Tiểu luận Phương pháp PCR và ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI
KHOA SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN
PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG
Chuyên ngành: Lý luận và phương pháp dạy học Sinh học
Người hướng dẫn: GS.TS. Nguyễn Thành Đạt
PGS.TS. Đặng Hữu Lanh
Sinh viên thực hiện: Cao Thị Dung
Lớp: Sinh CH-K24
Hà Nội-2015
1
2
3
4
MỞ ĐẦU
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) do Kary
Mullis phát hiện ra năm 1985. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một
đoạn AND nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạn
chế. Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình tái
bản AND. Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc
tách dòng và thao tác với AND dễ dàng và hiệu quả hơn.
PCR là kỹ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử. Việc sử
dụng kỹ thuật PCR trong lĩnh vực AND tái tổ hợp đã tạo ra một bước tiến mang
tính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh học phân
tử nói chung, nhờ việc cho phép phân lập, xác định các gene và đi sâu nghiên cứu
chức năng cũng như biểu hiện của gen trong quá trình phát triển, hoặc phản ứng của
gen đối với các điều kiện môi trường. Nó cho phép ta tiến hành những nghiên cứu
mà trước đây không có khả năng thực hiện. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền ở người, di
truyền quần thể, phân tích pháp y, …

Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại
về số lượng vật chất di truyền cần có. Các phương pháp tạo dòng invitro đã biết tuy
giải quyết được vấn đề về số lượng nhưng lại đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian
dài. Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại invitro có chọn lọc, trong số đó
nổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo
dòng cổ điển, mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn.
Chính vì vậy tôi đã quyết định nghiên cứu đề tài “Phương pháp PCR và
ứng dụng”.
Đề tài được nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về các nguyên tắc,
chỉ tiêu ảnh hưởng, ứng dụng và hạn chế của phương pháp PCR. Từ đó có những
kiến thức cơ bản phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài của luận văn cũng như việc
tiến hành các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm sau này.
Để đạt được điều đó, đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu như
phương pháp thu thập, xử lý thông tin, phương pháp phân tích, tổng hợp, hệ thống
hóa thông tin…
Ngoài phần Mở đầu, Kết luận, bài tiểu luận bao gồm những nội dung sau:
1
1. Sự phát hiện ra phương pháp PCR.
2. Phương pháp PCR và ứng dụng.
2
1. SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR
1.1. Khái niệm
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được gọi là
“phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen”. PCR là một kỹ thuật
phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn
DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men [7].
Một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà
không cần đưa vào tế bào vi khuẩn [3]. Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng hợp
invitro sử dụng DNA polymerase và các oligonucleotide (các mồi – primers). Đó
chính là kết quả tuyệt vời của phản ứng PCR. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở

một vùng bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự
nucleotide ở hai đầu đoạn mạch DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp
oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mồi oligo tạo liên kết với từng sợi đơn.
Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA invitro nhờ enzyme DNA
polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA ban đầu làm
khuôn rất nhỏ (cỡ 10
-3
μg) [3].
Như vậy, PCR là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn
DNA đặc thù nhờ công hiệu của hai mồi oligonucleotide gắn vào hai sợi đôi của
đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.
1.2. Lịch sử của phương pháp PCR
Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở
tiểu bang California, trên đường lái xe dọc theo bờ
biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một
nhà sinh hóa học rất bình thường, làm việc cũng tại
một phòng thí nghiệm rất bình thường. Ý tưởng này
khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã
làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử
và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel
danh giá.
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã
đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7
năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA
3
có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép
bởi enzyme DNA polymerase [7].
DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức
năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và
tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản

DNA được thực hiện trong ống nghiệm (invitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi
đơn khi đun nóng ở 96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy
vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình
PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một
lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase
lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên
110 °C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao)
và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi
DNA [7]. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình
sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được
từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong
thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong
quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai
exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có
cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột
biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu
có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một
phần. Đó có thể là một gen đơn. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy
một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base = 1000 cặp base).
Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thước lên đến 40kb, ít hơn nhiều
so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào Eukaryote (ví dụ như tế bào người chứa hơn
3 tỷ cặp base) [6].
4
1.3. Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học
phân tử
1.3.1. Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ
Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầu

tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Nhờ sự sử dụng các men
polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích
được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở
nên đặc hiệu hơn. Cho đến nay đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được
phát hiện và tổng hợp ra. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt
như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus
lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu). Có những men polymerase chịu nhiệt
được tổng hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các
vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vaent (exo). Có những men polymerase chịu
nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung
(3’-5’ exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu. Nhờ vậy mà người dùng có
rất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình.
Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus
1.3.2. Máy chu kỳ nhiệt
Trước đây khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện
bằng cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có
nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Sau đó công việc
5
bằng tay nhàm chán va nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng
kềnh và đắt tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR
được thực hiện trong các buồng ủ PCR của
máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt.
Một cách tổng quát, máy luân nhiệt bao gồm
các bộ phận chính như sau:
+ Một bàn phím đơn giản để lập các chương
trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy
thực hiện.
+ Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình
đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đến
buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu

kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện.
+ Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ
vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay
hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Để làm thay đổi được nhiệt độ trong
buồng ủ, có hai phương pháp:
(1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát
nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh. Với phương
pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy
hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào.
(2) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu
quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử.
6
2. PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ
2.1. Sự khác nhau giữa tái bản DNA trong tế bào và trong invitro
Trong tế bào, DNA được tái bản dựa theo nguyên tắc bảo tồn, tức là mỗi
phân tử con được hình thành từ một mạch cũ và một mạch mới, ở mạch ra chậm
5’→3’ theo nguyên tắc nửa gián đoạn là hình thành các đoạn okazaki, và theo
nguyên tắc bổ sung A-T, G-C. Qúa trình nhân đôi mở đầu nhờ enzyme tháo xoắn.
Sự tái bản bắt đầu bằng sự tổng hợp mồi RNA. Qúa trình tái bản DNA trong tế bào
diễn ra trong điều kiện nhiệt độ thường, mang tính chất chính xác rất cao.
Còn tái bản DNA trong invitro lại diễn ra
như sau: Phải đun nóng DNA khuôn đến gần
100
0
C và phải dùng DNA-polymerase ưa nhiệt
(chịu nhiệt) để tác động đến mạch 5’→3’ ở 32-
80
0
C, tốc độ 150Nu/s. Hơn nữa cần có đoạn
mồi ngắn chặn hai đầu của đoạn nhân lên, cả

hai mạch đều có thể dùng làm khuôn nếu đoạn
mồi được cung cấp cho cả hai mạch. Sau n phản
ứng, về lý thuyết sẽ được 2
n
bản sao DNA nằm
giữa hai đoạn mồi. Tái bản xáy ra kém chính
xác hơn trong tế bào, sai sót khoảng 10
-4
do Taq
polymerase.
2.2. Nguyên tắc và các giai đoạn của phương pháp PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được
hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nú ta cung cấp
hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ
tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình
tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ
sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược
(antisens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là so với chiều phiên mã của gen.
7
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba giai đoạn:
(1) Giai đoạn biến tính (denaturation): Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi
DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA.
Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo
mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2
phút [7].
Một số chú ý trong giai đoạn này:

+ Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thẻ làm tăng tính đặc hiệu
của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase.
+ Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ
biến tính 95-98
0
C. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tính
ngắn trước từng chu kỳ nhiệt.
+ Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến 5
phút. Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA
polymerase sau khi biến tính ban đầu.
+ Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thểu thời gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng
lượng sản phẩm, thông thường từ 10-30s.
+ Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCR
machine, thermocylcer) là khác nhau, phụ thuộc hãng sản xuất.
(2) Giai đoạn bắt cặp (anealation): Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ
thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ
giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C
(45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không
gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
Một số chú ý trong giai đoạn này:
+ Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm
thấp nhất +3
0
C.
8
+ Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấp
nhất, có thể dùng gradient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu
(khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0,5
0
C).

