Tổng quan về chất ức chế neuraminidase (chất ức chế enzym) khả năng nghiên cứu và ứng dụng tại việt nam

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

„ . . . £ Q .

■

NGUYỄN KIM NGỌC
m
TỔNG QUAN VÊ CHẤT
ức
CHẾ NEURAMINIDASE
(CHẤT ỨC CHẾ ENZYM), KHẢ NÂNG NGHIÊN cúu VÀ
ÚNG DỤNG TẠI VIỆT NAM
(KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA 2001 - 2006)
Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Rư
Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa sình
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thòi gian thực hiện: 112006 - 512006
HÀ NỘI - 5/2006
£
lò l CẢM ON
^rưẻ4í hâ-f têi xiết Ểtiíiổ^ hàụ. tẻ- lồtvạ. hiếl tín AÚU iẮe. lối:
Thầỵ giảo - Tô. Nguỵỗn Văn Dư, n ụ tiòi ihầụ, đã tirựe. tiỂp. kưâng, dẫn lò i
eêí lận. ũnhf ạiúạ. đõ^ té¿ k õătt thành khơú. Luậtt tứt nạhiêặt này,.
Çîêi eũnụ. æÙL ehăn. thành eÓML ổn. eúe. thầy, eổ^ ạiảú- Ur&njq, tũăn teưè^ng.,
đăe. biêt Là eÓA thẢụ. eê- lemvg. bậ mền. '7ÔỨÚ linh. - Çîvliènq, ^ ạ i hjỢií '3ÔÒ.
Qlồi đ ã tranạ. bị ehô- tề i kiẾit thứe Utmiạ. qttá. ừ^ùứt hjợe. tập. eũnạ. như đjỘ4ig. lùêti
t)íi tí!(ì ¿fíen Uiêti th iiâ it lo i t‘U() tỉìi thíie Itiên Uhíìá luân.
Çî()i líẠ eùnạ. biâ. ổn g ia ĩtỉn ít oÁ hoM. bề. đã luồn, đồặtq, ixiêttf giúp, ítỡí tò i
twng. ỉvạe. lập, úà kơàn. thành luận, ơăn nàụ.,

'36à Qlộif nạàụ. í 8.5.2006
Sinh viên
Nguyễn Kìm Ngọc
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN : Acid deoxyribonucleic
ARN : Acid ribonucleic
COPD : Bệnh tắc nghẽn phổi mạn tính (Chronic obstructive
pulmonary dieases)
DĐH : Dược động học
DLH : Dược lực học
FDA : Cục quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug
administration)
HA : Hemagglutinin
HPIV : Virus á cúm gây bệnh ở người ( Human parainfluenza virus)
H-N : Hemgglutinin-neuraminidase
IC50 : Nồng độ ức chế 50% (50% inhibitory concentration)
NA : Neuraminidase
NAI : Qiất ức chế neuraminidase ( Neuraminidase Inhibitor)
NP : Nucleocapsid protein
PA : Polymerase A
PBl : Polymerase B1
PB2 : Polymerase B2
RNP : Ribonucleoprotein
TDKMM : Tác dụng không mong muốn
Vd : Thể tích phân bố
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ể 1
I TỔNG QUAN VỂ NEURAMINIDASE
3

1.1 Đặc điểm chung của neuraminidase 3
1.2 Chức năng sinh học của neuraminidase trên virus cúm

4
1 .2.1 Sự ra đòi khái niệm vừus 4
1.2.2 Vừus cúm- thành viên nhóm Myxovirus 6
1 .2.3 Hình thái và kích thước của virus cúm 7
1.2.4 Cấu trúc: 7
1.2.5 Đặc điểm và vai trò của neuraminidase ở virus cúm

12
1.3.6 Sự nhân lên của vừus influenza và khả năng gây bệnh 15
II BIỆN PHÁP PHÒNG - ĐIỂU TRỊ CÚM

21
2.1 Biện pháp dùng vaccin 21
2.2 Biện pháp dùng thuốc chống virus 22
2.2.1 Nhóm ức chế protein màng M 2
23
2.2.2 Chất ức chế polymerase ARN: ribavirin 25
2.2.3 Chất ức chế neuraminidase 25
III MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ NEURAMINIDASE

26
3.1 O seltam iv ir 26
3.1.1 Đặc điểm về dược động học 26
3.1 .2 Nghiên cứu in vitro, m vivo tác dụng và cơ chế tác dụng trên virus 29
3.1.3 Chỉ định - chống chỉ định
32
3.1.4 Liều dùng, cách dùng 32

3.1.5 Phản ứng bất lợi và tính an toàn 34
3.1.6 Vữus biến đổi và tính kháng thuốc 37
3.2 Zanamivir
38
3.2.1 Đặc điểm dược động học 38
3.2.2 Nghiên cứu in vitro và in vivo tác dụng và cơ chế tác dụng

39
3.2.3 Chỉ định, chống chỉ định
41
3.2.4 Liều dùng- cách dùng 41
3.2.5 Phản ứng bất lợi và tính an toàn 42
3.2.6 Virus biến đổi và tính kháng thuốc 44
3.3 Các dẫn chất cyclopentan 45
IV BÀN LU Ậ N 46
4.1 Cơ chế ức chế enzym 46
4.2 Cơ sở thiết kế chất ức chế neuraminidase 47
4.3 Vai trò chất ức chế neuraminidase phòng chống cúm

