ỨNG DỤNG tạo PLASMID tái tổ hợp để NGHIÊN cứu các CHỦNG VI rút RHINO lưu HÀNH tại KHÁNH hòa và BÌNH ĐỊNH năm 2008 2010

Y HC THC HNH (864) - S 3/2013



51

ứng dụng tạo plasmid tái tổ hợp để nghiên cứu các chủng vi rút Rhino
lu hành tại Khánh Hòa và Bình Định năm 2008-2010

Huỳnh Kim Mai, Trịnh Thị Xuân Mai
Vin Pasteur Nha Trang

TểM TT
30 chng vi rỳt Rhino thu thp t nhng bnh
nhõn nhim trựng ng hụ hp cp hai tnh Khỏnh
Hũa v Bỡnh nh t nm 2008 n nm 2010 c
ng dng to plasmid tỏi t hp gii t vựng gen
5UTR-VP4/2 ca vi rỳt Rhino. Kt qu phõn tớch trỡnh
t cho thy, cú s lu hnh ca c 3 loi HRV-
A, HRV-B, v HRV-C, trong ú, HRV-A chim u
th (50,0%), tip n l HRV-C (33,3%) v cui cựng
l HRV-B (16,7%). T l mc ca cỏc loi cú s khỏc
bit rừ theo nhúm tui (p<0.05). Tr em nh ch
yu mc HRV-C, trong khi ú ngi ln li mc
HRV-A. Ngoi ra, kt qu phõn tớch cõy ph h cũn
cho thy, cỏc chng vi rỳt Rhino trong bi nghiờn cu
cng cú s bin i a dng trong trỡnh t nucleotit
v phõn thnh nhiu kiu huyt thanh khỏc nhau.
Cỏc chng HRV-A trong bi nghiờn cu cú liờn quan
n cỏc kiu huyt thanh HRV56, HRV47,
HRV81, HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12,

cũn HRV-B li cú kiu huyt thanh HRV92, HRV35,
HRV87, HRV-C thỡ cú tng quan gn vi cỏc chng
NAT001_CA (M), C025-Hongkong, NAT 045_CA
(M); N4, N10 (Thng Hi), v HRVC-35. S bin
i a dng cú th l nguyờn nhõn khin cho Rhino l
tỏc nhõn hng u trong cỏc ca nhim vi rỳt hụ hp
min Trung Vit Nam.
T khoỏ: Vi rỳt Rhino, HRV-A, HRV-B, HRV-C
SUMMARY
5UTR-VP4/2 nucleotide fragment of 30
Rhinovirus from ARI patients in Khanh Hoa and Binh
Dinh province collected during 2008 to 2010
were cloned for sequencing. Sequencing analysis
results indicated that all HRV-A, HRV-B, and HRV-C
were detected with the highest proportion of HRV-A
(50%), followed by HRV-C (33.3%) and HRV-B
(16.7%). Distribution of each species was
significantly different by age groups. HRV-C
was predominant in children while HRV-A in adult. In
addition, phylogenetic tree analysis showed that the
Rhino strains in this study were diverse in nucleotide
sequence and distributed into several different
serotypes such as HRV56, HRV47, HRV81,
HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12 (for
HRV-A), HRV92, HRV35, HRV87 (for HRV-B).
HRV-C related to NAT001_CA (USD), C025-
Hongkong, NAT 045_CA (USD); N4, N10
(Shanghai), and HRVC-35. The genetic diversity may
induced the turnover of rhinovirus which was a
leading cause of respiratory virus infections in Central

