm và chống ung thư. [29][40]
1.3. Nguồn gốc của strychnin và brucin
Strychnin và brucin là hai thành phần alcaloid trong hạt Mã tiền có độc tính và
tác dụng sinh học mạnh.
* Một số đặc điểm của cây Mã tiền
1.3.1. Tên khoa học
Strychnos nux-vomica L.

Thuộc họ Mã tiền Loganiaceae.
1.3.2. Thành phần hóa học
Trong hạt mã tiền có chứa rất nhiều alcaloid trong đó chủ yếu là strychnin, brucin, kết
hợp với acid igasuric (acid clorogenic). Những alcaloid khác thường gặp là vomixin,
struxin, colubrine α và β. Tỷ lệ alcaloid toàn phần trong mã tiền thay đổi từ 2,5 đến
5,5% , trong đó strychnin chiếm 43-45%. [10]
1.3.3. Công dụng của mã tiền
Trừ phong thấp, hoạt lạc, thông kinh, giảm đau, dùng trong các bệnh phong thấp
hoặc mạn tính. Mạnh gân cốt, dùng trong các trường hợp gân và cơ tê đau, cơ thể suy
nhược, đau nhức thần kinh ngoại biên. Khứ phong chỉ kinh, dùng trong các bệnh kinh
giản, co quắp, chân tay bị quyết lạnh. Tán ứ, tiêu thũng, dùng trong các bệnh ung độc
hoặc chấn thương cơ nhục sưng tấy. [11]
6

1.4. Phương pháp định lượng strychnin và brucin
Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định lượng
strychnin và brucin trong dịch sinh học cũng như trong dược liệu. Qua tham khảo một
số tài liệu, chúng tôi thấy có các phương pháp định lượng như sau:
Bảng 1.4.1: Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin
STT Tài
liệu
Mẫu thử Phương
pháp
Cột sắc ký Điều kiện sắc ký
1 14 Máu HPLC/
DAD
ThermoHyper-
sil C18 ( 250
mm ×4,6 mm
i.d, 5µm)

-Pha động: acetonitril trong đệm
phosphat 20 mM pH 3,8
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 358°C
- Bước sóng phát hiện: 254 nm
- Thể tích tiêm: 100 µl
-Chất chuẩn nội: Chloroquin
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng
2 32 Dịch
chiết từ
côn trùng

HPLC/
MS
Phenomenex
Luna C18 (150
mm×2,0 mm,
5µm)
-Pha động: MeOH 10% : acid
acetic 90%
-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút
-Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Bước sóng phát hiện: 254 nm
-Thể tích tiêm: 10µl
3 43 Bột dược
liệu
HPLC-
ESI/MS
Zorbax Bonus

RP (150
mm×2,1 mm,
5µm)
-Pha động: acetonitril- amoni acetat
20 mM thay đổi từ 30-70% đến 70-
30 % trong 30 phút
-Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
-Nhiệt độ cột: 40°C
-Bước sóng phát hiện: 254 nm
7

-Thể tích tiêm: 5µl
4 42 Huyết
tương
chuột
LC-ESI-
MS
Waters
Symmetry
TM

C18 (100
mm×4,6 mm,
5µm)
-Pha động: methanol-amoni format
20mM- acid formic (32:68:0,68,
v:v:v).
-Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 30°C
-Thể tích tiêm: 10µl

-Chất chuẩn nội: tacrin
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng.
5 15 Mô
chuột
HPLC-
UV
Kromasil C18
(250 mm×4,6
mm, 5µm)
-Pha động: 24% acetonitril- 76%
đệm (hỗn hợp đẳng cực của 0,01
mol/l natri sulfonat heptan và 0,02
mol/l kali dihydrogen phosphat giá
trị pH 2,8 bằng acid phosphoric 10
%)
-Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
-Nhiệt độ cột: 35°C
-Bước sóng phát hiện: 264 nm
-Chuất chuẩn nội: hyperzin A
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng.
-Thể tích tiêm: 20µl
6 41 Huyết
tương
chuột
UPLC-
MS/MS
BEH C18 (50
mm×2,1 mm

i.d, 1,7 µm)
-Pha động: methanol: acid formic
0,1 % (25:75, v/v)
-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút
-Nhiệt độ cột: 40°C
-Thể tích tiêm: 2 µl
- Chất chuẩn nội: moclobemide
8

7 31 Nước
tiểu
LC-MS Cyanopropyl
(100 mm×4,6
mm, 3µm,
Chrompack,
Antwerp,
Belgium)
-Pha động: acetonitril và acid acetic
1 % trong nước.
-Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm: 50 µl
-Chất chuẩn nội: nalorphin
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng.
8 22 Mô GC/MS Silica
(12,5m×0,2m
m i.d, 0,33µm
film thickness)
GC
-Phun: chia tiêm (1:10)

-Khí mang: Helium (1ml/phút)
-Nhiệt độ phun: 250°C
-Nhiệt độ giao diện MS: 280°C
-Nhiệt độ lò: 170°C
MSD
-Chế độ ion hóa: EI (70ev)
-Nhân điện tử: 2000 V
9 30 Máu và
nước tiểu

HPLC-
ESI-MRM
XBridge
TM

Shield RP 18
(250 mm×3,0
mm i.d, 5µm)
-Pha động: acetonitril và amoni
bicarbonat 10mmol/l (dung dịch
nước ammoniac được dùng để điều
chỉnh pH 10,5).
-Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
-Nhiệt độ: 35°C
-Bước sóng phát hiện: 235 nm
-Thể tích tiêm: 10µl
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha
rắn.
10 38 Máu RP- HPLC

XTerra TM RP
18
(150mm×4,6m
-Pha động: 10mM amoni
bicarbonat (điều chỉnh pH 10 với
amoni hydroxid)/acetonitril (70:30,
9

m, 5µm) v:v)
-Tốc độ dòng: 1 ml/phút
-Nhiệt độ: 30°C
-Thể tích tiêm: 10µl
-Bước sóng phát hiện: 254 nm
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha
rắn
-Chất chuẩn nội: gelsemine
11 35 Máu,
nước
tiểu, gan,
não
LC-
MS/MS
Phenomenex
Luna
(50mm×4,6
mm, 5µm)
-Pha động: amoni acetat 10 mM và
acid acetic 0,1% (pH 3,2) và hỗn
hợp của nước/methanol (95:5, v:v).
-Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha
rắn.
12 18 Máu,
nước tiểu

HPLC-
ESI-
MS/MS
BDS
HYPERSIL
C18
(150mm×2,1m
m , 2,4 µm)
-Pha động: 10 mmol/l amoni format
trong nước với acid formic 0,1%.
-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút
-Nhiệt độ: 40°C
Nhận xét: Phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương
bằng GC/MS, UPLC-MS, HPLC-ESI, LC-ESI-MS, khá phức tạp, tốn kém và chưa phù
hợp với đa số phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Vì vây, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu
xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng
HPLC/UV đơn giản, có độ đúng, chính xác cao và kinh tế, phù hợp với điều kiện các
phòng thí nghiệm của Việt Nam hiện nay.
1.5. Phương pháp HPLC
1.5.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao
10

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích sắc ký dựa trên sự phân chia
khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau. Trong đó, pha động là
chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp. Sắc ký

lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay
tương tác hóa học ở bề mặt. [1] [2]
1.5.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố
quyết định bản chất của của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc
ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố.
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.
Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua
chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây
là tổng các tương tác:
- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).
- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2).
- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).
Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định [1], [2].
1.5.3. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký
- Thời gian lưu t
R
và thể tích lưu V
R
- Hệ số phân bố K
- Hệ số dung lượng k
- Hệ số chọn lọc α
- Độ phân giải R
s