+ Đối với các cặp Tm cao hoặc tự bắt cặp, có loop thì có thể khắc phục bằng PCR
hai bước (95
0
C và 68
0
C).
(3) Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống.
Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt
độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào
cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại, như một quy tắc
1000bp/1 phút.
Những chú ý trong giai đoạn kéo dài:
+ Nhiệt độ kéo dài thường ở 72
0
C, tuy nhiên hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase vẫn
xảy ra ở nhiệt độ 68
0
C.
+ Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều dài sản
phẩm và loại template. Đối với DNA đồng chất (plamid, lambda hoặc BAC DNA)
thì tốc độ có thể đạt tới 15 s/kb; đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độ
thường 30s-1min/kb.
Cuối cùng sau một số chu kỳ, số lượng sợi DNA có kích thước duy nhất
chiếm ưu thế tuyệt đối trong phản ứng.
N = (2
n
– 2n). x .Trong đó: n: Số chu kỳ.
2n: Số phân tử có chiều dài không xác định.
x: Số phân tử khuôn ban đầu.
N: Số sợi tổng hợp được trong phản ứng.

2
n
: Số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai
mồi.
9
Hình 1: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ.
(1) Nóng chảy ở 96°C. (2)Gắn mồi ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase).
(4)Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu
trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.
Hình 2: Các chu kỳ của kỹ thuật PCR
10
2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose
Điện di agarose thường được sử dụng để xác định sản phẩm PCR dựa trên
khả năng phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau khi sản phẩm PCR di
chuyển qua mạng lưới các vi lỗ có trong gel agarose.
Do phân tử DNA tích điện âm cao, khi phân tử DNA được đặt dưới một điện
trường xác định, những phân tử DNA tích đện âm này sẽ di chuyển về phía cực
dương của điện trường. Trong trường hợp điện di agarose, chúng sẽ di chuyển qua
gel agarose được đặt trong dung dịch đệm điện di. Các phân tử càng nhỏ có khả
năng di chuyển càng nhanh trong gel agarose về phía cực dương so với các phân tử
DNA lớn hơn. Nguyên tắc này cho phép kỹ thuật điện di phân tách các đoạn DNA
có kích thước khác nhau.
Hình 3: Bộ sản phẩm điện di
Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đặt mẫu (loading gel) chuyển vào
các giếng trên gel agarose để thực hiện phân tách dưới tác động của điện trường.
Gel agarose có chứa sẵn Ethidium bromid, vì thế khi DNA di chuyển trong gel
agarose sẽ tạo liên kết với Ethidium bromide.
Dung dịch đặt mẫu (loading gel) chứa chất có tỷ trọng nặng (như đường
sucrose hoặc glycerol) để lôi cuốn DNA xuống đáy giếng trên bản gel agarose và
ngăn cản không cho DNA khuếch tán vào dung dịch đệm điện di. Ngoài ra, trong

dung dịch đặt mẫu còn chứa chất chỉ thị tích điện âm. Chất chỉ thị di chuyển cùng
với DNA giúp cho dễ dàng ước lượng sự di chuyển của DNA trong bản gel. Chất
11
chỉ thị thường dùng là Xylene cyanol và Bromophenol blue. Chúng di chuyển cùng
với những phân tử DNA có chiều dài tương ứng lần lượt là 5000bp và 300bp.
Đệm điện di: Đệm điện di giúp ổn định các điều kiện môi trường, cho phép
quá trình di chuyển của DNA được ổn định trong suốt quá trình điện di. Có một vài
loại đệm điện di thường dùng trong phân tích điện di agarose như: Tris acetate
EDTA (TAE), Tris/Borate/EDTA (TBE). Khả năng đệm của dung dịch đệm TAE
thấp hơn so với TBE. Tuy nhiên, TAE lại cho phép phân tách tốt đối với những
đoạn DNA lớn hơn. Điều này đồng nghĩa với việc phải dùng điện thế thấp hơn và
mất thời gian điện di nhiều hơn.
Kết thúc quá trình điện di, bản gel sẽ được đặt dưới tác động của tia UV, các
đoạn DNA sản phẩm PCR sau khi phân tách theo kích thước sẽ được hiển thị dưới
dạng băng vạch màu vàng sáng tại những vị trí khác nhau tương ứng với kích thước
chiều dài của chúng.
Hình 4: Phân tích sản phẩm sau khi chụp UV
Ethidium brommide có sẵn trong bản gel sẽ chèn vào giữa các base nitơ của
phân tử DNA dẫn đến chúng bám vào phần trung tâm của phân tử DNA. Sự phát
sáng là do phức hợp DNA-Ethidium bromide phát ra khi chịu tác động của tia UV.
2.4. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Một phản ứng PCR điển hình bao gồm các thành phần sau:
+ DNA (0,01-0,1μg)
+ Mồi 1 (20pmol)
+ Mồi 2 (2pmol)
12
+ Tris-HCl (20Mm; Ph 8,0)
+ MgCl
2
(2mM)

+ KCl (25mM) hoặc KCl (10mM) và (NH
4
)
2
SO4 (10mM)
+ Deoxynucleotide triphosphat (50μg mỗi loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
+ DNA polymerase chịu nhiệt (2 đơn vị)
+ Tổng thể tích phản ứng 50-100μl
2.4.1. DNA khuôn
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế
bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1μg xuống còn
100ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm
lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm
phụ không mong muốn. Gần như bất kỳ loại DNA nào, dù là mạch thẳng, mạch
vòng, DNA plasmid, DNA hệ gen, cDNA,… đều có thể làm khuôn cho phản ứng
PCR. DNA láy từ nguồn nào không quan trọng, yêu cầu duy nhất là vị trí gắn các
mồi và trình tự giữa chúng còn nguyên vẹn. Đã có những mẫu DNA mà tuổi đến
hơn 7000 năm vẫn được sử dụng rất thành công trong các phản ứng PCR.
2.4.2. Mồi và nhiệt độ lai
Đoạn mồi là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài
chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và
đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi này biens tính thành sợi đơn. Trong
thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính: Một là quyết định nên tính đặc hiệu
của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là
chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp trên chuỗi DNA khác thì sản
phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. Vai trò thứ hai là khởi
động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung
cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho
một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng

PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là primer set, trong đó có một mồi lên gọi là
up-stream primer và một mồi xuống gọi là down-steam primer. Cặp mồi này quyết
định kích thước của sản phẩm PCR. Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau
13
bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng
gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu.
Vệc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân
thủ một số quy tắc sau [5].
- Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
“xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp
bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi.
- Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide
của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng bới
các trình tự lặp lại trên gen.
2.4.3. Enzyme
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì
đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm
enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy,
nhiệt độ lại thấp khiến sự ký sinh rất cao ). Phương pháp PCR chuyển sang một
bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách
từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này – Taq polymerase
không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá
trình phản ứng.
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với
nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn.
VentTM DNA polymerase cô lập từ Thermococcus litoralis – một vi khuẩn
cổ tìm thấy ở dưới đáy đại dương tại nhiệt độ đạt tới 98
0
C. Enzyme này có tính chịu

