Nghiên cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và bệnh ung thư phổi

i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
******************



TRẦN MẠNH HÀ



NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ
VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC





Hà Nội - 2013
ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
****************

TRẦN MẠNH HÀ

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ
VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN





Hà Nội – 2013
iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn trân trọng nhất tới
các bệnh nhân đã hiến mẫu cho nghiên cứu này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
PGS.TS. Lê Quang Huấn đã tạo điều kiện cũng như tận tình chỉ bảo và động
viên trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức quý báu cả về kiến thức
lẫn tinh thần từ tập thể phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ
sinh học.
Trong suốt thời gian khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng
quí báu của TS.BS Đào Huyền Quyên, Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Bạch Mai.
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới chị.
Nhân dịp này em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô, bạn bè và
gia đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2013
Học viên


Trần Mạnh Hà
iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



MỤC LỤC
Trang

LỜI MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu 2
3. Nội dung 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về ty thể 3
1.1.1. Cấu trúc ty thể 4
1.1.2. Chức năng của ty thể 5
1.1.3. Hệ gen ty thể 6
1.1.4. Sự phân chia ty thể và quá trình sao chép gen ty thể 9
1.2. Di truyền gen ty thể và đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 11
1.2.1. Di truyền gen ty thể 11
1.2.2. Đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 12
1.3. Mối liên quan giữa ung thư phổi và đột biến gen ty thể 14
1.3.1. Giới thiệu chung về ung thư 14
1.3.1.1. Định nghĩa ung thu và dịch tễ học ung thư 14
1.3.1.2. Cơ chế và nguyên nhân gây ung thư 15
1.3.2. Ung thư phổi 18
1.3.2.1. Giới thiệu về ung thư phổi và tình hình dịch tễ 18
1.3.2.2. Nguyên nhân gây ung thư phổi và quá trình phát triển ung thư phổi 20
1.3.3. Mối liên quan của chức năng của ty thể và sự phát triển ung thư 21
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Vật liệu 23
2.1.1. Sinh phẩm 23
2.1.2. Hóa chất 23
2.2. Trang thiết bị 23
2.3. Phần mềm tin sinh học 24
2.4. Phương pháp nghiên cứu 25
2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu máu 25
v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


2.4.2. Định lượng DNA tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế 26
2.4.3. Nhân đoạn gen bằng PCR 26
2.4.4. Phương pháp giải trình tự 30
2.4.5. Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự 31
2.4.6. Phương pháp tìm đột biến gen 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Kết quả tách chiết DNA 33
3.2. Kết quả nhân gen PCR 35
3.3. Kết quả giải trình tự gen 38
3.4. Kết quả phân tích đột biến 40
3.5. Thảo luận 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44



vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Bp Base pair (Cặp base)
DNA Deoxyribonucleic acid
D-loop Displacement loop

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
HV Hypervariable regions
kb kilo base
mtDNA Mitochondrial Deoxyribonucleic acid(DNA ty thể)
OD Optical Density (mật độ quang)
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng
hợp nhờ enzyme Polymerase)
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosome Ribonucleic acid
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SSC Standard saline citrate
TAE Tris - Acetate - EDTA
TE Tris - EDTA
Tm Melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy)
tRNA Transfer Ribonucleic acid

vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ
Danh
mục hình
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc ty thể
4
1.2

Quá trình sinh tổng hợp ATP trong ty thể
5
1.3
Cấu trúc hệ gen ty thể
7
1.4
Sự phân chia ty thể
10
1.5
Cơ chế sao chép mtDNA
11
1.6
Di truyền ty thể theo dòng mẹ
12
1.7
Cơ chế phát triển ung thư
15
1.8
Quá trình chết theo chương trình của tế bào
17
1.9
Sự phát triển của ung thư phổi
20
2.1
Sơ đồ nguyên lý PCR
28
2.2
Các bước của một chu kỳ PCR
29
2.3

Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự
31
2.4
Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp
phổ thông
32
3.1
Kết quả tách chiết DNA tổng số
33
3.2
Đồ thị kiểm tran độ tinh sạch bằng phương pháp đo OD
35
3.3
Trình tự vùng D-loop và vị trí bắt cặp mồi
36
3.4
Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agarose 1%
38
3.5
Kết quả giải trình tự trên một số mẫu bệnh và mẫu đối
chứng
40
3.6
Kết quả phân tích đột biến
41



viii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Danh mục
bảng
Tên bảng
Trang
1.1
So sánh mã di truyền của gen nhân và gen ty thể
8
1.2
Các triệu chứng của ung thư phổi
18
2.1
Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
24
2.2
Phần mềm sử dụng
24
2.3
Sơ đồ nguyên lý PCR
30
3.1
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng phương
pháp OD
34
3.2
Thành phần dùng cho 1 phản ứng PCR
37