49
4.3.1 Tĩchcực: 49
4.3.2 Hạn chế: 52
4.4 Xu hướng sử dụng các chất ức chế neuraminidase hợp lý 52
4.4.1 Khuyến cáo lựa chọn chất ức chế neuraminidase

52
4.4.2 ƠIÚ ý khi sử dụng thuốc :
54
4.4.3 Hiệu quả phối hợp với các thuốc chống cúm khác

54
4.5 Hướng phát triển thuốc ức chế neuraminidase

56
4.5.1 Trên thế giód 56
4.5.2 Tại Việt Nam 57
V KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤ T 59
ĐẶT VẤN ĐỂ
•
Trong những năm gần đây, nền kinh tế thế giới có sự phát triển
nhanh chóng kèm theo sự giao lưu có tính chất toàn cầu. Điều này cũng tạo
điều kiện phát triển mạnh các bệnh truyền nhiễm trong đó có bệnh do virus.
Bệnh virus ngày càng gia tăng, dễ phát triển thành dịch nguy hiểm như:
SARS, sốt xuất huyết, HIV/AIDS Một trong những bệnh virus nguy hiểm
là cúm gây ra bởi virus influenza. Nhân loại đã chứng kiến 3 đại dịch cúm
khủng khiếp: đại dịch thứ nhất hay “cúm Tây Ban Nha” do chủng H lN l
cướp đi hơn 40 triệu sinh mạng trên toàn cầu xảy ra năm 1918-1919; đại
dịch thứ hai năm 1957 gây tử vong cho hơn 1 triệu người; đại dịch thứ ba
năm 1968-1969 cũng gây tử vong rất nhiều người. Từ năm 1997, virus
H5N1 gây bệnh cúm ở gia cầm có độc tính gây tử vong cao đã có thể lây
truyền sang người và có nguy cơ gây ra đại dịch cúm ở người. Đến nay,
Việt Nam là một trong các nước nằm trong vùng bị dịch và cũng là quốc
gia có số người chết do H5N1 cao nhất thế giới.
Do vậy, việc nghiên cứu để tìm ra thuốc phòng chống virus nói chung
và virus influenza nói riêng đang là một mục tiêu cấp bách. Gần đây, các
nhà khoa học mới nghiên cứu tìm ra được những chất ức chế một loại
enzyme tên là neuraminidase. Đây là enzyme đóng vai trò quan trọng trong
chu kỳ nhân lên không chỉ của virus influenza mà còn cả các Myxovirus
khác. Các chất ức chế neuraminidase này đã được ứng dụng như là một loại
thuốc chống cúm mới có hiệu quả cao, chọn lọc và an toàn. Tuy nhiên, đây

vẫn là nhóm thuốc vẫn thuộc bản quyền của một vài hãng lớn trên thế giới.
Những nước đang phát triển như Việt Nam chưa được tiếp cận đầy đủ với
các thông tin về nhóm thuốc này nhiều và phải nhập khẩu với giá rất đắt.
Với mong muốn tìm hiểu về nhóm thuốc mới này và về khả năng
nghiên cứu của chúng ta để tạo ra các thuốc chống cúm nói chung và cúm
do H5N1 nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tổng quan về chất ức chê
neuraminidase (chất ức chê enzym), khả năng nghiên cứu và ứng dụng
tại Việt Nam”, với mục tiêu:
Tìm hiểu bản chất, cấu trúc và cơ chê tác dụng cũng như
việc ứng dụng trong phòng chống cúm của các chất ức ch ế
neuraminidase.
Đ ề xuất về khả năng nghiên cứu và ứng dụng các chất ức
chế neuraminidase đ ể phòng và điều trị cúm tại Việt Nam.
I TỔNG QUAN VỂ NEURAMINIDASE
1.1 Đặc điểm chung của neuraminidase
Neuraminidase là enzym thuộc nhóm enzym thủy phân. Enzym này có
một số đặc điểm sau:
- Kí hiệu: E.c 3.2.1.18.
- Tên dùng trong danh pháp phân loại enzym: sialidase hoặc neuraminidase
Phản ứng xúc tác và tính chất:
N-acylneuraminosyloligosaccharide + HjO —> acid N acyl-neuraminic +
oligosaccharid
Neuraminidase cắt đứt acid sialic tự do trong chuỗi glycoprotein hoặc
glycolipid.
- Chất ức chế enzym:
acid 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic;
acid N-acetylneuraminic, glutathion
- Ảnh hưởng của pH:
Hoạt tính của NA có phạm vi pH hoạt động rộng phụ thuộc vào cơ chất,
nhưng pH tối ưu trên virus là 4,5 - 7,0

- Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Phạm vi nhiệt độ hoạt động 10 - 60°c. Nhiệt độ tối ưu là 37°c.
- Cấu trúc: ở virus cúm neuraminidase có cấu trúc 4 tiểu đơn vị (tetramer).
- Phân lập:
• NA được phân lập ở cả virus, vi khuẩn, động vật và người.
+ Virus: Myxovinis (trừ influenza c và một số virus họ Paramyxoviridae).
+ Vi khuẩn: Streptococcus .sp; Arthrobacter .sp; Clostridium .sp;
Actinomyces .sp,
+ Động vật: thỏ
• Vị trí:
+ Virus : Vỏ bao
+ Vi khuẩn: màng ngoại bào
+ Động vật: ở liên kết tế bào, màng tế bào, nguyên sinh chất, [34],[76].
1.2 Chức năng sinh học của neuraminidase trên virus cúm
Virus cúm hay virus influenza là thành viên của họ Orthomyxoviridae
thuộc một nhóm virus lớn gây bệnh phổ biến ở người có tên là Myxovirus.
Hầu hết các virus nhóm này mang đặc điểm chung là có enzym neuraminidase
trên bề mặt. Chúng ta tìm hiểu qua vài nét về đặc điểm của virus để hiểu rõ
hơn ảnh hưởng của các chất ức chế neuraminidase trên virus.
1.2.1 Sự ra đời khái niệm virus
Thế giới vi sinh vật bắt đầu được khám phá với sự ra đời của chiếc kính
hiểm vi quang học do Antony Van Leewentioek. Đến thế kỷ 19 sự tồn tại của
thế giới vi sinh vật khác nhau như: vi khuẩn, nấm, động vật đơn bào đã được
khám phá rộng rãi, nhưng riêng ngành virus học thì lại muộn màng hơn. Thực
tế, qua sự mô tả các tác nhân gây bệnh hàng ngàn năm trước đã cho thấy sự
xuất hiện của các bệnh do virus. Tuy nhiên, chỉ đến cuối thế kỷ 19 mới bắt
đầu có các giả thuyết về virus và có sự khám phá:
+ Năm 1840 nhà khoa học người Đức Jacob Henle đưa ra giả thuyết về
sự tồn tại của các tác nhân truyền nhiễm rất nhỏ, không nhìn thấy được bằng
kính hiển vi quang học và có thể gây ra các bệnh đặc biệt.

+ Cuối thế kỷ 19, những công trình nghiên cứu độc lập của A.Mayer,
D.I.Ivanovski và M.W.Beijevick trên bệnh đốm thuốc lá đã chứng minh được
sự tồn tại của một loại vi sinh vật bé hơn vi khuẩn, có thể qua được nến lọc vi
khuẩn và M.W.Beijevick cho rằng đó là “chất lỏng sống truyền nhiễm ” hay
virus (tiếng Anh virus có nghĩa là “thuốc độc” hay “chất lỏng ghê tởm”).
Thuật ngữ virus có từ đó.
+ Tiếp sau đó, năm 1898 hàng loạt virus được phát hiện như: Loeffler
và Frosh đã mô tả và phân lập được virus đầu tiên ở động vật là virus gây
bệnh “lở mồm long móng” ở mèo. Năm 1901, W.Reed và cộng sự tìm ra virus
trên người đầu tiên là virus gây bệnh sốt vàng da.
+ Từ đó đến nay, nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành đã cho
các hiểu biết mới về virus, và mức độ nguy hiểm của các loại vi sinh vật này.
Đặc biệt những nãm gần đây, khoa học đã tìm hiểu được sâu hơn các loại
bệnh nguy hiểm do virus như: AIDS, viêm gan, cúm Đồng thời, các hiểu
biết sâu hơn về virus đã mở ra các hướng phát triển thuốc chống virus để dự
phòng và điều trị các bệnh virus nguy hiểm trên người, động vật
Trong quá trình phát triển ngành virus học, nhiều định nghĩa về virus đã
được đưa ra. Giáo sư Chu Đức Khánh (Đại học Phúc Đán, Trung Quốc) đã
định nghĩa: “virus là một loại sinh vật phi tế bào, siêu hiển vi, mỗi loại virus
chứa một loại acid nucleic. Chúng chỉ có thể ký sinh bắt buộc trong các tế bào
sống dựa vào sự hỗ trợ của hệ thống trao đổi chất của vật chủ mà sao chép
acid nucleic, tổng hợp các thành phần như protein sau đó tiến hành lắp ráp
để sinh sản, trong điều kiện ngoài cơ thể chúng có thể tồn tại lâu dài ở trạng
thái đại phân tử hoá học không sống và có hoạt tính truyền nhiễm”.
Theo định nghĩa nào thì virus vẫn có các đặc điểm sau:
- Virus có kết cấu đại phân tử vô bào, không có hệ thống sinh năng lượng,
không có ribosom, không có hiện tượng sinh trưởng cơ thể, không mẫn cảm
với các chất kháng sinh.
- Có sự giao thế tương hỗ giữa trạng thái vi sinh vật kí sinh trong tế bào sống
chuyên biệt và trạng thái vi sinh vật ngoài tế bào.

- Virus chỉ chứa 1 trong 2 loại acid nucleic (ADN, ARN) [2 ],[25],[55],
Thuật ngữ “Myxo” có nguồn gốc từ chữ Myxos nghĩa là chất nhầy, bởi
đặc trưng của các virus nhóm này là khả năng gây bệnh liên quan tới tế bào
tiết chất nhầy ở đường hô hấp của người và động vật.
Năm 1962, Walenson đưa ra cách phân loại Myxovirus thành 2 họ lớn:
Paramyxoviridae
Orthomyxoviridae [2]
Bảngl :Bảng phân loại Myxovirus [55],[7]
1.2.2 Virus cúm- thành viên nhóm Myxovirus
Họ
Tiểu họ
Giống
Virus điển hình
Paramyxoviridae
Paramyxovirinae
Paramyxovirus
HPIV-1,3
Morbillivirus
Measles;
Rinderpest
Rubalavirus
Mumps;
HPIV-2,4a,4b
Pneumovirinae
Pneumovirus
Respiratory
syncytial
Orthmyxoviridae
Influenzavirus
A

Influenza A
Influenzavirus
B
Influenza B
Influenzavirus
c
Influenza c
Bảng 2M ộ t số virus thuộc nhóm Myxovirus gây bệnh trên người [55],[7]
Virus
Bệnh
Phân bô
Influenza A,B,C
(vims cúm)
Bệnh hô hấp
Toàn cầu
Mumps (virus quai bi) Viêm màng não, viêm mang
tai,viêm tinh hoàn
Toàn cầu
Human parainfluenza
1 ,2 ,3,4 (virus á cúm)
Bệnh hô hấp
Toàn cầu
Respiratory syncytial
Bệnh hô hấp
Toàn cầu
Measles (virus sởi) Sốt, ban, viêm xơ chai não bán cấp
do sởi
Toàn cầu
1.2.3. Hình thái và kích thước của virus cúm
Giống như các Myxovirus khác, virus influenza thường có hình cầu, bao

phủ bề mặt có các gai nhú bản chất là glycoprotein. Kích thước đưòfng kính
virion của các virus họ Paramyxoviridae thay đổi từ 150 - 300nm còn họ
Orthmyxoviridae là từ 80 - 150nm, thông thường các virus influenza có kích
thước khoảng 120 nm [74],[3].
1.2.4. Cấu trúc:
a, Đặc điểm chung
Virus chưa có cấu tạo tế bào do vậy không gọi là tế bào virus mà gọi là
hạt virus hay virion. Virion là một virus thành thục, có kết cấu hoàn chỉnh.
Cấu tạo chung của một virion Myxovirus gồm 2 phần chính:
- Nucleocapsid (kết cấu cơ bản) gồm: lõi ribonucleoprotein và capsid
- Vỏ bao ( envelop)
Các virion có nucleocapsid cấu tạo đối xứng xoắn, kích thước vòng
xoắn ở Paramyxoviridae là 18nm, ở Orthmyxoviridae là 8 nm. Từ phần sau sẽ
đi sâu vào cấu trúc họ Orthomyxoviridae cụ thể là các virus influenza
[3],[72],[73].
7
> I í.**tíá4iííiíSli*íi:*ầ !»»■»>
« ệiiííí*-«í=Sí4<íẨi
i ệA4^á*áíiẰí^4í* ÜK«»
>
\ %\ * ‘to *¥
' Ló^ ỉiỳiể *
^ỊNè y mmìữídist
^^^^.JHfemagg ly liaia-HA
^^KÉakmüMZ
"Pcơminĩimữg M i
FBI, m i , PA
Pbilc h ú ỳ ĩB on ã
WP ịtĩmhocMựiắ I^íotaía)
Hình I: Câu trúc của virus influenza A

b, Ribonucleoprotein:
Các ribonucleoprotein được cấu tạo gồm: ARN kết hợp với phức hợp
polymerase (PA, PBl, PB2).
Cũng như mọi sinh vật sống khác, acid nucleic (ARN) đóng vai trò là
vật liệu mang thông tin di truyền của virus. Acid nucleic ở Myxovirus có
những đặc điểm sau [72],[73];
Bảng 3: Một số đặc điểm của ARN ở Paramyxovỉridae và Orthomyxovirìdae
Orthomyxovirìdae
Paramyxovirỉdae 1
Ị - Sợi đơn âm.
- Chia thành 8 đoạn (trừ
influenza c có 7 đoạn)
- Trọng lượng 2-4x10^ KD
- Sợi đơn âm
- Không phân đoạn
- 5-8xlO"KD
8
ARN của virus influenza chia thành 8 đoạn. Chức năng mã hoá sự tổng
hợp protein của các đoạn gen như sau [73],[74]:
Bảng 4: Các gen mã hóa tổng hợp protein của virus influenza A
Gen
Kích
thước
Protein
Chức năng
1
2341 PB2
Là tiểu đơn vị của polymerase, nhận
diện mũ chụp M ' - GpppX'^N'" của ARN
tế bào chủ

2
2341 PBl
Là tiểu đơn vị của polymerase
3 2233 PA
Là tiểu đơn vị của polymerase
4 1778 HA
Gắn kết; virus vào thụ thế tế bào chủ
5 1565 NP
Nucleocapsid protein: là thành phần của
phức phiên mã
6 1413
NA
Hoạt tính enzym, phóng thích virus
7 1027 MI
Protein nội màng
M2
Protein nội màng, kênh ion
8 890
NSl
Vận chuyển mRNA ra tế bào chất, là
protein kháng interferon
NS2
Vận chuyển RNP ra khỏi nhân
Hệ gen của virus influenza B có một vài điểm khác: đoạn gen số 7
không mã hóa sự tổng hợp protein màng M2, nên chúng thiếu protein M2,
nhưng nó lại mã hóa tổng hợp thêm một glycoprotein gọi là NB có vai trò là
kênh ion như protein M2 [73].
c, Capsid:
Capsid là cấu trúc bao quanh acid nucleic. Bản chất hoá học của capsid
là protein gọi là nucleocapsid protein (NP), có tác dụng bảo vệ lõi acid nucleic