nhiệt cao hơn Taq DNA polymerase, coa khả năng nhân bản các sản phẩm có kích
thước lên đến 13kb. Tính trung thực trong nhân bản của VentTM DNA polymerase
cao do enzyme có thêm hoạt tính sửa sai 3’-5’ exonuclease. Pfu DNA polymerase
được cô lập từ vi khuẩn cổ đại dương Pyrocccus furiosus hay Ultma DNA
polymerase (từ Thermotoga maritima) cũng có tính trung thực cao nhờ hoạt tính
tương tự.
Tth polymerase là một enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả
năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion
14
Mn
++
; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg
++
, Tth pol lại xúc tác phản
ứng khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
2.4.4. Một số yếu tố khác
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20-200 μΜ/mỗi loại
nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng
trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase [1].
Trong môi trường, một số ion có ảnh hưởng đến PCR. Chẳng hạn như, nồng
độ ion Mg
++
qúa thấp sẽ làm giảm hieuj quả nhân bản, còn quá cao sẽ tạo sản phẩm
không đặc hiệu. Nếu Mg
++
kích thích phản ứng tổng hợp DNA thì KCl lại ức chế
quá trình khuếch đại đoạn DNA dài [3].
Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào
hệ buffer (dung dịch đệm) được sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại
buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. Dung dịch đệm thường

chứa muối đệm Tris HCl 10mM, KCl 50mM và MgCl
2
21,5mM. Ngoài ra còn có
thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm
tween hay formamide [6].
Phản ứng PCR còn phụ thuộc vào hàm lượng GC và nhiệt độ nóng chảy Tm.
Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC ở mức có thể được. Những
oligonucleotide có 20 base với hàm lượng 50% GC thì có nhiệt độ nóng chảy Tm
vào khoảng 56-62
0
C sẽ tạo điều kiện để qúa trình ủ tốt nhất. Nếu Tm càng lớn thì
hiện tượng gắn primer nhầm càng cao. Do đó, khi thiết kế primer cần chú ý đặc biệt
đến hàm lượng GC.
Đối với trình tự ngắn hơn 20 mer, có thể sử dụng công thức tính Tm liên hệ
với các base: Tm = 4(G+C) + 2(A+T) (trong khi các primer đại hơn, công thức này
có giá trị gần đúng) [6].
Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR.
Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu, số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả
khuếch đại giảm hẳn vì: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự
xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng; hơn nữa các bản sao vừa được tổng
hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau Số chu kỳ cho một phản ứng tùy
15
thuộc số lượng bản mẫu ban đầu. Ví dụ, nếu số lượng bản mẫu là 10
5
thì cần 25-30
chu kỳ, nếu số lượng bản mẫu là 10
2
-10
3

thì số chu kỳ phải là 35-40
2.5. Các ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR
2.5.1. Ưu điểm
- Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA
được quan tâm. So với phương pháp tạo dòng của kỹ thuật tái tổ hợp DNA phải mất
cả tuần hoặc lâu hơn.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic
acid thô. Ví dụ mẫu máu hay các dấu vết trong phân tích pháp y. Điều này ngược
với kỹ thuật tái tổ hợp DNA, đoạn gen hoặc vector đều cần tương đối tinh khiết.
- Có thể phát hiện những vi khuẩn khó nuôi cấy, việc tăng sinh là đơn giản hoặc
không cần thiết.
- Hóa chất dùng trong phản ứng PCR dễ tìm và dễ bảo quản hơn so với trường hợp
huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực
hiện ở hiện trường
- Giảm về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện vi sinh vật
gây bệnh.
2.5.2. Hạn chế
- Kích thước của trình tự cần khuếch đại: Phương pháp PCR không hoạt động được
với những đoạn DNA lớn hơn 3kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5kb
cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được
xác định qua thực nghiệm.
- Sự ngoại nhiễm: Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại
của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các
ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí
nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm, bay
lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ rồi nhiễm vào
các phản ứng tiến hành sau đó.
- Các sai sót gây ra do Taq polymerase: Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ
sai khá cao (10
-4

, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide).
Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như
16
đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của
nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến
trình tự chính thức.
- Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật, do
mẫu thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc tách chiết và tinh chế
DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phản ứng PCR thường cho
phép loại bỏ những hợp chất ức chế.
- Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên đa số trường
hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ vi sinh vật đủ cho việc phát
hiện bằng PCR.
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể
dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.
- Phương pháp này chỉ phát hiện những vi sinh vật có trong mẫu chứ không xác
định được số lượng vi sinh vật.
- Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém.
Do vậy, để giảm chi phí người ta thường sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng
PCR (gọi là phản ứng multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh
vật gây bệnh khác nhau.
2.6. Một số ứng dụng của phương pháp PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR từ khi được Kary Mullis đề xuất hoàn thiện
đã có những ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả trong khoa
học công nghệ và trong đời sống xã hội.
2.6.1. Trong khoa học công nghệ
a. RT-PCR (Reverse transcriptase-PCR)
Phản ứng này được tiến hành nhằm nhân bản các cDNA từ khuôn ban đầu là
mRNA. Đầu tiên, RNA tổng số hoặc mRNA được làm khuôn để tổng hợp các
cDNA sợi đơn nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase. Tiếp đến, các

cDNA này được nhân bản trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Như vậy,
chúng ta không nhất thiết phải sàng lọc cDNA từ ngân hàng cũng thu được một
phân tử cDNA đặc hiệu cho một gen. Đối với một cặp mồi đặc hiệu cho một gen, số
lượng sản phẩm RT-PCR ứng với các mẫu RNA từ các loại tế bào khác nhau cho
17
phép so sánh mức độ phiên mã của gen đó. RT-PCR được xm là phản ứng bán định
lượng đối với mRNA.
b. RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphics DNA-PCR)
Kỹ thuật này cho phép nhân bản ngẫu nhiên các đoạn DNA có khả năng bắt
cặp với mồi mà không đòi hỏi sự chính xác đặc hiệu. Do đó, nếu hai mẫu DNA
khuôn có nhiều trình tự tương đồng thì sau phản ứng RAPD-PCR, chúng ta sẽ thu
được các đoạn DNA có kích thước giống nhau. Do không yêu cầu tính đặc hiệu nên
mồi dùng trong phản ứng này thường là mồi chỉ có 10 nucleotide và nhiệt độ gắn
mồi không cao. Kỹ thuật RAPD-PCR thường được ứng dụng trong phân tích quan
hệ họ hàng, xây dựng cây phân loài.
c. PCR tạo đột biến định hướng.
Được áp dụng để xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp, đưa vào hoặc hoặc bỏ
đi, hoặc thay thế các nucleotide trong một đoạn DNA. Các nucleotide cần gây đột
biến được thiết kế nằm trong trình tự của mồi. Kỹ thuật này phối hợp sản phẩm của
các phản ứng PCR với nhau.
Phản ứng PCR định lượng theo thời gian thực dựa trên việc xác định chính
xác hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm trong quá trình phản ứng.
Dựa vào đường cong hàm lượng của một trình tự dùng làm chuẩn, người ta có thế
suy ra được hàm lượng trình tự hàm lượng mục tiêu trong mẫu ban đầu.
d. PCR với kỹ thuật clone tái tổ hợp (cloning of recombinant)
18
Nếu trước đây, muốn đưa một đoạn gene vào plasmid để chuyển thể plasmid
này vào một vi khuẩn thì đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức. Trước hết
phải có một số lượng tế bào đích để từ đó ly trích toàn bộ bộ gene (genomic DNA).
Sau đó dùng nhiều loại restriction enzyme để cắt bộ gene thành nhiều đoạn có kích

thước khác nhau, điện di trên thạch, làm kỹ thuật Southern blotting và phát thiện
đoạn gen muốn tìm bằng kỹ thuật lai (hybridization) với đoạn dò (probe) đặc hiệu.
Trên kết quả đó, có thể định vị và trích được đoạn gen muốn tìm từ bản thạch đã
điện di để gắn vào plasmid rồi đưa vào vi khuẩn mang. Tuy nhiên công việc như
vậy cũng chưa đã hoàn tất, vì chưa chắc ta đã gắn đúng đoạn gene mong muốn vào
plasmid vì trên bản thạch ta không thể chỉ lấy đúng đoạn gene đã định vị mà không
lẫn các đoạn gene khác. Do vậy, phải chọn đúng vi khuẩn mang plasmid có gene
mong muốn. Toàn bộ kỹ thuật này gọi là clone tái tổ hợp, có khi phải thực hiện
trong nhiều tháng, thậm chí nhiều năm, nhiều khi chưa chắc đã thành công. Ngày
nay, các nhà nghiên cứu có thể dùng kỹ thuật PCR. Trước hết, từ một vài tế bào
đích ban đầu (không cần phải có nhiều tế bào đích như kỹ thuật cũ), có thể sử dụng
cặp mồi đặc hiệu để tổng hợp và khuếch đại đoạn gene muốn tìm thành hàng tỷ bản
sao giống hệt nhau rồi đưa vào plasmid (không cần phải dùng một lượng lớn tế bào
đích để ly trích được bộ gene và phân tích bằng restriction enzyme, rồi Southern
blotting). Lúc này plasmid mang đúng đoạn gene đích, không thể có lẫn lộn các
đoạn gene khác, vì vậy sau khi chuyển thể plasmid vào vi khuẩn mang, không cần
phải làm kỹ thuật chọn dòng nữa. Như vậy, chúng ta thấy cũng cùng một mục đích,
nhưng với PCR công việc đã gọn lại rất nhiều, có thể chỉ mất vài tuần là hoàn tất.
2.6.2. Trong đời sống xã hội
a. PCR trong tư vấn bệnh di truyền
Khả năng nhân bội các trình tự DNA đặc hiệu đã giúp nó trở thành một công
cụ có giá trị trong việc chẩn đoán các dị tật di truyền và đột biến. Vì cần phải biết
trình tự DNA sẽ được nhân bội trước khi tiến hành PCR nên vị trí đột biến cũng
phải được biết trước. Ưu thế nổi trội của PCR là chỉ cần một lượng nhỏ DNA để
chẩn đoán. Các tế bào máu, niêm mạc là những vật liệu thích hợp để chẩn đoán ở ng
lớn; đối với bào thai chỉ cần một lượng nhỏ lông tơ màng đệm. Kỹ thuật này cho
phép chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền, kể cả các chẩn đoán trước sinh
giới tính và các dị tật bẩm sinh có thể có từ khi thai mới được 8 tuần tuổi.
19
PCR được sử dụng để phát hiện đột biến xen/mất đoạn và các đột biến điểm.

Nhiều kỹ thuật phát hiện đột biến nhờ sử dụng PCR đã được phát triển.
b. Trong y học
Bằng cách khuếch đại đoạn nucleic acid đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh
trong mẫu bệnh phẩm, thử nghiệm PCRcó thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ
nhạy cảm cực cao mà không có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được.
Vì chỉ cần một vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có hiện diện nucleic
acid đích và được PCR khuếch đại [4].
Trong các thử nghiệm huyết thanh hay miễn dịch học, chìa khoá chính của
thử nghiệm là có được trong tay các kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu. Nếu
không mua sản phẩm thương mại, ta phải tự chế, đây là một công việc rất công phu
và tốn thời gian. Trong khi đó với PCR, chìa khóa chính của thử nghiệm là vấn đề
tìm cho được các đoạn mồi đặc hiệu.
Chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn bằng PCR chẳng những có thể phát hiện được
tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại di
truyền các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn. Ðây là một đóng
góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân
gây bệnh trong cộng đồng. Minh chứng của ứng dụng này là trường hợp "nha sĩ
Florida" (Florida dentist) nhờ có PCR mà đã xác định được 3 bệnh nhân khám điều
trị răng đã bị nhiễm HIV từ một nguồn gốc. Ngoài ra PCR còn có thể phát hiện vi
khuẩn kháng kháng sinh như phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicin, một chìa
khóa chủ yếu để bác sĩ điều trị có thể sử dụng phác đồ điều trị đúng cho bệnh nhân.
c. PCR với tiến hóa và khảo cổ học
Từ năm 1963, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu về tiến hóa dựa trên
cấu trúc phân tử của protein (cytochrome, hemoglobin, ribonuclease,…). Sau đó, họ
tập trung nghiên cứu vào trình tự chuỗi của 16S RNA của ribosome trên vi khuẩn
hay bộ gen của ty thể và lục lạp của thực vật. Ngày nay, PCR đã góp phần làm công
việc nghiên cứu về tiến hóa phân tử học trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn.
Người ta có thể so sánh các loài với nhau bằng cách dùng các mồi đặc hiệu cho
những vùng không đổi của bộ gene, nhờ đó khuếch đại các vùng biến đổi rồi so
sánh với nhau. Ưu điểm vượt trội nhất của PCR trong lĩnh vực này là chỉ cần một số

20
lượng rất nhỏ mẫu vật là đủ để có thể tiến hành phân tích. Một ví dụ mà các nhà tiến
hóa phân tử học đã thực hiện thành công là tìm hiểu được mối liên hệ giữa một loài
gấu Bắc Mỹ và gấu Châu Phi. Họ chỉ cần đặt dọc trên đường đi của gấu, trên thân
cây, những bàn cào để lấy được các dúm lông của chúng, rồi đem về phòng thí
nghiệm phân tích. Còn trước kia thì phải đặt những cái bẫy để bắt được gấu và lấy
một số lượng nhiều máu mới đủ để phân tích.
Trong lĩnh vực khảo cổ học, DNA là một phân tử khá bền vững, có thể tồn
tại nguyên vẹn trong thời gian khá dài. Có rất nhiều truờng hợp, những mảnh DNA
cổ đại đã được PCR khuếch đại thành công, ví dụ người ta có thể khuếch đại DNA
ty thể của một người Châu Mỹ sống cách đây 7000 năm hay từ các mảnh xương của
cọp răng chồn sống cách đây 14000 năm.
d. PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền
Dấu ấn di truyền là những dấu ấn giúp phân biệt các cá thể trong cùng loài để
xem chúng có liên hệ với nhau hay không. Các dấu ấn này hoàn toàn không có ý
nghĩa gì trong việc biểu hiện kiểu hình thông qua tổng hợp protein.
Trước đây, để phát hiện các dấu ấn di truyền, nhà nghiên cứu phải ly trích
được bộ gene từ một khối lượng rất nhiều tế bào của cá thể cần khảo sát (mô, máu,
…). Sau đó cắt đoạn bộ gene này bằng các restriction enzyme, điện di trên thạch,
làm Southern blotting, rồi dùng các đoạn dò đặc hiệu được đánh dấu để phát hiện.
Kết quả là mỗi cá thể sẽ có một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu
bằng các đoạn dò khi lai ghép trên Southern blotting. Người ta gọi kỹ thuật này là
kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mảnh DNA bị cắt đoạn, RFLP
(Restriction Fragment Lengh Polymorphism).
Với PCR, công việc trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Có hai kiểu PCR phát
hiện dấu ấn di truyền hiện đang được dùng. Kiểu thứ nhất dùng PCR với các đoạn
mồi nằm trước và sau các microsatellite, là các cấu trúc CACACA lặp đi lặp lại, rải
rác khoảng 100000 lần trong bộ gene của động vật có vú và khuếch đại các
microsatellite này. Vì các cá thể khác nhau có sự khác nhau về số lượng các cấu
trúc CA tạo thành các microsatellite nên sau khi khuếch đại bằng PCR và phân tích

các vạch trên thạch điện di, sẽ thấy các kiểu mẫu vạch khác nhau tùy từng cá thể
được phân tích. Kiểu thứ hai là dùng phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các DNA
đa hình (Random Amplified polymorphic DNA, RAPD), sẽ cho sản phẩm PCR là
21