3.3
Chương trình thực hiện phản ứng PCR
37











1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ những năm 1805 ty thể được các nhà khoa học phát hiện là một cấu
trúc ngoài nhân tế bào (Ernster and Schatz, 1981). Sau gần 100 năm nghiên
cứu kéo dài, mối liên hệ của ty thể và hô hấp tế bào được xác định và ngày
nay ty thể được đánh giá là “trung tâm năng lượng của tế bào” (“Powerhouse
of the Cell”). Ngoài ra, một trong những phát hiện đột phá về ty thể là việc
xác định được sự tồn tại của vật liệu di truyền ty thể vào những năm đầu thập
kỷ 60 của thế kỷ trước. Từ đó đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực ty thể
đã phát triển mạnh từ giải trình tự hệ gen ty thể, nghiên cứu chức năng cơ bản
của ty thể và những bệnh liên quan tới rối loạn chức năng ty thể.
Tầm ảnh hưởng của ty thể tới sự phát triển bệnh ung thư ngày càng được

giới nghiên cứu công nhận. Các đột biến của mtDNA (Mitochondrial
Deoxyribonucleic) đã được phát hiện ở các bệnh ung thư như ung thư bàng
quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ và đầu, ung thư thận, gan,
phổi, dạ dày và ung thư máu ác tính. Quan trọng hơn, vùng D-loop
(displacement loop) của hệ gen ty thể lại là nơi có tần suất đột biến cao, đặc
biệt là tại các vùng siêu biến như HV1 (hypervariable regions). Vì vậy đột biến
tại vùng D-loop tiềm ẩn nhiều mối liên quan tới phát triển ung thư.
Ung thư phổi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng là bệnh
phổ biến và nguy hiểm trong tất cả các loại ung thư. Đây là bệnh có tiên
lượng xấu bởi tiến triển nhanh, di căn sớm, phát hiện bệnh thường ở giai đoạn
muộn. Ung thư phổi thường không có triệu chứng đặc biệt và có thể có các
đặc điểm giống như ở các bệnh lý khác gây ra. Vì vậy việc tiến hành các chẩn
đoán y học tin cậy là rất cần thiết. Việc xác định trình tự nucleotide vùng điều
khiển DNA ty thể được xem là công cụ hữu hiệu để đánh giá sự liên quan mật
thiết giữa tỉ lệ đột biến vùng điều khiển gen ty thể với sự phát triển, biểu hiện
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ung thư phổi. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành “Nghiên
cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và
bệnh ung thƣ phổi”
2. Mục tiêu
Giải trình tự vùng D-loop tách chiết từ mẫu bệnh phẩm (máu) của bệnh
nhân ung thư phổi tại bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội – Việt Nam và
người khỏe mạnh.
So sánh trình tự đoạn gen HV1 vùng D-loop với các trình tự tham khảo
công bố trên ngân hàng gen và tìm điểm đột biến đặc trưng cho bệnh
nhân ung thư phổi ở Việt Nam.
Đề xuất chức năng đột biến gen ty thể liên quan tới bệnh ung thư phổi.

3. Nội dung
Tách chiết DNA tổng số từ máu của bệnh nhân mắc bệnh ung thư phổi
và người bình thường.
Nhân đoạn gen HV1 thuộc vùng D-loop.
Xác định và phân tích trình tự gen vùng HV1 của các mẫu bệnh phẩm
và mẫu đối chứng. So sánh các trình tự với trình tự chuẩn Cambridge
Reference Sequence (CRS) để tìm ra điểm đột biến sai khác.
3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về ty thể
Từ những năm 1805 ty thể được các nhà khoa học phát hiện là một cấu
trúc ngoài nhân tế bào (Ernster and Schatz, 1981). Tuy nhiên hơn 60 năm
nghiên cứu về chức năng ty thể kể từ khi cấu trúc này được phát hiện, các nhà
tế bào học mới lần đầu tiên nhận ra mối liên quan của ty thể và sự hô hấp tế
bào bằng quan sát cấu trúc hình thái đơn thuần. Tiếp theo 30 – 40 năm tập
trung nghiên cứu sinh hóa sau đó, ty thể được đánh giá là “trung tâm năng
lượng của tế bào” (“Powerhouse of the Cell”) (Verschoor et al., 2013). Để có
được kết luận này về chức năng của ty thể các nhà khoa học đã dựa trên một
loạt các phát hiện mang tính sự kiện trong lĩnh vực nghiên cứu ty thể. Năm
1909, Corren và Baur độc lập phát hiện ra các trường hợp di truyền theo dòng
mẹ nhưng chưa xác định được nguồn gốc và vị trí. Các phân tích di truyền sau
đó vào năm 1949 bởi Slonimski và Ephrussi đã chỉ ra rằng suy hô hấp tế bào
ở nấm men có đột biến trong tế bào chất chứ không phải do đột biến gen trong
nhân (Slonimski and Ephrussi, 1949). Và rất nhanh sau đó, hai tác giả này đã
chứng minh được rằng suy hô hấp tế bào là do rối loạn chức năng ty thể. Dựa
trên những phát hiện đầu tiên này, các phát hiện mang tính đột phá về ty thể
liên tiếp được đưa ra. Một trong những phát hiện đột phá là việc xác định