và tham gia chu kỳ nhân lên của virus. Capsid được cấu tạo bởi các đơn vị phụ
gọi là hạt capsid hay capsomer, lõi ARN và capsid tạo thành nucleocapsid có
cấu trúc đối xứng xoắn.
* Cấu trúc capsid có vai trò quan trọng:
- Bao quanh acid nucleic của virus để bảo vệ không cho enzym nuclease và
mọi sự phá hủy khác.
- Capsid giữ cho hình thái và kích thước của virus ổn định
- Nucleocapsid protein (NP) kết hợp với phức hợp polymerase tạo thành phức
hợp sao mã và NP cũng là kháng nguyên đặc hiệu [3],[50],[74].
d, Vỏ bao:
Là lớp vỏ bao bên ngoài nucleocapsid. về bản chất là glycoprotein và
glycolipid [55],[72],[73]:
Cấu trúc này giữ vai trò đối với virus:
- Tạo sự ổn định về hình thái và cấu trúc virus.
- Tham gia vào sự hấp thụ, nhân lên và giải phóng của virus con khỏi tế bào
vật chủ do đó quyết định độc tính, khả năng truyền nhiễm của virus .
- Tạo lên các kháng nguyên đặc biệt trên bề mặt virus.
Gồm 2 thành phần:
Màng: được cấu tạo bởi lớp lipid kép có các protein xen kẽ. Trong đó có
thành phần protein cấu trúc màng kí hiệu M (influenza A gồm MI và M2) tạo
lên độ rắn chắc cho vỏ. Protein màng M2 ở virus influenza A đóng vai trò là
kênh ion.
- Gai nhú: bản chất glycoprotein, ở các virus influenza (trừ virus influenza
C) 2 loại gai nhú là: hemagglutinin (kí hiệu HA) hình que và neuraminidase
(kí hiệu NA) hình nấm [74].
10
Hemasslutinin hay yếu tố nsưns kết hồns cầu.
Tên hemagglutinin bắt nguồn từ tính chất của nó. Glycoprotein này có
tác dụng gắn kết với receptor chứa acid sialic trên tế bào cảm thụ, các receptor
này có cả trên hồng cầu. Do đó, hemagglutinin đóng vai trò trung gian kết

dính giữa các hồng cầu gây ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu [72].
Ngày nay, người ta đã biết vai trò chính của HA trong chu kỳ nhân lên
của virus influenza [73]:
+ HA kết dính với receptor chứa acid sialic trên bề mặt tế bào vật chủ, quan
trọng nhất là với tế bào chất nhầy đường hô hấp.
+ HA chịu trách nhiệm về sự xâm nhập của virus vào bào tương tế bào bằng
cách kết hợp màng virus với màng tế bào vật chủ. Kết quả là nucleocapsid của
virus được giải phóng vào bào tương.
+ HA là kháng nguyên đặc hiệu, là đích chủ yếu của kháng thể kháng virus.
ở influenza A, HA chiếm khoảng 25% protein của virus, nó có khoảng
550 acid amin (có thể thay đổi theo chủng) [74].
Năm 1981, lan Willson, Don Wiley và John Skehel đã công bố cấu trúc
của HA của virus influenza gồm 2 phần riêng biệt: phần thân dài và phần đầu.
Phần đầu có vị trí gắn kết với receptor ở tế bào vật chủ, chính các acid amin ở
vị trí này biến đổi để xuất hiện các thứ type HA mới. Đây là lí do tại sao virus
influenza A hiện nay đã có 15 dạng HA khác nhau kí hiệu từ HI đến H15
[74],[6 ]. Còn các virus influenza B, c thì ít có sự biến đổi kháng nguyên này.
Bởi HA đóng vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của virus vào tế bào
chủ như vậy, đồng thời nó có đặc tính kháng nguyên, nên đây là một đích
quan trọng trong nghiên cứu vaccin và thuốc để điều trị và dự phòng virus
influenza.
Neuramanỉdase ( NA)
Như đã trình bày ở mục 1.1, neuraminidase là enzym có ở nhiều vị trí
trong thế giới vi sinh vật từ virus, vi khuẩn, động vật Nó tồn tại ở dạng
11
glycoprotein bề mặt có hoạt tính enzym ở hầu hết các virus nhóm Myxovỉrus
(ngoại trừ influenza c và một số virus của họ Paramyxoviridae). NA có vai
trò quan trọng trong chu kỳ nhân lên của các Myxovirus nói chung và virus
influenza nói riêng [73],[74].
1.2.5. Đặc điểm và vai trò của neuraminidase ở virus cúm

