Tiểu luận di truyền y học

I/ TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN DI DNA
Nguyên tắc: chiết tách DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ
gen đều tiến hành với DNA (hay ARN).
AND chiết tách cần đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc
với độ dài từ 50 – 100 kb để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trong
công nghệ gen thực vật.
Tùy thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp chiết tách AND cho
phù hợp.
1. Các phương pháp tách chiết axit nucleic
Mục tiêu: thu nhận được các phân tủ axit nuclêic còn nguyên vẹn tối đa không
bị đứt gãy bởi các tác nhân cơ học và hóa học.
- Tác nhân cơ học ( bị đứt, gãy do nghiền, tắc mạch)
- Tác nhân hóa học (bị cắt đứt do enzim nội bào như desoxyribonuclease –
DNase và ribonuclease – Rnase)
1.1. Phương pháp tách chiết DNA
- DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tác nhân gây đứt gãy.
- DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước lớn (15kb –
300kb).
• Phương pháp tách chiết cơ bản gồm bốn bước chính sau :
- Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng
cách nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 196
0
C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy
(SDS, Sarcosyl) và prôtêinase K.
- Bước 2: loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu như các prôtêin,
polysacharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol : chloroform :
isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắp mạnh cho đến khi dung dịch có dạng rắn sữa.
Prôtêin sẽ biến tính và kết tủa.
DNA, RNA được hòa tan trong nước
1
Sau li tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:

+Pha trên cùng là pha nước chứa DNA và RNA.
+Pha giữa là pha chứa prôtêin và các chất thứ cấp bị kết tủa.
+Pha dưới cùng là dung dịch phenol: chloroform: isoamine.
- Bước 3: kết tủa acid nucleic
+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở -20
0
C trong 30 phút hoặc
0
0
C qua đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử acid nucleic đều kết tủa.
+ Tủa bằng isoprôpanol (tỉ lệ 1:1) ở 0
0
C, các phân tử DNA có trọng lượng phân
tử thấp không bị kết tủa.
Sau đó li tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để
loại bỏ muối và isoprôpanol còn lại.
- Bước 4: hòa tan cặn (DNA, RNA) và xử lí loại bỏ RNA bằng enzyme
Rnase. Sau đó kết tủa lại được DNA.
1.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA
- Chú ý :
+ Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi enzyme Rnase
+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không
khí…).
+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt.
Do đó thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc
bằng tay trần.
• Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng tương tự DNA. Chỉ khác là ở
bước cuối cùng dùng enzyme Dnase loại bỏ DNA.
• Tách chiết mRNA
- Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A

- Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần cho qua cột sắc ký ái lực
( oligod T-cenllulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligode T ).
- mRNA có đuôi poly A sẽ liên kết bổ sung với đoạn oligod T.
2
- Dùng dung dịch rửa cột. Các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được
giữ lại.
- Sau đó dùng dung dịch có nồng độ muối thaáp rửa cột hoặc li tâm sẽ thu được
các phân tử mRNA.
2. Điện di AND
Acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế và
cường độ thích hợp AND, ARN di chuyển từ cực âm đến cực dương.
Để kiểm tra và xác định tính chất của AND, cần điện di AND trên thạch ( gel
). Phân tử DNA càng nhỏ càng di động nhanh. Tùy theo kích thước của phân tử
AND mà người ta dùng các loại gel khác nhau :
- Phân tử AND có dưới 500 đôi Nu Dùng polyacrylamid gel
- Phân tử AND có dưới 500 – 10000 Nu Dùng Agarose gel
- Phân tử AND có nhiều đôi Nu hơn Dùng Agarose gel có lỗ to
hơn (Pulsed field agarose gel).
Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm màu DNA bằng
ethidium bromise, dưới ánh sáng tử ngoại, AND gắn với ethidium bromise sẽ
phát sáng.
Khi cho chạy ddiện di AND nghiên cứu thường có AND mẫu (marker) cùng
chạy để so sánh, xácx định số lượng nu của đoạn AND.
Phương pháp điện di AND còn được dùng để kiểm tra kết quả tách chiết AND.
II. PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE ( polymerase chain reacion : PCR)
Phương pháp này được Mullis và cộng sự đề xuất vào năm 1985
Mục đích phương pháp : phát hiện và nhân đoạn AND nhiều lần trong ống
nghiệm.
3
Để thực hiện được phương pháp cần có : phân tử AND ban đầu, hai đoạn