được sự tồn tại của vật liệu di truyền ty thể (Nass and Nass, 1963; Schatz and
Klima, 1964). Từ đó đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực ty thể đã phát
triển mạnh từ giải trình tự hệ gen ty thể, nghiên cứu chức năng cơ bản của ty
thể cũng và những bệnh liên quan tới rối loạn chức năng ty thể. Trong phần
này, chúng tôi sẽ giới thiệu về (1) cấu trúc ty thể, (2) hệ gen ty thể và di
truyền gen ty thể, (3) Rối loạn cấu trúc/chức năng ty thể và các bệnh liên
quan.
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.1.1. Cấu trúc ty thể

Hình 1.1. Cấu trúc ty thể
Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn (Hình 1.1). Tùy
thuộc vào tế bào, ty thể có cấu trúc tổng thể khác nhau. Nhìn chung ty thể có
hình hạng phổ biến là hình que hoặc bầu dục với kích thước 5 - 10 µm x 2 – 3
µm. Ty thể có cấu trúc màng kép bao gồm màng ngoài ty thể và màng trong
ty thể. Hai màng này có chức năng hoàn toàn khác biệt với nhau. Lớp màng
ngoài ty thể bao trùm toàn bộ ty thể, tạo nên ranh giới ngoài của nó với tế bào
chất. Lớp màng trong ty thể tạo thành các nếp gấp gọi là mào ty thể (cristae)
hướng vào tâm. Mào ty thể là nơi chứa các bộ phận cần thiết cho quá trình hô
hấp và tổng hợp ATP (adenosine triphosphate). Các màng ty thể chia bào
quan này thành hai khoang khác biệt nhau: “khoang chứa chất cơ bản” nằm
bên trong ty thể, và “khoang liên màng” nằm giữa lớp màng ngoài và màng
trong. Màng ngoài chứa các Protein tạo kênh (Porin) cho phép tất cả các phân
tử < 5 kDa đi qua. Màng trong được cấu tạo phần lớn từ cardiolipin, là các
nếp gấp, được gọi là mào ty thể. Lớp màng trong chỉ cho phép thấm lọc một
số ion. “Khoang liên màng ty thể” có chứa các enzyme tham gia quá trình
phosphoryl hoá, oxy hoá và tổng hợp ATP. “Khoang chứa chất nền” bên

trong chứa các ribosome, DNA ty thể, tRNA (transfer RNA hay tRNA) và
nhiều loại enzyme cần thiết cho sự phiên mã và dịch mã hệ gen ty thể, ngoài
5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ra chất nền còn có chứa các acid béo, enzyme cần thiết tham gia vào chu trình
acid tricarboxylic (Cooper, 2000).
1.1.2. Chức năng của ty thể
Chức năng chính của ty thể là tạo năng lượng cho tế bào ở dạng ATP.
Tế bào sử dụng loại năng lượng này để duy trì sự sống và thực hiện các chức
năng của tế bào. Các phân tử carbohydrate, chất béo và protein chuyển hóa từ
thức ăn được vận chuyển vào ty thể. Thông qua quá trình oxy hóa và
phosphoryl hóa, năng lượng được chuyển đổi thành ATP, một dạng năng
lượng dự trữ của cơ thể. (Dahout-Gonzalez et al., 2006). Chu trình tạo ATP
diễn ra trong ty thể được thể hiện tại Hình 1.2.

Hình 1.2. Quá trình sinh tổng hợp ATP trong ty thể
Ngoài chức năng tạo năng lượng cho tế bào, ty thể còn có chức năng
trong quá trình gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis). Thông thường
ATP được tổng hợp sẽ được đi kèm với việc sử dụng oxy. Trong những điều
kiện bất bình thường như là sốt, ung thư, đột quỵ, hoăc khi có các bất thường
trong hoạt động ty thể, oxy được sử dụng nhiều hơn so với lượng oxy cần
thiết để tạo ATP. Vì vậy lượng oxy trong ty thể trở nên dư thừa và vì thế tạo
ra các gốc oxy hóa tự do cao (free radicals). Khi số lượng các gốc tự do này
quá cao, ty thể không còn khả năng thải loại độc tố thì chính các gốc tự do
này làm thay đổi chức năng của ty thể bằng cách thay đổi cấu trúc mtDNA,
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

cấu trúc protein và cấu trúc màng ty thể. Điều này dẫn tới kết quả chết tế bào
theo chương trình. Khi tế bào chết một cách bất bình thường do mất chức
năng ty thể thì chức năng của các cơ quan sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng (Wu
et al., 2013).
Ty thể còn có các chức năng chuyên biệt khác tùy thuộc vào loại tế bào
mang chúng. Ty thể tham gia vào các quá trình xây dựng, phân hủy, tái tạo
các sản phẩm cần thiết cho các hoạt động của tế bào biệt hóa. Ví dụ, một số
các thành phần tạo DNA và RNA được tổng hợp trong ty thể. Ty thể còn
tham gia tổng hợp một phần máu và hormone như estrogen và testosterone.
Ty thể cũng rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất và thải độc ammonia.
Vì vậy, nếu ty thể không hoạt động đúng chức năng, không những việc tạo
năng lượng bị ảnh hưởng mà các sản phẩm phục vụ cho các chức năng tế bào
chuyên biệt cũng bị ảnh hưởng (Hernandez-Resendiz et al., 2013).
1.1.3. Hệ gen ty thể
Như đã giới thiệu, ty thể có mang chất liệu di truyền (mtDNA) trong
“khoang chứa chất nền”. Phần lớn các động vật có xương sống có hệ gen ty
thể gồm 1000 – 5000 phân tử mtDNA dạng vòng (Goldstein và Shmookler
Reis, 1984). mtDNA tập trung trong “khoang chứa chất nền” và thường gắn
kết với các protein và lipid. Ở người, hệ gen ty thể là một phân tử mtDNA sợi
kép, cấu trúc vòng với kích thước 16.569 bp, mã hóa cho 13 polypeptide
(Hình 1.3).
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Hình 1.3. Cấu trúc hệ gen ty thể
Tất cả 13 polypeptide này đều là thành phần cấu trúc của phức hệ
phosphoryl hóa oxi hóa phức tạp (OXPHOS), bao gồm 7 tiểu đơn vị của phức

hệ I (complex I), một tiểu đơn vị của phức hệ III (complex III), 3 tiểu đơn vị
của phức hệ IV (complex IV), và hai tiểu đơn vị của phức hệ V (complex V).
Ngoài các gen mã hóa protein, mtDNA còn mã hóa cho 22 phân tử RNA vận
chuyển và 2 phân tử ribosome RNA 12S và 16S (12S rRNA và 16S rRNA).
Do có sự phân bố không đồng đều của các nucleotide Guadinine (G) và
Cytosine (C) nên hai sợi mtDNA được phân biệt với nhau bằng chuỗi nặng
(Heavy strand hay H-strand) và chuỗi nhẹ (Light strand hay L-strand). Tất cả
các rRNA, 12 trong số 13 polypeptide, và 14 trong số 22 tRNA được mã hóa
bởi các gen nằm ở sợi nặng. Các gen mã hóa (exon) thậm chí còn chồng chéo
lên nhau, và các mã kết thúc (termination codons) chỉ được tạo ra bằng cách
bổ sung thêm Adenine (A) vào sợi mRNA ở bước polyadenine hóa trong quá
trình phiên mã. Thêm vào đó, mã di truyền của gen ty thể có một số khác biệt
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

so với mã di truyền của gen nhân. So sánh mã di truyền của gen nhân và gen
ty thể được tóm tắt trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. So sánh mã di truyền của gen nhân và gen ty thể (Moraes et al., 2002).

Ở động vật có xương sống nói chung và ở người nói riêng, mtDNA
mang rất ít các gen không mã hóa (intron). Chỉ có khoảng 7% gen ty thể
không mã hóa cho protein, rRNA và tRNA. Tuy nhiên, 90% số gen ty thể
không mã hóa lại nằm trong vùng điều khiển hay D-loop (Hình 1.3). Phần lớn
các trình tự liên quan tới quá trình nhân đôi của mtDNA hay quá trình phiên
mã đều nằm trong hoặc gần vùng D-loop. Các protein kết hợp với các mặt
bám DNA, tạo nên các phức hợp DNA-protein với chức năng điều khiển sự
nhân đôi và dịch mã (Clayton, 2003). Đoạn D-loop có kích thước khoảng 1.1
kb. mtDNA có một số vùng bất biến bao gồm vùng promoter và vùng CSB
(Conserved Sequence Block) I, II và III. Vì các trình tự bất biến này đều nằm

ở vùng D-loop và được bảo tồn ở rất nhiều loài động vật có xương sống nên
chúng được cho rằng có vai trò quan trọng trong quá trình nhân đôi của
mtDNA. Ví dụ, CSB I có vị trí ngay gần vùng khởi đầu của quá trình nhân
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

