Xác định Vitamin B1 trong thực phẩm bằng phương pháp huỳnh quang phân tử

Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
Khoa Công nghệ hóa học
Chuyên ngành Hóa phân tích
Xác định Vitamin B1 trong thực phẩm
bằng phương pháp huỳnh quang phân tử
GVHD : TS. Lê Đình Vũ
1
NỘI DUNG TRÌNH BÀY
Tìm hi u v Vitamin B1ể ề
1
2
Quy trình xác đ nh Vitamin B1 ị
1.Tìm hiểu về Vitamin B1
8/8/153
vitamin B1( thiamine)
2-[3-[(4-amino-2-methyl- pyrimidin-5-yl)methyl]- 4-
methyl-thiazol-5-yl] ethanol
8/8/154
- Cấu trúc hóa học:
+ Thiamin gồm dẫn chất pyrimidin gắn với
dẫn chất thiazol qua nhóm methylen.
+ Ngoài ra thiamin còn tồn tại dưới dạng
photphat este gồm thiaminmonophotphat (TMP),
thiamin triphotphat (TTP), thiamin pyrophotphat
(TPP) là dạng mà vị trí OH sẽ được đính vào
hoặc 1, 2 hoặc 3 gốc photphat (R)
8/8/155
- Tính chất hóa học:
+Thiamin bị oxy hóa bởi K3[Fe(CN)6]
trong môi trường kiềm tạo thành thiocrom màu
vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời, tính

chất này được dùng để xác định Vitamin B1
bằng phương pháp đo huỳnh quang.


+ Thiamin tạo tủa khi phản ứng với tannin,
thủy ngân (II) clorua, axit picric.
8/8/156
b. Chức năng sinh học:
-
Đồng hóa đường
- Nhân tố ngon miệng, kích thích cảm giác thèm ăn.
- Tham ra điều hòa quá trình dẫn truyền xung thần
kinh, kích thích các hoạt động trí não.
-Trong cơ thể, vitamin B1 tham gia vào nhiều phản
ứng chuyển hóa, đặc biệt là chuyển hóa glucid.
- Thiếu hụt vitamin B1 sẽ dẫn đến bệnh beriberi
(bệnh tê phù)
- Nhu cầu vitamin B1: thay đổi tùy theo lứa tuổi,
nghề nghiệp, trạng thái sinh lý của cơ thể,…
8/8/157
2. Quy trình xác định Vitamin B1 trong sữa
bằng phương pháp huỳnh quang
2.1. Nguyên tắc xác định: Chiết Vitamin B1 bằng dung
dịch HCl trên bếp cách thủy, sau đó Vitamin B1 bị oxy
hóa bởi Kaliferricyanur ở môi trường kiềm tạo thành
Thyocrom có huỳnh quang xanh da trời. Chiết
Thyocrom bằng isobutanol sau đó đo huỳnh quang ở
bước sóng kích thích 365nm và bước sóng phát
huỳnh quang 425nm
2.2. Phạm vi áp dụng : Phương pháp này áp dụng cho

xác định Vitamin B1 trong mẫu thực phẩm.
8/8/158
2.3. Hoá chất
- Natri axetat (TK.PT) dung dịch 2N: Hoà tan 15g natriaxetat
ngậm nước vào nước cất và thêm nước cất vừa đủ 1 lít.
- Natri hydroxit (TK.PT) dung dịch 15%: Hoà tan 15g natri
hydroxit trong nước và thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
- Kali ferixyanua (TK.PT) dung dịch 1%: Hoà tan 1g kali
ferixyanua trong nước cất và thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
Dung dịch pha chỉ dùng trong ngày.
- Chất oxy hoá: Hỗn hợp 4 ml dung dịch kali ferixyanua 1% với
dung dịch natri hydroxit 15% đến vừa đủ 100 ml. Dung dịch pha
dùng trong 4 giờ.
- Isobutanol (TK.PT)
- Vitamin B1 (TK.PT) dung dịch chuẩn: Cân khoảng 30-40mg với
độ chính xác 0,0001 g thiamin clohydrat (đã làm khô trong bình
hút ẩm) hoà tan trong bình định mức 1 lít bằng dung dịch cồn
etylic 20% đã axit hoá bằng axit clohydric đến pH-3,5-4. Bảo
quản ở nhiệt độ 100C tránh ánh sáng.
- Kali clorua hay natri clorua; TK.HH;
8/8/159
2.4. Dụng cụ và thiết bị:
- Cân phân tích, cân kỹ thuật;
- Tủ sấy;
- Bình định mức, dung tích 1 lít, 250 ml;
- Cốc có mỏ, dung tích 250 ml;
- ống đong chia độ, dung tích 5 ml, 100 ml;
- Nồi cách thuỷ;
- Phễu lọc thuỷ tinh, dung tích 250 ml;
- ống nghiệm nút mài, dung tích 40-50ml;

- Pipet có bầu, dung tích 1ml, 5ml;
- Máy đánh nghiền hoặc cối chày sứ;
- Máy lắc;
- pH met;
- Huỳnh quang kế.
8/8/1510
2.5. Quy trình thực hiện
2.5.1. Chiết vitamin B1 ra khỏi mẫu lương thực:
Cân chính xác một lượng mẫu đã nghiền nhỏ trộn đều ước
tính chứa khoảng 20-50mg thiamin cho vào cốc có mỏ dung
tích 250ml. Tiến hành song song với dung dịch chuẩn bằng
cách hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn Vitamin B1 cho vào
cốc khác. Thêm vào các cốc, mỗi cốc 100ml dung dịch HCl
0,1N (pH=1-1,5), đậy nắp, đun cách thuỷ sôi 45 phút hoặc
đun trong nồi áp suất (t0=110-1200C) trong 35 phút (kể từ
khi đạt nhiệt độ). Để nguội đến nhiệt độ phòng, điều chỉnh
pH các cốc bằng dung dịch natri axetat 2N đến pH = 4 - 4,5.
Chuyển toàn bộ dịch ở mỗi cốc sau khi điều chỉnh pH vào
bình định mức 250ml và thêm nước cất đến vạch. Lọc dung
dịch bằng giấy lọc không hấp phụ thiamin (hoặc giấy lọc
không tro) bỏ vài mililit đầu.
8/8/1511
2.5.2. Oxy hoá thiamin thành thiocrôm:
Với mỗi dung dịch mẫu định lượng, kể cả dung dịch chuẩn,
được tiến hành song song trên 4 ống nghiệm nút mài dung tích
40-50ml. Trong mỗi ống chứa sẵn 3g kali clorua. Hút chính xác
5ml mỗi dịch lọc vào từng ống nghiệm trong 4 ống, hai ống được
coi là ống trắng, hai ống được coi là ống thử của từng mẫu.
2.5.2.1. Đối với ống trắng của các mẫu được tiến hành như sau:
Lắc nhẹ ống nghiệm bằng máy lắc thêm ngay 3ml dung dịch natri

hydroxit 15%, lắc trộn cho đều, thêm nhanh 15ml isobutanol, đậy
ống, lắc mạnh trong 15 giây, để lắng.
2.5.2.2. Đối với các ống thử còn lại của các mẫu được tiến hành
như sau:
Lắc ống nghiệm bằng máy lắc, thêm ngay 3ml dung dịch chất oxy
hoá (dung dịch kiềm kaliferixyanua), lắc trộn đều, thêm nhanh
15ml isobutanol, đậy ống, lắc mạnh trong 15 giây, để lắng.
Các ống nghiệm trên để lắng cho tách lớp trong bóng tối trong
vòng 20 phút. Sau đó hút hoặc gạn lấy khoảng 10ml dung dịch
isobutanol có chứa huỳnh quang ở bên trên.
8/8/1512
2.5.3. Đo huỳnh quang:
Đo mật độ huỳnh quang của dung dịch isobutanol bằng
máy đo huỳnh quang tại bước sóng kích thích và phát xạ là
360 nm và 435 nm (đối với huỳnh quang kế Coleman thì
dùng 2 kính lọc số 12.221 và 14.221 tương đương với 2 bước
sóng trên).
8/8/1513
2.6. Tính toán kết quả
Hàm lượng Vitamin B1 (X) tính bằng microgam trong 100g
lương thực được tính theo công thức sau:

Trong đó:
Cc: Hàm lượng Vitamin B1 trong mẫu chuẩn (mg)
Dct: Mật độ huỳnh quang ống chuẩn thử
Dctr: Mật độ huỳnh quang ống chuẩn trắng
Dmt: Mật độ huỳnh quang ống mẫu thử
Dmtr: Mật độ huỳnh quang ống mẫu trắng
P: Khối lượng mẫu cân (g)