Cơ chất tự nhiên của neuraminidase là các receptor bản chất glycolipid
glycoprotein chứa acid sialic. Sau đây là vài nét về acid sialic.
Acid sialic.
Acid sialic là thành phần màng tế bào, đặc biệt là cấu trúc của bề mặt tế
bào. Acid sialic của lớp áo bề mặt tế bào chiếm khoảng 65-75% toàn bộ acid
sialic của tế bào. về bản chất nó vừa là đường vừa là acid amin trong
glycoprotein và glycolipid [20]. về mặt cấu trúc: là dẫn xuất N-acyl của acid
neuraminic, các acid sialic chỉ khác nhau ở vị trí C-5 [37].
Hình 2: Acid N-acetylneuraminic ( Một acid sialic)
Các gốc acid N-acylneuraminic thường có ở đoạn cuối của các chuỗi
oligosaccharid và nhiều glycoprotein, là thông tin báo hiệu một protein tiếp
tục lưu thông trong máu hay bị gan đào thải [l].Trên bể mặt của màng tế bào
acid sialic đóng vai trò là phương tiện trung gian trong phạm vi rộng các tưofng
tác giữa tế bào - tế bào , tế bào - phân tử [13],[37]:
12
- Acid sialic che phủ các kháng nguyên bề mặt tế bào .
- Acid sialic làm bền vững các gốc galactose cũng như màng tế bào .
- Trung gian điều hoà liên kết tế bào - tế bào đóng vai trò dính các tế bào
theo cơ chế acid sialic của màng tế bào này có thể dính kết với sialyl
transferase ở bề mặt tế bào khác. Nó còn hoạt động như chất truyền tin hoá
học.
- Vai trò vận chuyển qua màng: các ion K"^,
- Acid sialic trong thành phần glycoprotein ở bề mặt tế bào còn đóng vai trò
quan trọng trong receptor với lecithin, hormon Đặc biệt nó là receptor trên tế
bào cảm thụ của các Myxovirus trong đó có vims influenza, giúp quá trình
xâm nhập diễn ra của virus.
Đác điểm và vai trò của NA trên virus influenza .
Vào những năm 40 của thế kỉ 20, dựa trên các nghiên cứu về phản ứng
ngưng kết hồng cầu gây nên bởi virus influenza của Hirst (1941), Mac Cleland
(1941) đã khiến người ta giả thiết về một loại enzym đặc biệt ở virus

influenza. Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định được sự có mặt của
neuraminidase ở nhiều vị trí trong thế giới sinh vật, mà điển hình là ờ virus
influenza [14].
Trên bề mặt vims influenza, NA như một gai nhú hình nấm nằm xen kẽ
với các gai HA nhưng với số lượng ít hơn. Bản chất NA cũng giống HA là
chuỗi polypeptid đơn.
Về cấu tạo NA gồm 2 phần: phần thân có phần kỵ nước, nhờ đó gắn
được vào bề mặt màng virus có bản chất lipid; phần đầu như đầu nấm cấu tạo
gồm 4 tiểu đơn vị hình cầu, trung tâm hoạt động đặt ở mỗi tiểu đơn vị nên
phần đầu có đầy đủ hoạt tính enzym và có thể tách rời khỏi phần thân bằng
protease [29]. Phân tích cấu trúc NA của influenza A và influenza B cho thấy
giữa chúng có trình tự acid amin tương ứng khoảng 30% [63]. Ngoài ra, ở các
thứ type N l, N9 của influenza A người ta còn xác định được vị trí liên kết với
13
receptor chứa acid sialic, chúng cũng gây ra hiện tượng ngưng kết hổng cầu
như hemagglutinin, nên coi vị trí đó như là một trung tâm hoạt động thứ 2
nhưng tính chất và chức năng của nó chưa rõ [8 ].
Vai trò enzym của NA là xúc tác phản ứng thuỷ phân tách rời liên kết
a-2,3 hoặc a (2 ,6 ) keto-glycosialic giữa acid sialic tận cùng và gốc đường liền
kề trong chuỗi glycoprotein hoặc glycolipid ở trên bề mặt virus (chính là phân
tử HA và phân tử NA khác) hoặc ở trên bề mặt tế bào [73],[74].
Acid sialic tận cùng của glycoprotein trên bề mặt tế bào có vai trò quan
trọng trong receptor, để HA gắn vào. Do đó, NA làm tách rời acid sialic sẽ
làm cắt đứt liên kết giữa HA và receptor sẽ rất cần thiết để duy trì sự di động
của virus, tránh cho virus không bị kết đính với nhau cũng như làm thuận lợi
cho việc giải phóng virus khỏi bề mặt tế bào đã bị nhiễm [29]. Ngoài ra còn
có giả thiết rằng acid sialic tận cùng các glycoprotein quyết định dấu điện
tích, do vậy khi tách rời acid sialic thì pH của glycoprotein sẽ giảm xuống và
trở lên nhạy cảm dễ bị phá hủy bởi các enzym protease [14].
Giống như HA, NA cũng có sự biến đổi tạo thành các thứ type khác