đôi chuỗi nặng (Walberg and Clayton, 1981). Thêm nữa, vùng D-loop còn
chứa các vùng siêu biến. Những vùng này có tần suất đột biến cao hơn đáng
kể so với các vùng khác của hệ gen ty thể (Greenberg et al., 1983). Có một số
điểm trong vùng này được coi là điểm nóng (hot spot) của đột biến
(Stoneking, 2000). Hai vùng siêu biến HV1 (vị trí 16024-16383) và vùng
HV2 (vị trí 57-372) được biết đến như là nơi tập trung các điểm nóng đột
biến. Hai vùng siêu biến HV1 và HV2 đã được sử dụng trong rất nhiều trong
nghiên cứu pháp y (Ginther et al., 1992). Quan trọng hơn, những vùng siêu
biến cũng như toàn bộ vùng D-loop gần đây đã được phát hiện có nhiều liên
quan tới ung thư, các bệnh tim mạch và bệnh của khu thần kinh trung ương
(Miyazono et al., 2002). Chức năng và đột biến gen ty thể liên quan tới bệnh
học sẽ được thảo luận chi tiết hơn ở những phần tiếp theo.
1.1.4. Sự phân chia ty thể và quá trình sao chép gen ty thể
Ty thể tái bản nhiều lần như các tế bào vi khuẩn. Đầu tiên ty thể phải
tái bản DNA của chúng, sau đó chúng to lên gấp đôi, trải qua sự sinh sản nhân
đôi và lớp gấp nếp bên trong sẽ co lại ở chính giữa kéo theo màng ngoài co
lại, cuối cùng chúng tách hẳn thành 2 ty thể mới hoàn toàn giống ty thể mẹ
(Berger and Yaffe, 1996).
Gen ty thể có khả năng tự sao chép và không phụ thuộc vào sự phân
chia của tế bào (Clayton, 2003). Tuy nhiên, sự biểu hiện gen và bảo trì
mtDNA cũng phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố được mã hóa bởi gen nhân.
Những yếu tố này được tổng hợp trong tế bào chất sau đó được vận chuyển
vào ty thể qua các kênh vận chuyển chuyên biệt (Attardi and Schatz, 1988).

Dù đã được phát hiện từ rất lâu và các nghiên cứu về sao chép gen ty thể đã
thu được những ghi nhận đáng kể nhưng cơ chế sao chép gen ty thể vẫn còn
chưa được hiểu một cách đầy đủ và thống nhất (McKinney and Oliveira,
2013). Tới nay, cơ chế sao chép mtDNA được giải thích theo ba mô hình khác
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nhau: mô hình strand-displacement (Evan and Vousden); mô hình RNA
incorporated throughout the lagging strand (RITOLS) và mô hình leading and
lagging strand-coupled (LLSC) (McKinney and Oliveira, 2013) (Hình 1.4).

Hình 1.4. Sự phân chia ty thể
Với mô hình strand-displacement (Hình 1.5A), việc sao chép của sợi
nặng được bắt đầu tại vùng mang gen không mã hóa của D-loop (Trifunovic
et al.) và kéo dài liên tục. Việc tổng hợp sợi nặng (H) liên tục làm cho sợi
nặng (H) và sợi nhẹ (L) tách rời xa nhau cho đến khi điểm khởi đầu của sợi
nhẹ (O
L
) lộ ra, cho phép khởi đầu sao chép sợi nhẹ. Quá trình sao chép cả sợi
nặng và sợi nhẹ tiếp tục tiếp diễn. Theo mô hình này, toàn bộ quá trình sao
chép đi theo một chiều nhất định, liên tục, không cân đối và không đồng bộ
(Brown et al., 2005). Từ khoảng những năm 2000, hai mô hình còn lại được
đề xuất và phần nào thách thức tính hợp lệ của mô hình strand-displacement.
Bằng cách sử dụng điện di hai chiều (two-dimensional agarose gel
electrophoresis hay 2DAGE) và một số enzyme sửa đổi, các nhà khoa học đã
đề xuất mô hình khác để giải thích cơ chế sao chép mtDNA. Trong mô hình
RITOLS (Hình 1.5B), RNA gắn kết với sợi nhẹ mới được tổng hợp, sau đó
liên kết với sợi nặng bằng liên kết hydro. Quá trình sao chép diễn ra theo một
chiều nhất định từ vùng D-loop, qua bước trung gian là phiên mã RNA và sản

phẩm cuối cùng là DNA hoàn chỉnh (Yang et al., 2002). Khác với mô hình
SD, mô hình LLSC đề xuất rằng quá trình sao chép sợi nặng và sợi nhẹ diễn
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ra đồng thời (Hình 1.5C). Việc khởi đầu sao chép diễn ra trên diện rộng tại
vùng chứa trình tự khởi đầu sao chép, sau đó quá trình sao chép diễn ra đồng
thời nhưng theo hai chiều đối ngược nhau. Sao chép mtDNA chỉ dừng lại tại
vùng D-loop (Bowmaker et al., 2003). Ở cả ba mô hình, quá trình sao chép
mtDNA cần rất ít protein chức năng bao gồm các tiểu đơn vị DNA
polymerase γ, mtDNA helicase Twinkle, sợi đơn mtDNA có trình tự gắn kết
protein, và mtRNA polymerase (với chức năng chính là mtDNA primase).
Đột biến gen mã hóa cho các protein này liên quan tới các bệnh ở người và
quá trình lão hóa sớm.