- Hệ số bất đối của píc (AF)
- Số đĩa lý thuyết N. [2]
1.5.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.5.4.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh)
11

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều
thành phần. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ và đường kính
cỡ hạt từ 3-10 µm.
Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng
tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách
phải xảy ra nhanh và chính xác tốt, cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al
2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) Pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và
được sử dụng nhiều nhất.
1.5.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để
thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc
ký của một hỗn hợp. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi
theo tỷ lệ nhất định.
Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo
thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
1.5.4.3. Chọn hệ đệm
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính
acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc
ký và làm tăng hiệu lực tách. Thông thường với các chất tan là acid hữu cơ thì phải
dùng đệm pH acid nhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion
thì pH tùy từng trường hợp.
1.5.4.4. Tốc độ dòng

Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc độ dòng
cho pha động để quá trình tách tốt hơn. [1][2][6]
1.5.5. Ứng dụng phương pháp HPLC
- Phân tích định tính: thường dựa vào thời gian lưu.
12

- Phân tích định lượng: thường dựa vào chiều cao hay diện tích píc và dựa trên
cơ sở của phương pháp chuẩn ngoại hoặc chuẩn nội, hoặc thêm chuẩn.
• Phương pháp chuẩn ngoại: cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký
trong cùng một điều kiện. Sau đó so sánh trực tiếp chiều cao hay diện tích píc của mẫu
thử với mẫu chuẩn.
• Phương pháp chuẩn nội: là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau
của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu
chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội.
• Phương pháp thêm chuẩn: Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất
chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ và độ
tăng của diện tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm chuẩn.
[1][2][6]
1.6. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương
1.6.1. Tủa protein
Tủa protein được sử dụng rộng rãi trong xử lý các mẫu sinh học, loại bỏ các tạp
protein trong huyết tương khỏi các thành phần chất tan khác. Cơ chế của tủa protein là
thay đổi sự solvate hóa của dung môi làm giảm khả năng tan trong huyết tương của các
protein. Có thể gây tủa protein cho huyết tương bằng nhiều cách:
 Tủa protein bằng muối: thường là muối trung tính như amoni sulfat.
 Tủa protein tại điểm đẳng điện (pI).
 Tủa protein với dung môi hữu cơ: như methanol hoặc ethanol.
 Ngoài ra còn có thể tủa protein bằng các cách khác như: dùng các polymer ưa
nước không ion hóa như dextran, polyethylene glycol, tủa bằng các ion kim loại đa hóa
trị như Fe

2+
…[3].
1.6.2. Chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction)
Chiết lỏng-lỏng là phương pháp tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của
chất tan trong hai chất lỏng không thể hòa trộn vào nhau, thường là nước và một dung
13

môi hữu cơ. Để đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết lỏng-lỏng, có thể sử dụng các
thông số sau:
 Hệ số phân bố
 Hệ số tách
 Hệ số khử tạp [3]
1.6.3. Chiết pha rắn (solid – phase extraction)
Chiết pha rắn là phương pháp tách các chất dựa vào ái lực của chất tan với pha
động khi cho pha động chạy qua pha tĩnh. Pha tĩnh trong chiết pha rắn thường gồm
silica gắn với một nhóm chức đặc biệt. [3]
Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng 1 trong 3 phương pháp chiết như
trên.Tuy nhiên phương pháp chiết pha rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không
kinh tế nên chúng tôi khảo sát với 2 phương pháp là kết tủa protein và chiết lỏng-lỏng
để xử lý mẫu huyết tương.
1.7. Thẩm định phương pháp định lượng
1.7.1. Tính thích hợp hệ thống
Đánh giá tính thích hợp hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính tương
thích của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị,
hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử. [36][21]
1.7.2. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể xác định (định
tính-định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các thành phần khác có
trong mẫu.[8]
1.7.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều
cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học.
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất có đáp ứng
tuyến tính.[8]