AND mồi ( primers ), mỗi môù gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầu
của phân tử AND ban đầu : mồi ngược và mồi xuôi. Bốn loại Nu ( dATP, dCTP,
dGTP, dTTP ), Taq polymerase : enzyme polymerase có tính chịu nhiệt độ cao :
enzyme này được chiết từ loià vi khuẩn Thermus aquaticus.
Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kì, môic chu kì gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính : ủ AND ban đầu ở nhiệt độ cao 92-95
0
C để tách AND
thành sợi đơn.
- Giai đoạn lai ghép : AND mồi được lai ghép với sợi đơn của ADN ban đầu.
Thực hiện ở nhiệt độ 50-52
0
C.
- Giai đoạn tổng hợp AND : Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các nu vào
sau AND mồi dựa AND ban đầu làm khuôn. Thực hiện ở nhiệt độ 70-72
0
C.
Sau mỗi chu kì, từ một phân tử AND ban đầu tổng hợp nên hai phân tử
AND, đến chu kì sau hai phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp nên bốn phân tử
DNA. Qua các giai đoạn đã nêu ở trên và cứ như vậy thực hiện tiếp các chu kì
sau. Sau 30 chu kì từ một phân tử DNA ban đầu sẽ có 2
30
phân tử được tạo
thành.
Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhạy, từ một lượng AND rất ít
ban đầu, với cặp mồi tương ứng. đặc hiệu, sau khi áp dụng phương pháp PCR sẽ
có một lượng lớn AND đủ dùng cho những chẩn đoán, nghiên cứu. Phương
pháp PCR trong nhiều trường hợp đã thay thế cho phương pháp Southern
blotting vì phương pháp này thực hiện nhanh, cần lượng AND ít.
Từ phương pháp PCR ban đầu, ngày nay người ta đã đề xuất nhiều cải biến để

nâng cao tính năng của phương pháp.
- PCR lồng ( Nested PCR ): trong kỹ thuật này dùng hai cặp mồi, quá trình tự
các nu lồng vào nhau ( có nghĩa rằng cặp mồi thứ hai có trình tự các nu nằm
gtrong cặp mồi thứ nhất ). Đoạn AND được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được
dùng làm khuôn mẫu cho PCR lần thứ hai. Điều này đã làm tăng độ đặc hiệu
4
của phản ứng PCR. Nó chỉ nhân lên đoạn đặc hiệu của AND lần một, đồng thời
nó sẽ không nhân lên với nhũng sản phẩm không đặc hiệu của lần một.
- Nhân đoạn AND nhân lượng huỳnh quang : QS – PCR ( quantitative –
fluorescense – polymerase chain reaction ) : năm 1993, Mansield lần đầu tiên
ứng dụng phương pháp nhân đoạn AND định lượng huỳnh quang – từ năm 1998
đến nay, một số phòng thí nghiệm đã thực hiện thành công kỹ thuật này trong
chẩn đoán trước sinh hội chứng Down. Ví dụ : dựa vào kết quả định lượng gen
DSCR1 ( gen được định vị ở vùng 21q21.1 – q22.2 liên quan đến dị tật tim và
chậm phát triển tâm thần của hội chứng Down ), để xác định thai bị Down hoặc
không.
III. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT TRONG PHÂN TỬ AND (
Sequencing )
Về nguyên lý người ta có thể xác định trình tự các Nu trong cả bộ gen
(genome) nhưng trong điều kiện hiện nay người ta mới chỉ xác định trình tự Nu
ở những đoạn AND xác định.
Sau đây là hai phương pháp đã được ứng dụng để thực hiện xác định trình tự
Nu : phương pháp hóa học và phương pháp enzyme học, trong đó phương pháp
enzyme học được ứng dụng nhiều.
1. Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger)
Nguyên lý của phương pháp này là dùng các dideoxyribonucleotid để tránh
gắn thêm các Nu tiếp theo. Phương pháp gồm các bước :
- Bước 1: phân tử cần xác định trình tự các Nu được dùng làm khuôn để tổng
hợp nên một số đoạn AND cùng bắt đầu ở một vị trí giống nhau nhưng kết
thúc ở vị trí khác nhau. Phản ứng tổng hợp có AND polymerase xúc tác in