Hình 1.5. Cơ chế sao chép mtDNA
1.2. Di truyền gen ty thể và đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học
1.2.1. Di truyền gen ty thể
Trong nhiều thập niên nghiên cứu, các nhà khoa học cho mtDNA chủ
yếu được di truyền từ mẹ (99,99% mtDNA). mtDNA trong tinh trùng của
người cha được coi là bị phân hủy ngay lập tức sau khi trứng được thụ tinh
(Berger and Yaffe, 1996). Các nghiên cứu về cây phả hệ cũng chỉ rõ mối liên
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

quan của các bệnh ty thể và di truyền theo dòng mẹ (Chen and Butow, 2005).
(Hình 1.6).

Hình 1.6. Di truyền ty thể theo dòng mẹ
1.2.2. Đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học
Ty thể là một bào quan cần thiết đối với tất cả các tế bào nhân chuẩn.
Vì vậy các bất thường về cấu trúc và chức năng ty thể có thể ảnh hưởng tới
nhiều loại tế bào và mô khác nhau và mức độ biểu hiện bệnh cũng rất đa dạng
(Bảng 1.2). Vì mức độ đa dạng như vậy nên việc xác định đột biến mtDNA có
liên quan tới sức khỏe/bệnh con người là vô cùng khó khăn. Tuy nhiên bằng
những phân loại dữ liệu lâm sàng theo nhóm thì ta cũng có thể phân loại bệnh
ty thể như sau: các hội chứng rối loạn ty thể truyền thống, các nguy cơ phát
triển hội chứng lâm sàng liên quan tới đột biến của gen ty thể, các bệnh liên
quan lão hóa sớm do tác động của sự bất thường gen ty thể.
Bệnh ty thể có thể do đột biến trực tiếp gen ty thể nhưng cũng có thể
gián tiếp do rối loạn chức năng của gen nhân tham gia điều khiển quá trình
trao đổi chất các gen ty thể. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi chỉ tập
trung đề cập tới đột biến gen ty thể. Các bệnh liên quan đến đột biến gen nhân
tham gia điều khiển hoạt động của ty thể có thể tham khảo tại tài liệu khác
(Shoubridge, 2001). Dù hệ gen ty thể có kích thước vô cùng nhỏ so với hệ gen
nhân, đột biến gen ty thể là một trong nhưng nguyên nhân quan trọng trong
các bệnh di truyền. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về ty thể và di
Di truyền theo dòng mẹ
Di truyền theo dòng mẹ
13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

truyền ty thể đã đưa ra khá nhiều dẫn chứng về mối quan hệ giữa di tuyền đột
biến ty thể và biểu hiện bệnh, và đã xác định được nhiều đột biến mtDNA liên
quan quá trình lão hóa và ung thư. Cũng giống như gen nhân, đột biến gen ty
thể có thể ở dạng đột biến đứt đoạn, đột biến thay thế và đột biến thêm đoạn.
Các đột biến đứt đoạn có nhiều khả năng bị loại bỏ khỏi quần thể do hiệu ứng

gây độc của nó. Nếu tồn tại được thì đột biến đứt đoạn cần có sự bổ trợ của
yếu tố khác (ví dụ: gen nhân). Rất nhiều đột biến thay thế trong mtDNA liên
quan đến bệnh, chẳng hạn như các đột biến liên quan đến các bệnh về cơ, não,
đột quỵ, nhiễm acid lactic (MELAS). MELAS có thể xem như là sự sai khác
mtDNA thường gặp nhất, đây là loại đột biến điểm A => G ở vị trí 3243 trong
gen mã hoá cho tRNALeu (Goto và cs., 1990). Nhiều trường hợp tái sắp xếp
của mtDNA cũng đã được xác định (Mitomap, 2001) bao gồm sự đứt đoạn,
nhân đôi đoạn, thêm đoạn, tổ hợp của tất cả các loại đột biến này (Poulton và
Holt., 1994 ; Kajander và cs. 2000). Những đột biến này tạo ra sự đa dạng về
các triệu chứng ảnh hưởng đến hệ cơ bắp, tim, hệ thần kinh trung ương và các
mô khác (Zeviani và cs., 1998). Đột biến đứt đoạn đầu tiên được tìm thấy
trong cơ bắp của bệnh nhân mắc bệnh về cơ do ty thể gây ra đã được Holt và
cs phát hiện, công bố năm 1988, và sau đó các loại đột biến trên đã được xác
định trong bệnh nhân mắc bệnh (Keams – Sayre, KSS), liệt mắt tăng dần mãn
tính (Chronic Progressive ophthalmoplegia, CPEO), bệnh tiểu đường mellitus
di truyền theo dòng mẹ, bệnh cận thị.
Rất khó có thể xác định chính xác tần suất bệnh liên quan đến đột biến
ty thể vì sự đa dạng trong biểu hiện bệnh và sự đa dạng trong các tác nhân gây
đột biến. Tuy nhiên, có những nghiên cứu tập trung vào đột biến điểm và chỉ
ra được tần suất bệnh ty thể. Ví dụ, nghiên cứu đột biến điểm (3243 A>G) ở
Phần Lan chỉ ra rằng 1/6000 cá thể mang bệnh liên quan đột biến này trong
khi đó tần suất này ở Anh cao hơn nhiều (1/3500) (Majamaa et al., 1998).
14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Ngày càng có nhiều bằng chứng ở cả nghiên cứu trên động vật (Trifunovic et
al., 2004) và trên người (Muller-Hocker, 1990) về đột biến mtDNA và rối
loạn chức năng ty thể có tham gia vào quá trình lão hóa và các bệnh lão hóa
(ví dụ, tiểu đường) và ung thư và cs, 2003; Taylor and Turnbull, 2005). Tới

nay, mức độ công nhận mối liên quan đột biến ty thể và bệnh học ngày càng
cao do chúng ta đã có thể giải được trình tự genome ty thể (McFarland và cs.,
2004). Riêng về khía cạnh nghiên cứu ung thư, từ năm 1998 Vogelstein và
cộng sự đã công bố rằng 7 trong số 10 dòng tế bào ung thư đại trực tràng có
mang đột biến ty thể, và những đột biến này có xuất hiện ở các mô ung thư
(Polyak và cs., 1998). Kể từ phát hiện này, rất nhiều các nghiên cứu khác đã
tập trung khảo sát ở cả các u cứng và ở các bệnh nhân ung thư máu và nhận
thấy gen ty thể có tần xuất đột biến cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng (Fliss
và cs., 2000). Các đột biến của mtDNA đã được phát hiện ở các bệnh ung thư
như ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ và đầu, ung
thư thận, gan, phổi, dạ dày và ung thư máu ác tính (Luciakova, Kuzela 1992;
Bianchi và cs., 1995; Horton và cs., 1996; Polyak và cs., 1998; Tamura và cs.,
1999; Fliss và cs., 2000). Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là ung thư phổi,
vì vậy chúng tôi sẽ trình bày chi tiết hơn về căn bệnh này và mối quan hệ với
đột biến gen ty thể ở phần tiếp theo.
1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ phổi và đột biến gen ty thể
1.3.1. Giới thiệu chung về ung thƣ
1.3.1.1. Định nghĩa ung thu và dịch tễ học ung thƣ
Ung thư (thuật ngữ y học: khối u ác tính) là một loại bệnh mà một
nhóm tế bào biểu thị sự tăng sinh không được kiểm soát (các tế bào phân chia
vượt quá giới hạn bình thường), xâm nhập và tiêu diệt các mô liền kề nó, đôi
khi di căn (xâm nhập vào các vùng khác trên cơ thể theo đường bạch huyết
hoặc máu). Ung thư ảnh hưởng tới tất cả mọi lứa tuổi. Tuy nhiên nó có nguy
15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

cơ tăng cao theo độ tuổi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO),
ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai ở khu vực các nước phát triển và
là một trong ba nguyên chính gây tử vong ở các nước đang phát triển. Với tốc

độ lão hóa cao như hiện nay, Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế
(International Agency for Research on Cancer – IARC) dự báo đến năm 2020
sẽ có khoảng 16 triệu trường hợp ung thư mới (IARC, 2013).
1.3.1.2. Cơ chế và nguyên nhân gây ung thƣ