nhau dẫn đến việc tạo ra các thứ type virus mới. ở influenza A, hiện nay đã
xác định được 9 thứ type NA kí hiệu từ N1-N9 [6 ].
Đến nay, các đặc điểm sinh học của virus influenza A và B đăc biệt là
cấu trúc, chức năng của NA ở các virus này đã được xác định khá rõ ràng.
Giống như HA, NA cũng là một đích đáng quan tâm cho các nhà nghiên cứu
dược học vì nó giúp phát triển các chất ức chế NA với vai trò làm thuốc chống
cúm hoạt động trên tất cả các chủng của virus influenza A, B. Ngược lại, việc
dùng vaccin không thích hợp với sự thay đổi kháng nguyên nhanh của virus
cúm. Hơn nữa, NA của virus cúm còn có thể là một mẫu để tìm hiểu cấu trúc
chưa rõ của NA ở nhiều vi khuẩn, động vật có vú.
14
Hình 3: Phản ứng xúc tác của neuraminidase trên glycoprotein
1.3.6. Sự nhân lên của virus influenza và khả năng gây bệnh
Sư nhân lên của virus influenza .
Sau khi virus influenza xâm nhập vào cơ thể vật chủ, sự tương tác giữa
virus và tế bào cảm thụ (tế bào tiết chất nhầy đường hô hấp) sẽ xảy ra. Sự
tương tác có thể chia thành các giai đoạn [2],[3]:
Sự hấp thụ của virus lên bề mặt của tế bào cảm thụ.
Giai đoạn xâm nhập và cởi vỏ.
15
Tổng hợp các thành phần của virus.
Giai đoạn lắp ráp.
Giai đoạn giải phóng.
Sơ đồ chu kỳ nhân lên của virus trong tế bào {phụ lục ỉ),
a- Sự hấp thụ của virus lên bề mặt tế bào:
Sự hấp phụ được thực hiện nhờ sự vận chuyển của virus trong các dịch
gian bào giúp virus tiến tới tế bào cảm thụ. Các tế bào cảm thụ có các receptor
mang vị trí đặc hiệu trên bề mặt cho virus gắn vào [14].
Các virus influenza nói riêng và các Myxovirus nói chung có các
receptor là glycoprotein, glycolipid trên bề mặt tế bào tiết chất nhầy ở đường

hô hấp. Nhóm chức tự do của receptor là acid sialic sẽ gắn với gai HA của
virus giúp virus gắn vào tế bào [72],[73].
b- Sự xâm nhập và cởi vỏ của virus:
Sau khi hấp thụ lên bề mặt tế bào, virus xâm nhập vào tế bào theo cơ
chế ẩm bào. Đầu tiên màng sinh chất tế bào lõm thành các lỗ cho virus vào.
Tiếp đến tách thành một túi có vỏ bao chính là màng sinh chất của tế bào gọi
là endosome, sau đó HA gắn kết với màng endosome và diễn ra sự hoà màng
giữa màng endosome và màng virus ở môi trường pH thấp do các kênh protein
M2 mở ra, tiếp theo là endosome giải phóng các ribonucleoprotein (RNP) vào
bào tương, RNP sẽ được vận chuyển vào nhân để diễn ra quá trình sao chép và
sao mã [73],[74],[50],
c- Tổng hợp các thành phần của virus
Virus influenza có ARN là sợi âm, do đó ARN chỉ có chức năng làm
khuôn cho quá trình sao chép và sao mã [2 ].
Trong nhân tế bào bị nhiễm, ARN virus (vARN) chịu trách nhiệm sao
mã thành mARN và sao chép thành ARN của virus con. Cả 2 quá trình này
đều nhờ phức hợp polymerase của virus [74].
16
^ Hemagglutinin. ỢÍA)
T Neuraminidase CNA)
y HAœcepcco:
® EcotBÍnM2
C3 Amantad in
□ ChấtúcchÂ^KACNAỊ)
S
■a
r
•c
o
r

»
n
a -
>
H
pi
c
z
I
S
z
N
Sự tổng hợp mARN có sự tham gia của NP và phức hợp polymerase
(PB|, PB2, PA) tạo thành phức hợp sao mã của virus. Sau đó mARN được vận
chuyển ra ngoài bào tương để dịch mã tổng hợp các protein virus. Các protein
màng (HA, NA, M2) được vận chuyển thông qua lưới nội chất và bộ máy golgi
đến gắn vào màng sinh chất của tế bào. Còn các protein khác: PB|, PBj, PA,
NP, M|, NSl, NS2 được vận chuyển vào nhân để tham gia lắp ráp sau đó
[73],[74],
Sự sao chép vRNA được tiến hành theo 2 bước: bước 1 tổng hợp ARN
làm khuôn (ARN sợi dương); bước 2 từ ARN khuôn sao chép thành ARN của
virus con (ARN sợi âm hay vARN) [74].
d- Sự lắp ráp:
Trong nhân tế bào bị nhiễm, các đoạn vRNA kết hợp với PBl, PB2, PA,
NP tạo thành các ribonucleoprotein hay gọi chung là nucleocapsid, sau đó gắn
với MI để di chuyển ra ngoài bào tương, ở bào tương các thành phần màng
HA, NA, M2 được thêm vào tạo thành các virion hay virus con trong tế bào bị
nhiễm và sẽ được giải phóng ra để lây nhiễm sang tế bào khác [73],[74].
e- Sự giải phóng:
Virus con được giải phóng khỏi tế bào cảm thụ bị nhiễm theo cách nảy

chồi. Các thành phần màng HA, NA, M2 đã được gài trên màng sinh chất tế
bào chủ. Màng sinh chất nhô ra ngoài cùng với nucleocapsid rồi thắt lại tạo
thành túi kín bao nucleocapsid nhưng gai nhú HA vẫn gắn vào màng sinh
chất. Lúc này NA xúc tác cắt liên kết giữa HA - acid sialic để tách rời virus
con tế bào vật chủ. Virus con được giải phóng tiếp tục tấn công vào các tế bào
khác [2],[73],[74].
Khả năns sây bênh.
Sau khi xâm nhập và nhân lên trong tế bào thì hầu hết tế bào bị phá
huỷ, nếu còn nguyên vẹn thì cũng mất chức năng [3],[10]. Quá trình phát triển
của virus trên đường hô hấp tiến dần đến sự phá huỷ các tổ chứọ^tìỆnLlíĩàữ, tổ
17 \
chức này bị tổn thương sẽ mở đường cho virus vào phế quản và phổi, và cũng
tạo điều kiện bội nhiễm vi khuẩn khi các tổ chức tế bào đã bị mất khả năng tự
vệ bình thường, kết quả là gây ra các biến chứng [2],[73],[74].
Biểu hiện của bệnh:
- Thể điển hình: Sau 1-2 ngày ủ bệnh, người bệnh có các dáu hiệu sốt,
đau họng, ho, đau khắp mình mẩy, mệt mỏi, chảy mũi, tổn thương bộ máy hô
hấp. Các triệu chứng khởi phát đột ngột. Bệnh có thể khỏi nhanh hoặc cũng có
thể kéo dài và gây biến chứng.
- Thể nặng và tử vong: Các tế bào bị tổn thương do virus dẫn đến các
biến chứng như viêm phổi, viêm phế quản, viêm tai giữa (hay gặp ở trẻ em),
viêm kết mạc thậm chí cả viêm não do virus hoặc do bội nhiễm vi khuẩn, làm
nặng thêm các bệnh mãn tính.
Riêng influenza c gây bệnh nhẹ, triệu chứng không điển hình và chỉ
giới hạn trên đưòỉng hô hấp nên ít được quan tâm [2 ].
Virus influenza rất dễ lây từ người sang người qua đường hô hấp nhờ
nước bọt nên dễ gây thành dịch nếu không có các biện pháp giám sát và
phòng chống tốt [8 ]. Hiện nay, virus H5N1 nguồn gốc từ loài lông vũ, có độc
tính gây tử vong cao, đã có khả năng lây sang người nên rất nguy hiểm. Qiúng
gây ra một số đặc điểm lâm sàng khác biệt với các thứ type influenza khác

[50],[90] :
- Thời gian ủ bệnh lâu hơn, có thể lên tới 8 ngày.
- Triệu chứng ban đầu: sốt cao trên 38°c với các triệu chứng cúm.
Ngoài ra tiêu chảy, nôn, đau bụng, đau ngực, chảy máu cam cũng đã được báo
cáo trong giai đoạn đầu của triệu chứng. Tiếp đến là các triệu chứng hô hấp
dưới (triệu chứng hô hấp trên đôi khi mới xảy ra): suy hô hấp, thở nhanh và có
ran phổi là hay gặp. Bệnh nhân có các biểu hiện viêm phổi trên lâm sàng, đặc
biệt là suy hô hấp cấp dẫn đến tử vong. Tiến triển có thể là suy đa tạng: rối
loạn chức năng thận, tổn thương tim
18
Sư biến dôi kháns nsm ên
Virus influenza A và B có khả năng gây bệnh lặp lại nhiều lần là do
chúng thường xuyên biến đổi cấu trúc kháng nguyên. Cả 2 loại glycoprotein
bề mặt NA và HA đều là kháng nguyên tạo kháng thể trong cơ thể ngưòi
bệnh. Các phân tử HA và NA biến dổi đột ngột và liên tục đã làm thay đổi đặc
tính kháng nguyên của virus. Với 15 dạng HA và 9 dạng NA thì rất dễ xuất
hiện các thứ type virus mới bằng cách tổ hợp tái tạo gen hai kháng nguyên này
[2],[7],[6 ],
Phòns, chuẩn đoán và điểu tri bênh
a- Chuẩn đoán [2],[50],[90];
Để chuẩn đoán, ngoài việc dựa trên các triệu chứng lâm sàng đã nói ở
trên thì việc chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm sẽ có giá trị chắc chắn hơn.
+ Chuẩn đoán trực tiếp;
Lấy bệnh phẩm là dịch xuất tiết đường mũi họng.
Nuôi cấy bệnh phẩm trong tế bào (thưòng là tế bào phôi gà).
Xác định sự có mặt của virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Định type virus bằng phản ứng trung hoà trong tế bào hoặc ức chế ngưng
kết hồng cầu với các kháng thể máu.
Có thể chứng minh sự có mặt của virus bằng phản ứng miễn dịch huỳnh
quang.

+ Chuẩn đoán huyết thanh tìm kháng thể
Bệnh phẩm là huyết thanh bệnh nhân, lấy 2 lần cách nhau từ 10 đến 14
ngày để chuẩn độ kháng thể và so sánh mức độ tăng hàm lương kháng thể.
Lần đầu vào tuần lễ đầu sau khi bị cúm. Để tìm được virus dùng các phản ứng
kết hợp bổ thế, ức chế ngưng kết hồng cầu.
b- Phòng bệnh [2],[38]:
* Phòng không đặc hiệu:
Thuốc sát trùng nhỏ mũi: nước tỏi
Cách ly bệnh nhân: hạn chế tiếp xúc không khí nơi có nguy cơ cao.
19