vitro.
5
Trong bốn ống nghiệm có các thành phần giống nhau là sợi AND khuôn, bốn
loại Nu ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ). Đánh dấu phóng xạ
32
P cho một loại
dideoxỷibonucleotid khác nhau.
Ví dụ ống 1 cho ddATP, ống 2 cho ddGTP, ống 3 cho ddCTP và ống 4 cho
ddTTP.
- Bước 2: trong quá trình tổng hợp dùng dideoxyribonucleotid là Nu bị mất
nhóm OH ở vị trí thứ 3 nên khi nó được gắn vào chuỗi AND thì không có sự
gắn thêm Nu nữa. Hiện tượng này sẽ tạo ra một thang gồm các đoạn AND có
chiều dài khác nhau hiện rõ khi điện di.
- Bước 3: để xác định được vị trí của tất cả bốn loại Nu phải có sự kết hợp
hình ảnh điện di của cả bốn ống thể hiện trên bốn làn với các băng khác nhau
mà vị trí của từng băng đặc trưng cho vị trí từng Nu và đọc cũng theo thứ tự
từ dưới lên. Tất cả các băng được đọc bằng phương pháp tự chụp hình phóng
xạ hoặc đánh dấu huỳnh quang.
2. Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert)
Nguyên lý của phương pháp là dùng hóa chất liều ít để phá hủy một trong
bốn loại Nu tạo nên chuỗi AND.
Các bước của phương pháp như sau :
- Bước 1: tách AND sợi kép thành sợi đơn, cho sợi đơn tiếp xúc với hóa chất
để phá hủy một trong bốn loại base (ví dụ base A). Vì chỉ xử lý liều ít nên
hóa chất chỉ phá hủy một trong số A có mặt. cách xử lý này tạo ra một số
đoạn AND có chiều dài khác nhau phản ánh vị trí của A đã bị phá hủy theo
trình tự chuỗi.
- Bước 2: các đoạn AND này được điện di trên gel, được phát hiện bằng tự
chụp hình phóng xạ: chỉ những đoạn AND đã được đánh dấu
32

P ở đầu 5’
mới được hiện rõ trên gel, kích thước của chúng biểu hiện khoảng cách từ
đầu đánh dấu đến vị trí A cần xác định.
6
- Bước 3: để xác định vị trí của tất cả các Nu trong phân tử AND, cách xử lý
như trên được thực hiện đồng thời với bốn ống cho bốn loại Nu thông
thường T cho mẫu 1, C cho ống 2, G cho ống 3 và A cho ống 4.
- Bước 4: đọc vị trí các Nu tương tự như phương pháp enzyme. Vị trí của 4
loại Nu biểu hiện bằng 4 làn băng, vị trí được đọc từ dưới lên vì các đoạn
nhỏ khi điện di chạy nhanh hoen các đoạn có kích thước lớn.
IV. ENZYME GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYME GIỚI HẠN
1. Enzyme giới hạn ( Restriction enzyme )
Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị
trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme này phân hủy liên kết
phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không tổn hại đến bases. Các
liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt có thể được nối trở lại bẳng loại enzyme
khác là các ligases, vì thế các đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà
bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau
nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và
kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn. Thuật ngữ giới hạn xuất
phát từ việc các enzyme được khám pha từ các chủng E.coli mà đang hạn chế
sự phát triển của các “thực khuẩn thể”. Vì thế enzyme giới hạn được cho là cơ
chế của vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virus và giúp loại bỏ các trình
tự của virus.
2.Phân loại enzyme giới hạn
Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nõi chung thành 3 loại, gọi là Loại
I, Loại II và Loại III. Đối với hai loại I và III, cả hoạt tính phân giải acid nucleic
hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp enzyme lớn.
mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết những trình tự DNA
đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base.