Vietnam.
Keyword: Rhinovirus, HRV-A, HRV-B, HRV-C
T VN
Hi chng viờm ng hụ hp cp l bnh rt
ph bin v d b mc phi mi la tui, c bit l
tr em. Bnh do tỏc nhõn vi rỳt hụ hp gõy ra nh vi
rỳt Rhino (HRV), vi rỳt hụ hp hp bo (RSV), vi rỳt
cỳm, vi rỳt ỏ cỳm (parainfluenza), v.v , trong s
ú, Rhino l vi rỳt chim u th nht [1,4]. Cú
hn 100 kiu huyt thanh (serotype) ca vi rỳt
Rhino ó c xỏc nh v phõn thnh ba loi chớnh
HRV-A, B, C [10]. T l mc vi rỳt Rhino cng rt ph
bin min Trung Vit Nam [8], tuy nhiờn, vic xỏc
nh s phõn loi cng nh trỡnh t gen ca vi rỳt
Rhino vn cha cú nghiờn cu no cụng b. Do vy,
ti ny ó ng dng k thut to dũng gii trỡnh
t vựng gen 5UTR-VP4/2 ca vi rỳt Rhino v so sỏnh
vi cỏc chng ó cụng b trờn th gii nhm xỏc nh
loi, s liờn quan n cỏc kiu huyt thanh v c
im dch t hc ca mt s chng vi rỳt Rhino lu
hnh ti hai tnh Khỏnh Ho v Bỡnh nh t nm
2008-2009.
MU V PHNG PHP NGHIấN CU
1. Mu nghiờn cu: Bao gm 30 mu dch ngoỏy
hng ca bnh nhõn cú triu chng viờm ng hụ
hp cp thu thp ti hai tnh Khỏnh Hũa, v Bỡnh nh
t nm 2008- 2010, cú kt qu xột nghim dng
tớnh vi vi rỳt Rhino v khụng ng nhim vi cỏc vi
rỳt hụ hp khỏc.
2. Phng phỏp nghiờn cu: on gen

5UTR-VP4/2 ca vi rỳt Rhino c khuych i
bng phn ng RT-PCR, sau ú c tinh sch v
gn chốn vo plasmid pGEMđ -T (Promega) to
plasmid tỏi t hp. Plasmid tỏi t hp tip tc c
s dng lm khuụn cho phn ng gii trỡnh t on
chốn ca vi rỳt Rhino vi 4 cp mi M13-F, M13-R,
5UTR-F v VP4/2-R. Kt qu gii trỡnh t c x lý
bng cỏc phn mm CLC viewer 6.5.3, FinchTV v
Mega 5.0.
KT QU
1. Kt qu to plasmid tỏi t hp: ó to c
thnh cụng 30 mu plasmid tỏi t hp cha on
5UTR-VP4/2 (di khong 923 bp) ca vi rỳt Rhino
nm chốn gia hai v trớ enzyme ct gii hn
EcoRI cú trỡnh t (5-GAATTC-3) ca vector
pGEM-T (Hỡnh 1).
2. Kt qu xỏc nh s phõn loi ca vi rỳt
Rhino: Vi 30 mu phõn tớch, ó xỏc nh vi rỳt
Rhino cú 3 loi HRV-A, HRV-B, v HRV-C ng vi 3
nhỏnh ca cõy ph h (hỡnh 2A), trong ú cú 15 mu
thuc loi HRV-A (chim t l 50,0 %), 5 mu thuc
loi HRV-B (chim t l 16,7%), v 10 mu thuc
loi HRV-C (chim t l 33,3%) (hỡnh 2B).
Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013



52

Đoạn chèn

Vi rút Rhino

(~923bp)



Hình 1: Cấu trúc của plasmid tái tổ hợp thu được.