Hình 1.7. Cơ chế phát triển ung thư
Hầu hết các tế bào ung thư đều bằng cách này hay cách khác có được những chức năng
liên quan tới phát triển bệnh: (1) Nhạy cảm với tín hiệu sinh trưởng; (2) Không nhạy cảm
với tin hiệu ức chế sinh trưởng; (3) có khả năng di chuyển và di căn, (4) khả năng nhân tế
bào không giới hạn, (5) có khả năng tạo mạch bền vững, và (6) có khả năng trốn tránh sự
chết tế bào theo chương trình.
Quan điểm hiện nay về nguyên nhân gây ra khối u ác tính là do có đột
biến của vật liệu di truyền trong các tế bào, dẫn đến sự nhân đôi tế bào không
kiểm soát. Ở những điều kiện đặc biệt, những tế bào ung thư di chuyển, xâm
nhập vào hệ tuần hoàn, và được phát tán tới các mô và cơ quan khác; và kết
quả là các khối u (lành tính hoặc ác tính) được hình thành. Hầu hết (nếu như
không muốn nói là tất cả) các tế bào ung thư đều bằng cách này hay cách
khác có được khả năng liên quan tới phát triển bệnh như: có khả năng sinh
16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trưởng không giới hạn; có chức năng di căn, tạo mạch máu và duy trì độ bền
vững của mạch máu; và có khả năng trốn tránh sự chết tế bào theo chương
trình (Hình 1.7).
Một mặt, các tế bào ung thư rất nhạy cảm với các tín hiệu sinh trưởng.
Bình thường các tế bào cần có tín hiệu sinh trưởng (growth signals – GS)
trước khi chúng chuyển từ giai đoạn nghỉ sang giai đoạn phân chia tế bào.
Những tín hiệu này được truyền vào tế bào bằng các thụ thể xuyên màng có
khả năng tương tác với các phân tử truyền tín hiệu bao gồm: các phân tử sinh

trưởng tế bào, các thành phần ngoại bào, các phân tử tham gia kết dính/tương
tác tế bào. Tới nay, không có loại tế bào nào sinh trưởng mà không cần các
phân tử hỗ trợ nói trên. Rất nhiều gen liên quan tới ung thư hoạt động theo cơ
chế làm nhiễu loạn quá trình/tín hiệu sinh trưởng bình thường. Các tế bào ung
thư tự phát ra rất nhiều tín hiệu sinh trưởng, vì thế sự sinh trưởng của chúng
không còn phụ thuộc vào các yếu tố sinh trưởng ngoài môi trường như những
tế bào bình thường. Điều này làm rối loạn nghiêm trọng tới quá trình trao đổi
chất và kết quả là tế bào ung thư bị mất chức năng sinh trưởng bình thường,
thay vào đó là sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến mất chức năng
bình thường của các mô và cơ quan liên quan. Mặt khác, các tế bào ung thư
lại không nhạy cảm với tín hiệu ức chế sinh trưởng. Ở trong các mô bình
thường có rất nhiều các tín hiệu ức chế sinh trưởng để duy trì chế độ tĩnh và
cân bằng chuyển hóa. Những tín hiệu này bao gồm các chất ức chế sinh
trưởng hòa tan, các chất ức chế cố định ngoại bào hoặc trên bề mặt của các tế
bào xung quanh. Những chất ức chế này bám vào các thụ thể trên tế bào và
phát tín hiệu vào nội bào. Những tín hiệu này ức chế sinh trưởng tế bào theo
hai cách: tế bào có thể bị ép chuyển từ pha sinh trưởng sang pha tĩnh (G
0
),
hoặc pha sinh trưởng tế bào bị kết thúc sớm và các tế bào bắt buộc bị chuyển
sang pha tĩnh. Do rối loạn cả chức năng phản ứng với tín hiệu điều khiển sự
17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nhân lên của tế bào mà các tế bào ung thư có khả năng nhân lên một cách
không có giới hạn.
Một trong những đặc điểm quan trọng trong quá trình phát triển ung
thư là khả năng trốn tránh sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của tế
bào ung thư. Sự chết theo chương trình của tế bào diễn ra theo một qui trình

sinh học và là một quá trình quan trọng giúp cân bằng giữa phân chia tế bào
và sự chết của tế bào nhằm bảo toàn số lượng tế bào cho cơ thể (Cheng et al.,
2004). Quá trình chết theo chương trình diễn ra qua hai con đường: qua các
thụ thể chết (lộ trình bên ngoài) và qua ty thể (lộ trình bên trong).


Hình 1.8. Quá trình chết theo chương trình của tế bào
Quá trình chết của tế bào theo chương trình diễn ra theo thứ tự và
không tác động và lan truyền bừa bãi tới các tế bào xung quanh ( Hình 1.8). Ở
cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một sự khởi phát làm thủng các tế
bào và sau đó phá vỡ những mối liên hệ tế bào với tế bào. Các tế bào co tròn
lại, màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất. Các
Chết tế bào theo chƣơng trình
Tế bào bình thƣờng
Màng tế bào bị vỡ
Tế bào bị kéo dãn và nhân bị cô đặc
Hình thành quả thể
apoptotic
Phân hủy
quả thể
apoptotic
Nhân bị phá hủy và
tiếp tục quá trình vỡ
tế bào