CÁC kỹ THUẬT xét NGHIỆM cơ bản tìm nấm gây BỆNH

GVHD: CÔ GIA KHÁNH
CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM CƠ
BẢN TÌM NẤM GÂY BỆNH
DANH SÁCH NHÓM
ĐỖ NGỌC HẢI
LÊ THỊ THÚY HẰNG
NGUYỄN THỊ BÍCH LIÊN
PHAN THỊ THÙY LINH
NGUYỄN KHÁNH LINH
TRẦN THỊ NA
2
I. NGUYÊN TẮC
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
III. CÁCH LẤY VÀ XỬ LÝ BỆNH PHẨM TÌM NẤM
IV. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
V. PHƯƠNG PHÁP NHỘM
VI. NUÔI CẤY NẤM
NỘI DUNG
3
I. NGUYÊN TẮC
•
Nếu phòng xét nghiệm có đủ điều kiện, nên kết hợp xét
nghiệm trực tiếp và nuôi cấy nấm để có thể chẩn đoán xác
định nấm gây bệnh.
•
Nên quan sát mẫu bệnh phẩm cả đại thể lẩn vi thể.
•
Khi quan sát mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu nuôi cấy nấm dưới
kính hiển vi, cần phân biệt nấm gây bệnh thật sự và nấm
tạp nhiễm.
•

Khi không tìm thấy nấm trong mẫu bệnh phẩm, không thể
loại trừ khả năng nhiểm nấm mà cần phải xét nghiệm bệnh
phẩm nhiều ngày liên tiếp và kết hợp với nuôi cấy nấm để
có thể có kết luận xác định.
4
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
1. Dụng cụ:
- Kính hiển vi , dầu soi kính, Lam kính, Lamen.
- Đèn cồn, que cấy kim hoặc que cấy cắt,
- Dao cạo, dao mổ, nhíp, kẹp, Kìm, băng dính, bơm,
kim tiêm, tăm bông, pince … để lấy mẫu
- khăn gạc, kéo, bông, khay pipette, hộp petri.
- Găng tay, khẩu trang.
- Tủ ấm
5
2. Hóa chất: Tùy kỹ thuật hoặc phương pháp mà có
chuẩn bị dung dịch hóa chất phù hợp.
- Nước muối sinh lý 8,5% hoặc 0,9%
- Dung dịch KOH 10%, 20%, 30% tùy ý
- Mực tàu hoặc Parker đen N051
- Dung dịch nhuộm: Gram, xanh Methylen, giêm sa
- Phẩm xanh Lactophenol Coton Blue (LPCB)
6
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
3. Môi Trường:
3.1. Thạch Sabouraud (Sabouraud dextrose agar):
Dùng để duy trì các lứa cấy và cấy trích biệt sơ khởi
các mẫu thử. Khi cần, thêm Chloramphenicol (50mg)
hoặc Cycloheximide (Actidione) 500mg hoặc cả hai vào
môi trường để ngăn tạp nhiểm.

7
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
3. Môi Trường:
3.2. Thạch tim óc hầm (Brain Heart Infusion = BHI)
Môi trường có máu hoặc không có máu dùng để nuôi
cấy nấm gây bệnh ở nhiệt độ phòng nhưng thường nhất là
dùng để trích biệt và duy trì các lứa cấy nấm men, ủ ở 35-
370C.
8
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
3. Môi Trường:
3.3. Thạch bột bắp (Corn Meal Agar)
Dùng để phân biệt và định danh các loại nấm men,
đặc biệt là Candida albicans.
Ghi chú: để phân biệt Trichophyton rubrum và
Trichophyton mentagrophytes dựa vào sự thành lập
sắc tố (Trichophyton rubrumsinh sắc tố đỏ), người ta
dùng môi trường này nhưng thay thế 1% Tween
80 bằng 1% Glucose.
9
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
3. Môi Trường:
3.4. Môi trường Chromogenic
Dùng để phân lập các loại nấm men và nhận dạng
trực tiếp candida albicans. Nếu là candida albicans thì
khuẩn lạc có màu xanh ngọc.
10
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
3. Môi Trường:
3.5. Môi trường Czapek dox agar:

Dùng để định danh các loại nấm sợi như Aspergillus,
Penicillium…
11
II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
12
Dichloran 18% Glycerol (DG-18) Agar Potato Dextrose Agar with Chloramphenicol
•
Những điều cần chú ý khi lấy bệnh phẩm
- Một số loại bệnh phẩm phải được y Bác sĩ chuyên khoa lấy như
mẫu sinh thiết, dịch não tuỷ, dịch cổ tử cung…
- Một số bệnh phẩm do kỹ thuật viên lấy: Bệnh phẩm ngoài da, tóc,
móng, mủ, máu…
- Bệnh phẩm do bệnh nhân tự lấy: Phân, nước tiểu, khí hư, đờm…
- Bệnh nhân phải ngừng điều trị trước khi lấy bệnh phẩm 7- 10 ngày.
- Phải tuân theo các kỹ thuật vô khuẩn tránh nhiễm nấm từ môi
trường.
13
III. CÁCH LẤY VÀ XỬ LÝ BỆNH
PHẨM TÌM NẤM
Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm
● Bệnh phẩm ngoài da: Dùng cồn 700 hoặc cồn iod sát khuẩn vùng
da nghi nhiễm nấm, dùng lưỡi dao mỏng cạo bờ của tổn thương cho
các vẩy da rơi lên tiêu bản hoặc vào đĩa petri vô khuẩn.
14
● Bệnh phẩm tóc: Chọn những sợi tóc mất bóng, xốp,
mất màu, dễ gẫy hoặc sợi tóc có những hạt đen hay
trắng bám chặt vào sợi tóc. Tóc được cắt thành từng
đoạn ngắn khoảng 1cm.
● Bệnh phẩm móng: Dùng cồn 700 hoặc cồn iod lau sạch móng bị
nhiễm nấm, dùng dao vô khuẩn cạo móng hoặc cạo chỗ móng bị sùi