A













B
Hình 2: (A) Cây phả hệ phân loài của vi rút Rhino
trong bài nghiên cứu. (B) Tỷ lệ phân bố của các loài.
3. Đặc điểm dịch tễ học của các ca bệnh nhiễm
vi rút Rhino: So sánh sự phân bố theo tỉnh, năm, giới
tính cho thấy tỷ lệ phân bố của 3 loài HRV-A, B, và C có
sự khác nhau, tuy nhiên sự khác nhau chưa có ý nghĩa
thống kê (p>0.05). Riêng đối với phân bố theo nhóm
tuổi, sự khác biệt lại rõ rệt và có ý nghĩa (p<0.05). Theo
đó, nhóm tuổi trẻ em chủ yếu mắc HRV-C trong khi ở
người lớn lại chủ yếu mắc HRV-A (hình 3).
4. Kết quả phân tích các kiểu huyết thanh của
vi rút Rhino: Phân tích cây phả hệ cho thấy, các
chủng HRV-A trong bài nghiên cứu có liên quan
đến các kiểu huyết thanh HRV56, HRV47, HRV81,
HRV67, HRV24, HRV20, HRV49, HRV12, còn các

chủng HRV-B lại có kiểu huyết thanh HRV92,
HRV35, HRV87 trong khi đó HRV-C có tương quan
gần với các chủng NAT001_CA (Mỹ), C025-
Hongkong, NAT 045_CA (Mỹ); N4, N10 (Thượng
Hải), và HRVC-35.

HÌNH 1 TRANG
Y HỌC THỰC HÀNH (864) - SỐ 3/2013



53

BÀN LUẬN
Cả 3 loài HRV-A, B, C đều được xác định có lưu
hành tại Khánh Hoà và Bình Định, hai tỉnh thuộc khu
vực miền Trung Việt Nam. Trong đó, HRV-A và C
chiếm ưu thế. Kết quả này tương đồng với nhiều
công bố của các tác giả khác trên thế giới như tác
giả Wisdom A và cs, 2009, nghiên cứu tỷ lệ
nhiễm HRV trên bệnh nhân viêm đường hô hấp ở
Anh cho kết quả tỷ lệ HRV-A chiếm cao nhất với
63%, HRV-C chiếm 30%, HRV-B chiếm tỷ lệ thấp với
7% [7]. Tác giả Huang T và cs, 2009, tác giả Heidi E
Smut và cs, 2011, công bố tỷ lệ HRV-C chiếm ưu thế
ở trẻ em bị viêm đường hô hấp cấp ở Thượng Hải
(Trung Quốc) và Châu Phi [5,3]. Cả hai loài A, và C
đều có liên quan đến tính chất gây bệnh nặng của vi
rút Rhino [2,6]. Như vậy, kết quả lưu hành chiếm ưu
thế của chủng HRV-A, và HRV-C giúp cảnh báo việc

nhiễm vi rút Rhino ở miền Trung Việt Nam rất cần
được sự quan tâm của ngành Y tế. Về mặt dịch tễ
học, tuy nghiên cứu trên cỡ mẫu nhỏ nhưng cũng
cho thấy rõ sự khác nhau giữa tỷ lệ nhiễm vi rút
Rhino ở nhóm lứa tuổi trẻ em và người lớn. Kết quả
này tương tự với kết quả của tác giả Wisdom và cs.
HRV-C chiếm tỷ lệ cao ở lứa tuổi 1-2, không thấy
HRV-C ở lứa tuổi 37-65 và trên 65 [7]. Nghiên cứu
của tác giả Huang T và cs cũng kết luận tỷ lệ HRV-C
ở trẻ em là chiếm ưu thế [5]. Bài nghiên cứu còn cho
thấy sự đa dạng về di truyền trong các chủng HRV ở
miền Trung Việt Nam thể hiện ở mối liên quan đến 17
kiểu huyết thanh khác nhau (trung bình cứ khoảng
1,7 chủng được phát hiện là thuộc một kiểu huyết
thanh). Nhận định này phù hợp với công trình nghiên
cứu của tác giả Mardis và cs, 2007 , vi rút Rhino có
trình tự di truyền rất đa dạng điều này lý giải tỷ lệ
nhiễm vi rút Rhino thường cao ở các bệnh nhân viêm
đường hô hấp [9].
KẾT LUẬN
Bài nghiên cứu đã giúp xác định được loài, và sự
liên quan đến các kiểu huyết thanh của một số chủng
vi rút Rhino lưu hành tại Khánh Hoà và Bình Định
năm 2008-2010. Kết quả cho thấy cả 3 loài HRV-A,
B, C đều phát hiện lưu hành ở miền Trung Việt Nam,
trong đó HRV- A chiếm tỷ lệ cao nhất (50,0%), tiếp
đến là HRV-C (33,3%), và HRV-B chỉ chiếm một tỷ lệ
thấp (16,7%). Tỷ lệ mắc giữa các loài cũng có sự
khác biệt rõ theo nhóm tuổi, HRV-C chủ yếu mắc ở
trẻ nhỏ, HRV-A lại chủ yếu ở nhóm tuổi lớn hơn. Các

chủng có sự biến đổi đa dạng trong trình tự nucleotit
và tương ứng với nhiều kiểu huyết thanh khác nhau.
Sự biến đổi đa dạng có thể là nguyên nhân khiến cho
Rhino là tác nhân hàng đầu của các ca nhiễm vi rút
hô hấp ở miền Trung Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. De Almeida MB, Zerbinati RM, Tateno AF,
Oliveira CM, Romão RM, Rodrigues JC, Pannuti
CS, da Silva Filho LV, (2010), “Rhinovirus C and
respiratory exacerbations in children with cystic
fibrosis”, Emerg Infect Dis, 16(6): 996-9.
2. Fuji N, Suzuki A, Lupisan S, Sombrero L,
Galang H, Kamigaki T, Tamaki R, Saito M,
Aniceto R, Olveda R, Oshitani H, (2011),
“Detection of human Rhinovirus C viral genome in
blood among children with severe respiratory
infections in the Philippines”. PLoS One,
6(11):E27247.
3. Heidi E Smuts, Lesley J Workman, Heather J
Zar, (2011), “Human Rhinovirus infection in young
African children with acute wheezing”, BMC
Infectious Diseases, 11:65.
4. Heikkinen T, Jarvinen A, (2003), “The
common cold”. Lancet, 361:51–59.
5. Huang T, Wang W, Bessaud M, Ren P, Sheng
J, Yan HJ, Zhang J, Lin X, Wang YJ, Delpeyroux F,
and Deubel V, (2009), “Evidence of recombination
and genetic diversity in human Rhinoviruses in
children with acute respiratory infection”, PLoS
ONE, 4 (7), E6355.

6. Longtin J, Marchand-Austin A, Winter AL,
Patel S, Eshaghi A, Jamieson F, Low DE, Gubbay
JB, (2010), “Rhinovirus outbreaks in long-term
care facilities, Ontario, Canada”, Emerg Infect Dis,
16(9):1463-5.
7. Wisdom A, Leitch EC, Gaunt E, Harvala
H, Simmonds P, (2009), “Screening respiratory
samples for detection of human Rhinoviruses (HRVs)
and enteroviruses: comprehensive VP4-VP2 typing
reveals high incidence and genetic diversity of
HRV species C”. J Clin Microbiol., 47(12):3958-67.
8. Yoshida LM, Suzuki M, Yamamoto T,
Nguyen HA, Nguyen CD, Nguyen AT, Oishi K, Vu
TD, Le TH, Le MQ, Yanai H, Kilgore PE, Dang DA,
Ariyoshi K, (2010), “Viral pathogens associated
with acute respiratory infections in central
Vietnamese children”, Thepediatric Infectious
Disease Journal, Vol 29, 75-77.
9. Mardis ER, Li H, DeRisi JL, (2007),
“Genome-wide diversity and selective pressure in
the human Rhinovirus”. Virol J, 3;4:40.
10. Palmenberg AC, Spiro D, Kuzmickas R, Wang
S, Djikeng A, Rathe JA, Fraser- Liggett CM, and
Liggett SB, (2009), “Sequencing and analyses of
all known human Rhinovirus genomes reveal
structure and evolution”, Science, 324 (5923), 55-59.