7
Chúng cũng cần ATP để hoạt động. những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm
tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết
Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiệu cho thấy đây là
DNA ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân
giải. Tuy nhiên nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là DNA
của tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa
cho gốc adinine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNA bộ gene.
Với enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải cảu nó không liên quan đến
chức năng methyl hoaá hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay
bên trong hyay kế cạnh vị trí nhận biết. Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme
khác nhau loại này và chúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết
yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích DNA.
3. Vị trí điểm cắt
Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5’-3’
trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của
enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này.
Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức thời, tạo ra các đoạn
DNA “đầu bằng (blunt)”. Hầu hết các enzyme đều tạo ra các vết cắt hơi chéo
nhau (hình chữ chi), tạo ra các “đầu dính “. Các enzyme giới hạn có ba chức
năng quan trọng, mỗi chức năng cắt DNA bằng các cơ chế khác nhau.
4.Đoạn bổ sung và đoạn nối
Vì các enzyme giới hạn khác nhau ở các trình tự nhận biết và điểm cắt, nên
chiều dài và trình tự chính xác của đầu dính “nhô ra”, cũng như không biết nó
có phải là mạch đầu 5’ hay đầu 3’ mà những phân tử nhô ra phụ thuộc vào
enzyme tạo ra sản xuất ra nó. Tính bổ sung giữa những phần nhô ra và các trình
8
tự bổ sung cho phép hai phân đoạn có thể nhập lại với nhau hay “splice” bởi
DNA ligase. Phân đoạn có đầu dính có thể được gắn không chỉ vói phân đoạn
lúc mới bị cắt đầu tiên, mà còn với bất kỳ phân đoạn nào mà có đầu dính thích

hợp. Kiến thức về điểm cắt cho phép các nhà sinh học phân tử dự đoán được
cách mà các phân đoạn có thể gắn kết và từ đó, có thể chọn ra enzyme thích
hợp.
5. Chức năng của enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn ở vi khuẩn có vai trò phân giải AND của vius khi vius thâm
nhập vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn có enzyme biến đổi để methyl hóa enzyme
giới hạn làm cho enzyme giới hạn mất hoạt tính, không tác động đến AND của
vi khuẩn.
Chức năng cắt của enzyme giới hạn đã làm cho phân tử AND có thể bị cắt ra
từng đoạn để phân tích. Sau khi bị cắt, các đoạn AND có thể được điện di trên
agarose gel để xác định tính chất, hoặc dùng để tạo nên các phân tử ADN lai.
V. LAI ACID NUCLEIC
1. ADN dò (DNA probes)
Trước khi thực hiện các kỹ thuật lai acid nucleic người ta phải tạo ra các
AND dò.
ADN dò là một đoạn AND sợi đơn mà trình tự Nu, tính chất của chúng đã
được biết. Một số loại AND dò đã được bán tại thị trường. Có tên như vậy vì
AND dò có chức năng dò tìm những đoạn AND sợi đơn tương ứng trên các
phân tử AND cần được phân tích, ví dụ các đoạn AND bất thường trong một số
bệnh cần chẩn đoán.
Phương pháp tạo AND dò:
- Phương pháp sao mã ngược:
Protein mRNA - cADN
Ví dụ: - Phe – Trp – Met – Asp – Cys – Arg -
9

AND sợi đơn TTT – TCC – TAC – CTA – TCT – GCT –
Hoặc (TTG) (CTG) (TCG) (GCC)
- Phương pháp tổng hợp từ các Nu theo một trình tự đã biết.
- Phương pháp tách chiết từ AND của bộ gen

Trong phương pháp lai acid nucleic có sử dụng phương pháp lai các alen với
các mẫu dò đặc hiệu (allele specific oligonucleotide), phương pháp thường dùng
với các kyc thuật sau
2. Các phương pháp lai acid nucleic
1.1. Phương pháp lai trên pha rắn
1.1.1. Nguyên tắc
Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây
là một trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, tức trình tự cần tìm)
được cố định trên một giá thể đặc biệt.
Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là tạo dễ dàng trong thao tác và trong
việc tách các trình tự không lai ra các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt
cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử. bù lại, việc phân tích định lượng các
phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả thấp. Thật vậy, vận tốc lai trên pha
rắn thấp hơn gấp 10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic
acid được cố định trên giá thể bị che khuất , không tiếp xúc được với các trình
tự bổ sung.
1.1.2. Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong các phương pháp lai trên pha
rắn
Giá thể rắn dùng cố định nucleic acid là các màng lai. Có hai loại màng lai :
màng lai bằng nitrocellulose – là loại giá thể được sử dụng đầu tiên – hiện nay
không còn thông dụng do hai nhược điểm : độ bền cơ học kém nên khó thao tác,
không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác;
10
màng lai bằng nylon, có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều
mẫu dò khác nhau (cần loại bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới).
1.1.3. Ứng dụng của phương pháp lai trên pha rắn
Trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn nổi bật lêm
ba phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất : phương pháp Southern blot,
phương pháp Northern blot và phương pháp Western blot.
a) Phương pháp Southern blot

Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ
gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage…
Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (tranfer) DNA từ gel lên màng lai do
Southern mô tả năm 1975.
* Phương pháp Southern blot gồm các bước sau :
- DNA bộ gen được cắt thành những đoạn kích thước khác nhau bởi một hay
nhiều enzyme giới hạn (RE), các đoạn này được phân tách dựa vào kích
thước qua điện di trên gel agarose.
- DNA được làm biến tính (biến thành hai mạch đơn) ngay trên gel rồi được
chuyển lên một màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn được giữ
nguyên.
- DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có dánh dấu phóng xạ. Sau
quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp
chuyên biệt với DNA cố định trên màng.
- Cuối cùng, người ta dùng kyc thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để
định vị các phân tử lai (DNA bộ gen ; mẫu dò) trong kỹ thuật này, người ta
đặt 1 phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai. Các phân tử lai (đúng
hơn là mẫu dò có đánh dấu phóng xạ) sẽ tác động lên phim và kết quả được
thể hiện qua các chấm đen trên phim.
• Các ứng dụng của Southern blot :
- Lập bản đồ giới hạn của một gen.
11
- Phát hiện các đa dạng trình tự (frament polymorphism) của cùng một gen ở
các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của
chúng.
- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì
chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn.
b) Phương pháp Northern blot
Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một
mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA.

Phương pháp này cũng gồm các bước sau :
- RNA (đã được làm biến tính) sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di
truyền gel agarose có chứa các chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có
tác dụng khiến các liên kết yếu quy định cấu trúc bậc 2 của RNA không thể
hình thành trở lại sau khi RNA đã biến tính. Và do đó không cản trở sự di
truyền cũng như sự phân tách các RNA trong gel.
- Sau đó RNA được chuyển lên màng lai.
- RNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.
- Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi.
c) Phương pháp Western blot
Western blot là quá trình protein – protein kết hợp đặc hiệu với nhau. Thường
thì người ta sẽ sử dụng antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang
để phát hiện một loại protein nào đó.
Western blot là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel
SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis),
được dùng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh miễn dịch như chẩn đoán HIV,
viêm gan virus…
Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương pháp lai
thấm protein.
d) Phương pháp Dot blotting – Slotting
12
Lai theo phương pháp dot – blot là phương pháp nhanh thường thực hiện với
nhưbgx mẫu dò ASO (allele- specìic oligonucleotide) để phân biệt sự khác
nhau giữa các alen ở vị trí một Nu. Phương pháp này không cần điện di trên
thạch mà bằng thấm trực tiếp từ đó để xác định những đoạn Nu khác nhau.
Quy trình thực hiện của kỹ thuật qua các bước sau:
- Bước 1: dung dịch AND đích được biến tính bằng nhiệt độ hay bằng dung
dịch kali để tách AND sợi kép thành sợi đơn.
- Bước 2: gắn AND đích đã được biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose
hoặc màng nylon).

- Bước 3: đưa màng lai chứa AND đích vào dung dịch chứa AND dò.
- Bước 4: sau khoảng 20 -24 giờ AND dò sẽ gắn vào AND đích tạo thành
chuỗi kép.
- Bước 5: rửa màng lai, để khô tự nhiên sau đó phân tích bằng tự chụp hình
phóng xạ.
Ngoài ra có rhể gắn AND dò lên màng lai, còn AND đích được để ở trong
dung dịch và các bước tương tự như trên.
Phương pháp này áp dụng để phân biệt giữa các alen khác nhau thậm chí
bằng một vài Nu. Với mục đích này người ta đã tạo ra hưbgx đầu dò ASO từ
những chuỗi Nu có kích thước khác nhau. Những đầu dò ASO này thường chỉ
có từ 15 – 20 Nu và bình thường được hoạt động dưới những điều kiện lai, ở đó
AND kép được tạo ra do sự kết hợp giữa dò và đích nếu base bổ sung giữa dò
và đích là tương hợp. nếu có sự không tương hợp (chỉ cần một nối lệch) giữa
AND dò và đích thì tạo nên chuỗi xoắn kép không bền vững. bằng cách tăng
nhiệt độ tối đa có thể phát hiện những nối lệch này. Mặc dù ASO có thể đã sử
dụng phương pháp lai Southern blot, nhưng ASO được sử dụng thuận lợi hơn
trong những thực nghiệm dot – blot.
13
Nhìn chung kỹ thuật của dot- blot bao gồm lấy được dung dịch AND đích (có
thể là toàn bộ gen của người), nhưng đơn giản hơn la thu được những vết AND
ở trên màng nitrocellulose hoặc bằng màng nylon.
Cần phân biệt kỹ thuật slot- blot và dot- blot. Hai kỹ thuật này khác nhau ở
những vết AND thu được. đối với dot- blot thì AND htu được nằm ở trên màng
nitrocellulose hoặc màng nylon dạng vết tròn, còn slot –blot thì AND thu được
nằm ở những rãnh mà chúng ta đã khía trước trên màng nitrocellulose hoặc
màng nylon.
2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization:
FISH)
Cuối năm 1980, kỹ thuật FISH được ứng dụng rộng rãi để phát hiện cá bất
thường NST. Đây là kỹ thuật đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh vì

nó có thể thực hiện trên nhân tế bào gian kì không cần qua thời gian nuôi cấy. vì
vậy, sau 24- 48 giờ đã có kết quả. Mẫu tế bào có thể lấy sớm từ tuần 12 ( số
lượng mẫu dịch ối 2- 5ml).
Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật di truyền tế bào – phân tử ssử dụng trình tự
chuỗi ngắn AND sợi đơn (AND dò), các AND dò sẽ được lai với AND đích trên
tiêu bản NST ở kỳ giữa hoặc gian kỳ. dưới kính hiển vi huỳnh quang ta có thể
phát hiện, định vị những chỗ AND dò lai với AND đích. Nhờ vậy, phát hiện
được những rối loạn số lượng và cấu trúc NST.
Có các loại AND dò cơ bản sau:
- AND dò phần tâm : loại AND dò này chủ yếu sử dụng để phát hiện các bất
thường số lượng NST và phát hiện các NST nhiều tâm, những mảnh không
tâm.
- AND dò đặc hiệu locus lai từng vùng của một NST: loại ADN dò chủ yếu
phát hiện các đột biến gen – các rối loạn cấu trúc NST như: nhân đoạn nhỏ,
mất đoạn nhỏ…mà phương pháp nhuộm băng không ơhát hiện được.
14
- AND dò toàn bộ NST: dùng những AND dò lai dọc theo chiều dài của một
NST. Điều này cho phép phân biệt các NST khác nhau dựa vào màu sắc của
chúng. Phương pháp này chủ yếu phát hiện rối loạn số lượng, cấu trúc NST.
Ví dụ phát hiện khi một phần của NST này gắn thêm một phần NST khác
trong trường hợp chuyển đoạn.
- Ngoài ra, còn có kỹ thuật mBand FISH (muliticolor fluorescence in situ
hybridization) để phát hiện các bất thường trên các vị trí bằng NST.
- Ứng dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down: sử
dụng AND dò NST 21; nếu nhân tế bào gian kỳ có hai tín hiệu lai -> hai
nhiếm sắc thể 21; nếu có ba tín hiệu lai -> ba nhiếm sắc thể 21.
3. Lai AND trong công nghệ sinh học – tạo gen đơn dòng
Mục đích kỹ thuật: đưa những đoạn AND (gen) cần thiết vào, loại bỏ những
đoạn AND bất lợi để tạo nên những phân tử AND lai quy định tổng hợp nên
sản phẩm (chế phẩm) có chất lượng cao, với số lượng nhiều hơn, thời gian sản

xuất ngắn hơn.
Để thực hiện được kỹ thuật này cần : phân tử AND cho (có chất lượng tốt),
phân tử AND nhận (có khả năng nhân lên nhanh). Các bước cơ bản của kỹ thuật
này bao gồm:
- Chọn AND cho và AND nhận hay còn gọi là vector (thể truyền). Vector
thupờng được dùng là các plasmid cảu vi khuẩn, các phage, đôi khi người ta
còn dùng các cosmid.
- Dùng enzyme giới hạn như nhau để cắt AND cho và AND của vector.
- Dùng enzyme nối (ligase) để nối đoạn AND cho và phân tử AND vector để
tạo phân tử lai.
- Trong trường hợp muốn đưa phân tử AND lai vào vi khuẩn, ví dụ vào E.coli,
người ta dùng CaCl2 để tạo điều kiện cho phân tử lai xâm nhập vào vi khuẩn
dễ dàng hơn.
15
- Các phân tử AND được đưa vào vi khuẩn sẽ nhân lên, trong đó có những
phân tử lai, nhưng cũng có những phân tử chưa nhận AND cho vì cần phân
lập riêng phân tử lai, ví dụ trong trường hợp vi khuẩn kháng kháng sinh, có
vi khuẩn vẫn mọc trong môi trường kháng sinh (chưa nhận phân tử cho mang
tính cảm ứng với kháng sinh), có vi khuẩn không mọc được trong môi trường
đó vì đoạn AND mang tính chất kháng kháng sinh đã được thay bằng đoạn
AND cảm ứng với kháng sinh.
- Bằng phương pháp vi sinh vật học, người ta cấy truyền các khuẩn lạp mang
tính chất cần nghiên cứu.
- Người ta cũng còn dùng phương pháp chuyển các khuẩn lạc từ đĩa cấy petri
sang giấy thấm, sau đó cho lai với AND dò sau khi đã làm biến tính AND
đích, kết quả lai được đánh giá bằng tự chụp hình phóng xạ để phát hiện
khuẩn lạc cần tìm.
- Sử nhân lên nhiều lần một loại khuẩn lạc mang phân tử AND đích nào đó
trong vi khuẩn gọi là tạo dòng invivo.
VI. HIỆN TƯỢNG ĐA HÌNH VỀ CHIỀU DÀI CỦA CÁC ĐOẠN AND DO

ENZYME GIỚI HẠN TẠO NÊN (Restriction fragment length polymorphisms:
RFLP)
Khi đã có AND dò cho một bệnh nào đó thì việc chẩn đoán bệnh đó có thể
thực hiện bằng phương pháp Southern blotting như đã nêu ở trên. Nhưng thực
tế, số AND dò đã biết còn rất ít. Trong trường hợp chưa biết AND dò, để chẩn
đoán bệnh người ta có thể dùng một phương pháp gián tiếp, đó là phương pháp
dùng các thay đổi tự nhiên của AND hay còn gọi là RFLP.
RFLP là hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn AND do enzymr giới
hạn tạo nên.
Người ta ước tính khoảng 10% AND của người tham gia vào tổng hợp
protein, phần còn lại có chức năng chưa được rõ. ở những đoạn AND không
tham gia tổng hợp protein, có thể có những thay đổi của các base nhưng không
16
ảnh hưởng đến kiếu hình. Tuy nhiên sự thay đổi như vậy có thể được xác định
vì chúng làm thay đổi đoạn do enzyme giới hnạ tạo nên, làm thay đổi số lượng,
chiều dài đoạn được cắt. ví dụ: trên phân tử AND có ba vị trí cắt, như vậy hai
đoạn AND được tạo thành, nhưng nếu có hai vị trí cắt thì chỉ có một đoạn cắt
được tạo thành. Những sự thay đổi của các đoạn như vậy có thể được nhận diện
bằng phương pháp điện di. Sự nhận diện của các đoạn này phụ thuộc vào AND
dò được dùng, và phụ thuộc vào vị trí AND dò được dùng. Nếu gen đích (ví dụ
gen bệnh) liên kết với vị trí của RFLP, có nghĩa là gen và vị trí RFLP ở trên
cùng một NST và ở gần nhau tạo nên một tái tổ hợp di truyền trong quá trình
giảm phân. Sự nghiên cứu các AND tái tổ hợp trong gia đình chgo phép chẩn
đoán kiểu gen. như vậy RFLP được dùng như một dấu ấn (marker) trong chẩn
đoán bệnh trước sinh hoặc sau sinh ngay từ khi chưa có biểu hiện bệnh. RFLP
cũng được dùng để phân biệt cơ thể đồng hợp hay cơ thể dị hợp. Kan và Dozi là
những người đầu tiên dùng RFLP để chẩn đoán. Các tác giả đã chứng minh rằng
trong gia đình có bệnh hồng cầu liềm (HbS) enzyme cắt Hpa I đã cắt AND và
tạo nên các đoạn có kích thước khấc nhau, một đoạn phân li với gen lành, đoạn
khác phân li với gen HbS. Kiến thức này được dùng cho chẩn đoán trước sinh.

Hiện tượng đa hình chiều dài của các đoạn do enzyme giới hạn được di
truyền theo quy luật Mendel.
RFLP là một phương pháp được dùng để lập bản đồ gen.
VII. DẤU ẤN AND (DNA Fingerprinting)
- Mục đích của kỹ thuật: kỹ thuật này nhằm phân biệt được người này với
người khác, cá thể cùng loài dựa vào sự có mặt và phân bố của các vạch
AND giống như khi dùng dấu vân da bàn tay.
- Nguyên lý của kỹ thuật: một dấu ấn AND có tên là VNTR (variable number
of tamdem repeats) hay còn gọi là microsatellite, có 11 – 60 đôi base, dấu ấn
này có mặt nhắc đi nhắc lại nhiều lần trong bộ gen. sự có mắt của đoạn AND
dấu ấn này đặc trưng cho từng cá thể.
17
- Số lần nhắc lại của dấu ấn này có thể khác nhau trong từng locut và các dấu
ấn các AND giống nhau có thể gặp ở những vị trí khác nhau của bộ gen. Nếu
locut gen nằm trong phạm vi của đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn thì chiều
dài của đoạn cắt thay đổi tùy theo số lần nhắc lại của VNTR.
- Tính đa hình do VNTR rất đặc trưng cho nên kỹ thuật này đã được sử dụng
trong việc xác định phụ hệ và trong y pháp.
- Kỹ thuật để phát hiện VNTR cũng bao gồm các bước như khi tiến hành
Southern blotting đến bước chuyển VNTR sang giấy nitrocellulose nhưng
sau đó lai AND đích với AND dò để phát hiện phân tử lai. Ngày nay, sau khi
phát hiện ra kỹ thuật PCR người ta có thể phát hiện trực tiếp các VNTR với
các đôi mồi đặc hiệu.
Một số trang thiết bị cơ bản cho phòng thí nghiệm phân tử
Để ứng dụng một số kỹ trhuật sinh học phân tử ứng dụng trong y học như tách
chiết AND – PCR
1. Trang thiết bị cơ bản
- Máy li tâm thông thường trong phòng thí nghiệm với ống li tâm (5- 100 ml)
hoặc li tâm ống nhỏ (0,5- 2 ml). Máy li tâm lạnh.
- Tủ ấm, bình cách thủy (tốt nhất là bình có lắc).

- Tủ lạnh từ 4
0
C - -20
0
C hoặc -80
0
C : tùy mức độ bảo quản mẫu, có
thể bảo quảntrong nitơ lỏng với thời gian dài hàng chục năm.
- Tủ ấm 37
0
C, máy đo pH, máy lắc, máy sấy khô, máy hấp ẩm (tiệt trùng), tủ
sấy với nhiệt độ cao, cân (có thể cân được g, mg).
- Micropipet các loại: 0,5 – 100 ml; 200 – 1000 ml, các loại đầu tuýp cho
micropipet.
- Ống Eppendort, các loại ống đong, các loại dụng cụ thông thường của phòng
xét nghiệm sinh hóa như chai, cốc…, giấy thiếc, giấy chỉ thị màu.
18
2. Hóa chất
- Hóa chất dùng để tách AND – ARN
- Hóa chất pha các dung dịch đệm
3. Những máy thông dụng
- Thiết bị soi tử ngoại.
- Máy điện di.
- Máy PCR.
19