vào tiêu bản hoặc đĩa petri vô khuẩn.

15
Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm
● Bệnh phẩm đờm: Sau khi bệnh nhân ngủ dậy, xúc
miệng sạch rồi khạc đờm vào dụng cụ vô khuẩn có
miệng rộng và đậy nắp.
● Bệnh phẩm là các chất dịch, mủ, nước tiểu: Có thể dùng que
tăm bông vô khuẩn để lấy mủ, dịch hoặc lấy nước tiểu giữa dòng
vào dụng cụ vô khuẩn.
● Bệnh phẩm dịch não tuỷ, dịch màng phổi, mụn bọc, máu:
Dùng bơm kim tiêm vô khuẩn chọc hút dịch hoặc máu.
● Cấy tìm nấm: lấy 5ml máu tĩnh mạch, cho vào chai có 50ml BHI
hay Trypticase Soy, ủ ở 370C.


16
Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm
● Mẫu sinh thiết: Được chia làm 2 phần:
– Một phần cho vào dung dịch NaCl 0,85% để
làm xét nghiệm tìm vi nấm.
– Một phần cho vào dung dịch cố định
(formalin), để làm tiêu bản giải phẫu bệnh lý.
● Phân: Lấy mẫu phân vào lọ miệng rộng vô trùng
với ít nước muối sinh lý đánh tan ra. Lấy 1 – 2 giọt lên
lam kính, soi tươi dưới kính hiển vi.
17
Một số loại bệnh phẩm thường chẩn đoán nấm
IV. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
Cần quan sát trực tiếp mẫu bệnh phẩm bằng mắt

thưởng hoặc bằng kính lúp trước khi tiến hành xét
nghiệm để phát hiện những chổ có đóng váng vàng ,
mũ, máu hoặc chất hoại tử (nếu có), nên lấy các chất
này đẻ soi trực tiếp và nuôi cấy.
Trường hợp nghi do mycetoma, cắt nhỏ bệnh phẩm
soi dưới kính hiển vi tìm hạt trước khi xử lý bệnh phẩm.
18
19
- Dùng các loại bệnh phẩm lỏng: đàm, huyết trắng,
mủ, phết họng,…
- Pha loãng bệnh phẩm trong NaCl 0.85% vô trùng
- Nhỏ 1 giọt bệnh phẩm đã pha loãng len lam
- Đậy lamen rồi soi ở vật kính 10X, 40X
- có thể thấy hình ảnh nấm sợi hoặc nấm men trong
tiêu bản
20
1. Khảo Sát với dung dịch nước muối sinh lý:

IV. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
- KOH làm mềm tổ chức, căng giãn và làm trong tế
bào, làm tan các hạt dầu mỡ trong bệnh phẩm.
- Có thể dùng cho tất cả các loại bệnh phẩm (trừ
dịch não tủy). Thường dùng cho các bệnh phẩm rắn
(lông, tóc, móng, da)
- Nhỏ 1 giọt KOH 10% hoặc 20% lên lam kính
21
2. Khảo sát với dung dịch NaOH hoặc KOH
10%, 20 %, hay 30% (tùy trường hợp).

IV. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

- Để mẩu bệnh phẩm đã xử lý vào giọt KOH
- Đậy lamen
- Để yên lam kính trong 15 – 30’ hoặc hơ nhanh lam kính
trên đèn cồn khoảng 30’’ và để khoảng 5 – 10’
- Khảo sát dưới kính hiển vi vật kính 10X, 40X.
- Có thể thấy hình ảnh nấm sợi hoặc nấm men trong tiêu bản
22
IV. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
2. Khảo sát với dung dịch NaOH hoặc KOH
10%, 20 %, hay 30% (tùy trường hợp).

23
24
- Dùng để quan sát vi thể các lứa nuôi cấy nấm
- Trong dung dịch LPCB (Lactophenol Coton Blue):
Acid lactic giữ nguyên cấu trúc nấm, phenol giết nấm,
xanh cotton nhộm màu nấm
- Lấy một mảnh nhỏ khuẩn lạc nấm từ môi trường
nuôi cấy bằng que cấy cắt
- Đặt mảnh khuẩn lạc nấm lên lam kính
25
3. khảo sát với dung dịch LPCB (Lactophenol
Coton Blue) hoặc xanh coton:

IV. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP