Tóm tắt luận án nghiên cứu chọn chủng vi rút cúm a h5n1 hiện đang lưu hành tại việt nam tạo được đáp ứng miễn dịch bảo hộ cao trên vịt

bộ giáo dục v đo tạo bộ nông nghiệp v ptnt
viện thú y


NGUYễN THị HồNG THắM


nghiên cứu chọn chủng vi rút cúm a/h5n1
hiện đang lu hnh tại việt nam tạo đợc
đáp ứng miễn dịch bảo hộ cao trên vịt


Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc thỳ y
Mó s: 62 62 50 10








H nội, 2014


Công trình được hoàn thành tại: Viện Thú Y


Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Viết Không

Phản biện 1:
GS.TS. Hồ Đình Chúc

Phản biện 2:
GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên

Phản biện 3:
PGS. TS. Khuất Hữu Thanh






Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp
tại Viện Thú y, 86 đường Trường Chinh, Đống Đa, Hà Nội
vào hồi: giờ ngày tháng năm







Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Viện Thú y;
- Thư viện Quốc gia

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1: Nguyễn Thị Hồng Thắm, Bùi Ngọc Anh, Phạm Thị Nga, Đào
Thanh Vân, Phạm Hồng Sơn và Nguyễn Viết Không. 2014. “Đặc tính của vi
rút cúm A Clade 2.3.2.1C phân lập từ ổ dịch năm 2012”. Tạp chí Khoa học
kỹ thuật Thú y, tập XXI số 6 - 2014, trang 12-19.
2: Vuong Nghia Bui, Tung Duy Dao, Th
am Hong Thi Nguyen, Lien
Thi Nguyen, Anh Ngoc Bui, Dai Quang Trinh, Nga Thi Pham, Kenjiro Inui,
Jonathan Runstadler, Haruko Ogawa, Khong Viet Nguyen, Kunitoshi Imai.
2014. “Pathogenicity of an H5N1 avian influenza virus isolated in Vietnam in
2012 and reliability of conjunctival samples for diagnosis of infection”. Virus
Research 179: pp125–132
3: Vuong Nghia Bui, Haruko Ogawa, Dai Quang Trinh, Tham Hong
Thi Nguyen, Nga Thi Pham
, Duc Anh Truong, Anh Ngoc Bui, Jonathan
Runstadler, Kunitoshi Imai, Khong Viet Nguyen. 2014. Genetic
characterization of an H5N1 avian influenza virus from a vaccinated duck
flock in Vietnam. Virus Genes 49: pp278–285
-1-
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) do vi rút cúm A/H5N1 thể độc lực
cao (HPAI) là một bệnh truyền nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho nhiều

nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm cho người.
Từ khi dịch do vi rút cúm A/H5N1 bùng phát đầu tiên tại Hồng Kông năm
1997 [13] đến tháng 10/2014, dịch đã xảy ra ở 65 quốc gia, trong đó Việt Nam là
nước có nhiều ổ dịch cúm gia cầm nhất (2720 ổ dịch) [6]
; và có 668 người nhiễm
vi rút cúm A/H5N1, trong đó có 393 người chết [12]. Ở nước ta, đại dịch cúm gia
cầm do vi rút cúm A/H5N1 bùng phát vào cuối năm 2003 [1], giết hại nhiều gia
cầm, gây thiệt hại to lớn về kinh tế. Bệnh đặc biệt nguy hiểm khi lây nhiễm cho
người với
tỷ lệ chết cao. Từ 2003 đến nay đã có 127 người nhiễm cúm A/H5N1
trong đó 64 trường hợp tử vong [11]. Sự xuất hiện biến chủng mới do lây lan từ
bên ngoài và tái tổ hợp từ những chủng đã lưu cữu làm cho diễn biến tình hình
dịch cúm ở nước ta rất phức tạp.
Nguồn dịch cúm A/H5N1 khó kiểm soát nhất là ở vịt do chúng có thể nhiễm vi
rút mà không có biểu hiện lâm sàng và bài thải một lượng lớn vi rút vào môi
trường, lây truyền cho gia cầm khoẻ và con người [
4].
Công tác phòng chống dịch cúm gia cầm ở nước ta chủ yếu dựa vào các biện
pháp tổng hợp, trong đó văc xin là công cụ phòng bệnh hữu hiệu, sự phụ thuộc vào
nguồn nhập ngoại đôi khi không đáp ứng kịp sự xuất hiện biến chủng vi rút mới.
Hơn nữa, các văc xin hiện tại có độ bảo hộ không ổn định đối với vịt, đòi hỏi cấp
bách nghiên cứu tạo văc xin.
Để phát triển văc xin phòng bệnh nói chung và văc xin cúm
gia cầm nói riêng,
với công nghệ bất hoạt vi rút dùng nguyên chủng hay chủng di truyền ngược, công
nghệ tinh sạch kháng nguyên hay tái tổ hợp, khâu đầu tiên vẫn là lựa chọn được
chủng có đặc tính kháng nguyên phù hợp với các chủng vi rút đang lưu hành.
Trong nghiên cứu này chúng tôi bắt đầu tiến hành “Nghiên cứu chọn chủng vi rút
cúm A/H5N1 hiện đang lưu hành tại Việt Nam tạo được đáp ứng miễn dịch bảo
hộ cao trên vịt”.

2. Mục tiêu của đề tài:
Nhằm t
iến tới chủ động chế tạo được vắc xin phòng bệnh do cúm A/H5N1 ở
thủy cầm (vịt) có hiệu quả cao, mục tiêu cụ thể của đề tài là: Chọn được chủng vi
rút cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam làm chủng sản xuất văc xin, có khả năng
tạo m
iễn dịch bảo hộ cao cho vịt nhằm tiến tới chủ động chế tạo vắc xin phòng
bệnh cúm gia cầm, đặc biệt là cho thủy cầm nuôi ở nước ta.

-2-
3. Ý nghĩa khoa học của đề tài:
1. Thành công của đề tài đã chứng m
inh được khả năng chọn lựa (một cách hệ
thống từ các chủng phân lập) được 1 chủng đại diện có tính gây miễn dịch cao, có
khả năng bảo hộ đối với nguyên chủng và các chủng cùng clade, đồng thời có khả
năng bảo hộ chéo với các chủng dị clade vi rút cúm A/H5N1 lưu hành trước đó
(hoặc các chủng “tiền thân”).
2. Đề tà
i đã cung cấp trình tự sàng lọc chủng để lựa chọn chủng vi rút làm văc
xin khi có biến chủng mới xuất hiện đảm bảo tính miễn dịch phù hợp và khả năng
nhân lên tốt trong các điều kiện phòng thí nghiệm thông dụng.
4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
1. Cả 2 giống gốc vi rút tạo ra từ 1 chủng đại diện cho vi rút clade 2.3.2.1c
đang lưu hành đều có thể sử dụng để chế tạo văc xin vô
hoạt phòng bệnh do cúm
A/H5N1 ở gia cầm nói chung và vịt nói riêng (trong đó chủng thích nghi trên nuôi
cấy tế bào có ưu thế hơn về thao tác an toàn sinh học); văc xin chế từ những chủng
này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng là tạo được miễn dịch kháng thải trùng, miễn
dịch bảo hộ với các chủng đang lưu hành phổ biến đồng thời kháng cả các chủng
“tiền thân” hiện còn đang lưu hành ở một số địa phương.

2. Chủng vi rút A/Dk/VN/QB7412 với các đặc tính di truyền, kháng nguyên ổn
định, sẽ là nguồn vi sinh vật tốt dùng trong tạo chủng Reverse genetic an toàn hơn
cho người sản xuất văc xin.
5. Đóng góp mới của đề tài:
Kết quả của đề tà
i có 4 đóng góp mới:
1. Tạo được hai giống gốc từ một chủng vi rút cúm A/H5N1 cho miễn dịch bảo
hộ cao trên vịt kháng chủng đang lưu hành (clade 2.3.2.1c) và kháng chéo các
chủng đã lưu hành trước đây (các clad
e 1, 2.3.2.1a, và 2.3.2.1b).
2. Đã thiết lập được quy trình cấy truyền vi rút trên phôi trứng gà 10 ngày tuổi
và tế bào MDCK có hiệu giá vi rút cao và thích ứng được vi rút trên nuôi cấy tế
bào để sản xuất văc xin vô hoạt.
3. Phát hiện vùng “thích ứng ký chủ mới” ở gene HA2 và kiểu gene xác định
và phân biệt chủng thích nghi ở các “ký chủ” khác nhau với chủng tiền thân đối
với chủng A/Dk/VN/QB7412.
4. Đã thiết lập được điều kiện sử dụng chủng vi rút cúm
A/H5N1 phân lập gây
nhiễm cho vịt với tỷ lệ gây chết ổn định trên 80% dùng trong thử thách hiệu lực
văc xin cúm A/H5N1.
6. Bố cục của luận án: Luận án gồm 162 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1:
Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Đối tượng, nội dung, vật liệu và phương
pháp (27 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (77 trang); Kết luận và kiến nghị
(3 trang); Danh mục công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (20 trang
có 249 tài liệu tham
khảo); Luận án có 38 bảng và 13 hình.


-3-
1. Chương 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.1. Khái niệm, lịch sử bệnh cúm gia cầm
Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gia cầm, bệnh đã tồn
tại từ lâu trên thế giới, tuy nhiên chỉ từ sau đại dịch cúm gia cầm do vi rút cúm
A/H5N1 khởi phát ở Hồng Kông năm 1997, người cũng bị nhiễm vi rút cúm
A/H5N1 và tử vong, bệnh này mới được tập trung nghiên cứu có hệ thống.
1.2. Vi rút cúm gia cầm, đặc tính vi rút cúm A/H5N1
1.2.1.

Phân loại vi rút cúm
Lịch sử đã ghi nhận, vi rút cúm A trên tất cả các loài đều có nguồn gốc từ thủy
cầm. Mặt khác, trong số 6 type vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae tất cả các vi rút ở
thủy cầm đều thuộc type A.
1.2.2.

Vi rút cúm A/H5N1, clade (tộc) và tên gọi
Tên vi rút: Theo danh pháp quốc tế, tên gọi cho vi rút cúm A/H5N1 thể độc lực
cao bắt đầu bằng type, sau đó đến tên ký chủ, địa danh phát hiện vi rút và cuối
cùng là mã số phòng thí nghiệm, thí dụ rút cúm A/Goose/Guangdong/1/96.
Tên tộc vi rút: Theo WHO/OIE/FAO, tên tộc (clade) vi rút được đánh số thập
phân đến 4 ký tự, nội tộc được thêm dấu chấm. Với những tộc tiếp tục phân kỳ,
đến ký tự thứ 5, tách tộc bằng chữ theo alpha beta. Thí dụ clade 2.3.2.1c.
1.2.3.

Một số đặc tính sinh học
Đặc tính sinh học quan trọng nhất của vi rút cúm A/H5N1 là tính thích ứng và
gây nhiễm đa vật chủ. Độc lực của mỗi chủng vi rút có thể là cao (Highly
pathogeneic: HPAI) hay thấp (Low pathogeneic: LHAI) tùy thuộc vào bản chất di
truyền của chúng và loài ký chủ. Có 3 subtype H (H5, H7 và H9) thường gây bệnh
cho gia cầm và người.
Vi rút cúm A/H5

N1 có khả năng nhân lên trên phôi trứng nhưng do độc lực
cao thường gây chết phôi quá nhanh, không sản sinh đủ lượng vi rút để chế tạo văc
xin. vi rút cũng có thể thích nghi trên tế bào thận chó (MDCK), dễ công nghiệp hóa
trong phát triển văc x
in.
Vi rút cúm A/H5N1 vỏ trần, nhậy cảm với các chất sát trùng, ánh sáng và nhiệt
độ có thể tiệt trùng sau vệ sinh cơ giới. Có thể bảo quản vi rút ở nhiệt độ âm sâu và
đông khô.
1.2.4.

Đa dạng sinh học, di truyền, biến dị
Vi rút cúm A/H5N1 có hai đặc tính di truyền quan trọng: Genome phân 8 đoạn,
dễ tái tổ hợp khi đồng nhiễm và tích lũy đột biến điểm do không có enzyme chỉnh
sửa khi sao chép. Biến đổi của vi rút vì vậy là liên tục và chủng mới luôn được tạo
ra từ chủng tiền thân.
1.2.5.

Kháng nguyên bề mặt: protein HA và NA
HA và NA là hai loại protein chính trên bề mặt vi rút do vậy có tính quyết định
kháng nguyên. Protein NA là một enzyme, có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập
của vi rút vào tế bào chủ.
Protein HA là thành phần kháng nguyên chủ yếu gây miễn dịch cho gia cầm.
Protein HA mang epitope nhận biết thụ thể, đồng thời mang yếu tố chỉ báo độc lực.

-4-
Ngoài ra, HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Kháng thể đặc hiệu có khả
năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Đặc tính này được sử dụng trong phản ứng HI
để đánh giá hiệu giá kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm.
Kháng nguyên bề mặt HA quyết định tính đặc hiệu loài, độc lực và tính kháng
nguyên nên trở thành đối tượng nghiên cứu chính trong sản xuất văc xin.

1.3. Miễn dịch chống bệnh Cúm gia cầm
Khác với gia súc, miễn dịch dịch thể ở gia cầm do kháng thể IgY đảm nhiệm.
Do tính phân đoạn, dễ tái tổ hợp, người ta không sử dụng văc xin nhược độc
phòng CGC (ngoại trừ vi rút dị loài làm
vật mang). Những yếu tố ảnh hưởng đến
đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin vô hoạt gồm chất lượng kháng nguyên, liều
lượng, bổ trợ, đường tiêm, số lần lặp lại và
ảnh hưởng của miễn dịch qua trứng.
Ngoài ra còn có sự phụ thuộc loài trong đó đáp ứng miễn dịch ở vịt có một số điểm
bất lợi và chưa được nghiên cứu kỹ.
1.4. Phòng chống bệnh cúm gia cầm
Đối với các nước phát triển, phòng chống dịch do vi
rút cúm A/H5N1 chủ yếu
dựa vào các giải pháp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh. Phòng bệnh cho gia cầm
là một trong những biện pháp tích cực n
hất đề phòng người nhiễm bệnh, dẫn đến
tái tổ hợp và gây thành đại dịch. Những biện pháp khác như chuẩn bị thuốc kháng
vi rút và văc xin cho người cũng được thử nghiệm. Văc xin phòng bệnh cho gia
cầm chỉ ở những nước có chương trình quốc gia về sử dụng văc xin.
1.5. Tình hình dịch và biến chủng vi rút cúm A/H5N1 ở Việt Nam
1.5.1.

Diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam
Từ 2003-2007, Việt Nam đã trải qua 5 đợt dịch cúm gia cầm, sau đó bệnh
thường tái phát ở dạng dịch địa phương. Ngoài gây chết gia cầm, thiệt hại kinh tế
đến nay đã có 127 người nhiễm bệnh, trong đó 64 tử vong. Nghiên cứu các biện
pháp phòng chống là một yêu cầu cấp bách.
1.5.2.

Diến biến sự xuất hiện vi rút cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Đã có 8 clade vi rút cúm A/H5N1 xuất hiện ở Việt Nam, trong đó 5 clade lưu
hành phổ biến. Những chủng/biến chủng vi rút này có thể do lây lan từ bên ngoài
hoặc do tái tổ hợp hình thành trong nước. Để phòng bệnh, chương trình Quốc gia
áp dụng các biện pháp tổng hợp, trong đó văc xin là một biện pháp quan trọng.
1.6. Vắc xin cúm A/H5N1 nội địa và tồn tại cần nghiên cứu
Diễn biến “biến chủng” của vi rút cúm A/H5N1 xảy ra rất nhanh, phát triển
văc xin luôn là đòi hỏi cấp bá
ch, đặc biệt là phát triển và sản xuất văc xin nội địa.
Tiêm phòng là biện pháp chủ động phòng dịch cúm, trong đó phòng bệnh cho thủy
cầm, vịt nuôi vốn được coi là loài mang trùng là hết sức quan trọng.
Văc xin đã bắt đầu được sản xuất tại Việt Nam nhưng chủng văc xin do nước
ngoài tạo ra từ chủng đã lưu hành trước đây, ít hoặc không còn phù hợp để phòng
bệnh do các chủng mới. Mấu c
hốt của phát triển văc xin là lựa chọn chủng, tạo
giống gốc có miễn dịch cao kháng chủng đang lưu hành ở thủy cầm (vịt).

-5-
2. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu
Đối tượng
- Vi rút cúm A/H5N1 (phân lập tại Việt Nam từ 2003 đến 7/2013)
- Gene HA vi rút cúm A/H5N1
- Đáp ứng miễn dịch dịch thể của vịt tiêm văc xin vô hoạt từ chủng vi rút cúm
A/H5N1 lựa chọn.
Nội dung
(1) Nghiên cứu chọn chủng vi rút để chế tạo văc xin cúm A/H5N1
- Nghiên cứu xác định các subtype vi rút cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến tại
Việt Nam
- Nghiên cứu lựa chọn sơ bộ chủng tiềm năng để sản xuất văc xin từ nguồn vi
rút hồi cứu và phân lập

- Nghiên cứu lựa chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 đại diện cho clade 2.3.2.1c
hiện đang lưu hành
- Nghiên cứu quan hệ di truyền và kháng nguyên giữa đại diện các subtype vi

rút cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến tại Việt Nam
(2) Nghiên cứu thích nghi chủng tiềm năng để làm giống gốc sản xuất văc xin
- Nghiên cứu xác định đặc tính di truyền của chủng tiềm năng làm
giống gốc
sản xuất văc xin
- Nghiên cứu thích nghi vi rút chủng tiềm năng trên phôi trứng gà
- Nghiên cứu thích nghi vi rút chủng tiềm năng trên tế bào dòng
- Nghiên cứu đặc tính độc lực của chủng đã thích nghi qua tiếp đời
- Nghiên cứu đặc tính di truyền của chủng đã thích nghi qua tiếp đời
- Nghiên cứu đặc tính kháng nguyên của chủng đã thích nghi qua tiếp đời
(3) Nghiên cứu khả năng tạo miễn dịch bảo hộ của văc xin vô hoạt chế từ
chủng gốc đã thích nghi
- Nghiên cứu khả năng gây m
iễn dịch của văc xin vô hoạt chế từ chủng gốc đã
thích nghi trên gia cầm
- Nghiên cứu xác định liều thử thách cường độc sử dụng trong đánh giá hiệu
lực của văc xin
- Nghiên cứu khả năng bảo hộ nguyên chủng và bảo hộ chéo của văc xin cúm
vô hoạt chế từ chủng gốc đã thích nghi
- Nghiên cứu đặc tính m
iễn dịch bảo hộ và thải trùng của văc xin cúm vô hoạt
chế từ chủng gốc đã thích nghi
- Nghiên cứu thử nghiệm bảo hộ của văc xin cúm A/H5N1 vô hoạt chế từ
chủng gốc trên vịt nuôi tại thực địa.
2.2. Thời gian, địa điểm
Thời gian: Từ 12/2011 đến 10/

2014
Địa điểm. Thực địa: Mẫu bệnh phẩn dùng để phân lập vi rút cú
m A/H5N1
được thu thập từ các địa phương thông báo có dịch. Thử đáp ứng miễn dịch thực
địa tại trại chăn nuôi gia cầm thôn Thụy Ứng, thị trấn Phùng, Đan Phượng, Hà Nội.

-6-
Phòng thí nghiệm: Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 Plus của Viện
Thú Y và Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
Động vật thí nghiệm, vịt, gà, gà đẻ và trứng không mang kháng thể kháng vi
rút cúm A/H5N1 chủ yếu từ nguồn nuôi ở khu cách ly tại Viện Thú Y; tế bào dòng
do ĐH Hồng Kông cung cấp.
Vi rút cúm A 268 chủng trước năm 2010 hồi cứu từ nguồn lưu trữ tại Viện Thú
Y, 119 chủng phân lập từ 2010 đến 7/2013; 4 chủng vi rút
cúm A/H5N1 tham
chiếu phòng thí nghiệm do Viện Thú Y cung cấp. Huyết thanh chuẩn do PTN tham
chiếu Italia và Viện Thú Y cung cấp.
Sử dụng 4 loại kít chuẩn phân tích DNA và các hóa chất siêu sạch. Phòng thí
nghiệm an toàn sinh học BSL2 plus và ABSL2 plus và các trang thiết bị hiện đại.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài luận án đã sử dụng 19 kỹ thuật và phương pháp khác nhau:
2.4.1. Phương pháp RT-PCR
2.4.2. Phương pháp realtime RT-PCR
2.4.3. Phương pháp giải trình tự
2.4.4. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide và cây phả hệ
2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý bệnh phẩm
2.4.6. Phương pháp phân lập vi rút, cấy truyền trên phôi trứng gà
2.4.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào
2.4.8. Phương pháp phân lập và cấy truyền vi rút trê

n tế bào MDCK
2.4.9. Phương pháp chuẩn bị kháng nguyên cúm A/H5N1
2.4.10. Phương pháp bất hoạt vi rút cúm A/H5N1
2.4.11. Phương pháp lọc cô đặc vi rút
2.4.12. Phương pháp bổ trợ, tạo nhũ kháng nguyên
2.4.13. Phương pháp chế tạo kháng thể đa dòng
2.4.14. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination- HA)
2.4.15. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
2.4.16. Phản ứng HI xác định type huyết thanh
2.4.17. Phương pháp xác định chỉ số gây bệnh IVPI
2.4.18. Phương pháp xác định LD50 và liều gây chết 100% gà thí nghiệm
2.4.19. Phương pháp xác định MLD và liều gây chết 80% vịt thí nghiệm
2.5. Thiết kế và bố trí thí nghiệm
2.5.1. Bố trí thí nghiệm chọn chủng vi rút cú
m A/H5N1
2.5.2. Bố trí thí nghiệm chọn chủng đại diện cho clade 2.3.2.1
2.5.3. Phương pháp thích nghi vi rút cúm A/H5N1 trên phôi và tế bào
2.5.4. Phương pháp đánh giá sự ổn định của vi rút cúm A/H5N1 tiếp đời
2.5.5. Phương pháp đánh giá đáp ứng m
iễn dịch ở gà, vịt phòng thí nghiệm
2.5.6. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch ở gà, vịt tại thực địa
2.5.7. Phương pháp phân tích số liệu

-7-
3. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu chọn chủng vi rút để chế tạo văc xin cúm A/H5N1
3.1.1.

Kết quả xác định subtype vi rút cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam
Để xác định các subtype vi rút cúm A/H5N1 đã lưu hành tại Việt Nam, chúng

tôi đã truy cập genbank quốc tế, tải các trình tự gene HA của vi rút cúm A/H5N1
có nguồn gốc từ Việt Nam, lược bỏ những trình tự hoàn toàn giống nhau và xây
dựng cây phả hệ của gene HA. Kết quả được trình bày ở hình 3.1.

Từ kết quả phân tích phả hệ cho thấy, cho đến thời điểm tháng 7/2013, các vi
rút cúm A/H5N1 đã lưu hành ở Việt Nam chủ yếu gồm 5 clade chính: Clade 1;
clade 2.3.4, clade 2.3.2.1a, clade 2.3.2.1b và clade 2.3.2.1c.
3.1.2.

Kết quả lựa chọn sơ bộ chủng tiềm năng để sản xuất văc xin
Nguồn vi rút cúm A/H5N1
Chúng tôi đã sử dụng nguồn gene vi rút tại Viện thú y đến năm 2010 và các
chủng vi rút mới phân lập 2010-7/2013 để lựa chọn sơ bộ vi rút cúm A/H5N1 làm
ứng viên chủng vắc xin. Nguồn gốc chủng được trình bày ở bảng 3.1.
Ngân hàng vi rút gồm 268 chủng (trước 2010) và 119 chủng phân lập mới từ
2011 đến 7/2013. Trong tổng số 387 chủng qua sàng lọc sơ bộ bằng RT-PCR, sử
dụng các cặp mồi đặc hiệu cho H5 và N1, 227 chủng dương tính H5N1. Phân tích
ngẫu nhiên 90 chủng chúng tôi thu được 68 chủng có hiệu giá HA từ 7log
2
trở lên.

-8-
Bảng 3.1. Nguồn gốc vi rút cúm A/H5N1 trong lựa chọn sơ bộ
TT Thời gian
Số vi rút
(ngân hàng)
Số vi rút
H5N1*
Số lựa
chọn

Số có [HA]
≥ 7 log
2

Số giải trình
tự gene HA**
1
2003-2005 117 71 10 6 2
2
2006-2009 151 83 20 14 8
3
2010-2011 36 26 20 15 12
4
2012-7/2013 83 47 40 33 31
Tổng
387 227 90 68 53
*Kết quả RT-PCR xác định H5 và N1; **Chỉ tính số giải trình tự ở nghiên cứu này.
Nguồn gốc vi rút sơ tuyển theo clade vi rút cúm A/H5N1 đã lưu hành:
Chúng tôi đã giải trình tự phân đoạn 4 mã hóa cho gene HA của 53 chủng
(trong số 68 chủng có hiệu giá HA cao), phân tích phả hệ (hình 3.2) và thông tin
chi tiết về nguồn gốc chủng (bảng 3.2) cho biết trong bộ sưu tập 53 chủng sơ tuyển
này có đầy đủ vi rút đại diện các clade vi rút cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến nhất
ở Việt Nam từ 2003 đến 2013: 2 chủng thuộc clade 1, 12 chủng thuộc clade 2.3.4,
14 chủng thuộc clade 2.3.2.1a, 11 chủng clade 2.3.2.1b và 14 chủng clade 2.3.2.1c.

3.1.3.

Kết quả lựa chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 đại diện clade 2.3.2.1c
Để lựa chọn một chủng đại diện cho clade 2.3.2.1c hiện đang lưu hành chúng
tôi lần lượt khảo sát các chỉ tiêu nhân lên của 12 chủng (cùng clade như phân loại ở

hình 3.2) vi rút trên phôi gà, trên tế bào MDCK, chỉ tiêu độc lực vi rút và quan
trong nhất là chỉ tiêu đại diện kháng nguyên tính cho cả nhóm chủng. Kết quả lần
lượt được trình bày từ bảng 3.3 đến 3.7.

-9-

Tại bảng 3.3, kết quả xác định hiệu giá HA ở nước trứng tiếp đời cho thấy có 7
chủng với hiệu giá HA lần sau cao hơn lần trước và đạt 8log
2
HA. Đây là những
chủng sẽ ưu tiên lựa chọn do chúng tăng khả năng thích nghi trên phôi gà khi tiếp
đời. Xét về chỉ số gây nhiễm 50% phôi trứng (EID
50
, bảng 3.4), có 3 chủng cho chỉ
số 6,3log
10
EID
50
, cả ba chủng này đều thuộc nhóm có hiệu giá HA cao (bảng 3.3).
Bảng 3.5 so sánh đồng thời EID
50
và chỉ số TCID
50
cho biết có 03 chủng nhân
lên tốt cả trên trên phôi gà và trên tế bào MDCK, tuy nhiên trong số này chỉ có 2
chủng thuộc có EID
50
cao nhất.
Đối chiếu từ bảng 3.3 đến 3.5, chỉ có hai chủng: chủng A/MD/VNHN/72a/12
và chủng A/Dk/VN/QB7412 phù hợp cả 3 tiêu chí. Hai chủng này sẽ được ưu tiên

lựa chọn chủng để phát triển văc xin trên cả phôi trứng và tế bào.
Bảng 3.6. Trình tự axit amin
tại cleavage site của các chủng phân lập
Các Amino acid bề mặt Glycosyl
TT Tên chủng
Trình tự amino acid
Điểm cắt
129 140 141 154 155 162 189 140-2 165-7
1
A/Dk/VN/HN7212
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS
NIT
2
A/MD/VN/HN72a12
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
3
A/Dk/VN/HN7312
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS
NIT
4
A/Dk/VN/QB69a12
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
5
A/Dk/VN/QB69b12
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
6
A/Dk/VN/QB69e12
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
7
A/Dk/VN/HN73a12

PQRERRRKRGLF L N S G N K R NSS NNT
8
A/Dk/VN/QB7412
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
9
A/Dk/VN/HN7512
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
10
A/MD/VN/HN75b12
PQRERRRKRGLF L N S D N K R NSS NNT
11
A/MD/VN/HN10013
PQRERRRKRGLF L N T D N K R
NTS
NNT
12
A/DK/VN/VP10313
PQRERRRKRGLF L N T D N K R
NTS
NNT

-10-
Đặc tính chỉ báo di truyền về độc lực và kháng nguyên bề mặt: Vi rút cúm
A gây nhiễm cho gia cầm nhờ điểm cấu trúc trên protein HA1 nhận biết và bám
vào thụ thể trên tế bào của ký chủ.
Bảng 3.6. (trích đoạn những amino acid tại điểm cấu trúc quan trọng của
protein HA1) cho biết (i) Cả 12 chủng vi rút đều có điểm chỉ báo clevaege site là
PQRERRRKRGLF 10 axit amin kiềm (kiểu dòng Âu-Phi) thuộc loại có độc lực
cao (theo OFFLU); (ii) Hai điểm Glycosyl hóa NSS hoặc NTS
tại vị trí amino acid

140-142 và điểm NNT ở vị trí 165-167 (điểm thứ hai này được biết tương đồng với
chủng có độc lực cao); và (iii) Điểm quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên (nhận
biết kháng thể trung hòa) là đặc trưng của vi rút clade 2.3.2.1c : L129, N140, S141,
D154, N155, K162, và R189 (theo cấu trúc không gian mới đăng tải năm 2013).
Cấu trúc của protein HA của 12 chủng là tương đồng.
Về độc lực, chỉ số tiêm tĩnh mạch

(IVPI) của 12 chủng vi rút đều đạt 3,
chứng tỏ chúng đều là những chủng có độc
lực mạnh, không có sự khác biệt về chỉ số
IVPI nên không áp dụng được tiêu chí độc
lực cao hơn trong lựa chọn.
Tính tương đồng kháng nguyên giữa
các chủng vi rút phân lập: Chúng tôi đã
chế tạo kháng thể đa dòng từ hai chủng lựa
chọn ở phần trên, thực hiện phản ứng HI
với cả 12 chủng (bảng 3.7). Phản ứng
kháng nguyên-kháng thể nội nhóm cho
thấy: (i) tương đồng nhận biết chéo l
à cao
(trên 6,5log2 so với nguyên gốc 8log2);
(ii) kháng thể HTαQB7412 có khả năng
cho miễn dịch chéo với các chủng cao hơn
so với kháng thể HTαHN72a12. Như vậy
chủng A/Dk/VN/QB7412 có thêm ưu thế
được lựa chọn.
3.1.4.
Quan hệ di truyền và kháng nguyên giữa đại diện 5 clade phổ biến

Để xác định mối quan hệ của chủng được lựa chọn để phát triển văc xin với vi

rút các clade đã lưu hành phổ biến trước đây, chúng tôi phân tích tương quan di
truyền và kháng nguyên của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412 với 4 chủng đại diện
cho các clade lưu hành phổ biến trước đây. Sự lựa chọn những chủng này cũng
được tiến hành như quá trình lựa chọn chủng A/Dk/VN/QB7412 đã trình bày.
Bảng 3.8 cung cấp thông tin về nguồn gốc 4 chủng cùng chủng đã lựa chọn.
Quan hệ di truyền và
vị trí của 5 chủng đại diện được trình bày trong cây phả
hệ hình 3.3. Các chủng này xuất hiện vào các thời điểm khác nhau và thuộc về các
clade khác nhau (bảng 3.8 và hình 3.3). Bảng 3.9 cung cấp thông tin về tương đồng
trình tự nucleotide (phía trên bảng) và amino acid (phía dưới) giữa 5 chủng đại
diện của 5 clade (clade 1, clade 2.3.4, 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c), trong đó mức
tương đồng gene HA cao nhất là giữa vi rút A/MDk/VN/TB0410 và vi rút

-11-
A/Dk/VN/BN0612 (clade 2.3.2.1b và 2.3.2.1a: 99,06 %) và thấp nhất là cặp
A/Ck/VN/HN3303 x A/Dk/VN/QB7412: 92,9%.


Trái với kỳ vọng từ độ tương đồng nucl
eotide và amino acid thấp nhất (bảng
3.9) giữa vi rút A/Dk/VN/QB7412 với các vi rút khác, kháng huyết thanh vi rút
A/Dk/VN/QB7412 có khả năng nhận biết hầu hết các kháng nguyên nội clade (≥
6log
) và ngoại clade (ở mức ≥ 5log
2 2
). Kháng nguyên A/Dk/VN/QB7412 cũng
được nhận diện bằng các kháng thể kháng các đồng và dị clade (≥ 4log
2
), chứng tỏ
khả năng miễn dịch chéo của vi rút A/Dk/VN/QB7412 clade 2,3,2,1c cao hơn các

đại diện khác. Kết quả về khả năng nhận biết chéo cao này làm tăng ưu thế lựa
chọn A/Dk/VN/QB7412 làm chủng phát triển văc xin “đa giá trị’.
3.2. Kết quả thích nghi vi rút A/Dk/VN/QB7412 để làm giống gốc sản xuất văc
xin
3.2.1.

Nguồn gốc và đặc tính di truyền của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412
Nguồn gốc vi rút A/Dk/VN/QB7412
Xuất sứ và phân lập: Vi rút A/Dk/VN/QB7412 (tên thường gọi dễ nhận dạng)
được phân lập từ ổ dịch trên vịt vào tháng 7/
2012 tại tỉnh Quảng Bình. Tại
Genbank vi rút này có tên là A/Duck/Vietnam/QB1207/2012, isolate=”74-12”,
serotype H5N1, ký chủ: Duck, mã bệnh phẩm Nivr-AivDuck-12Dk-Qb74.

-12-

Hình 3.4. Phả hệ gene HA vi rút cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam
Quá trình xuất hiện: Phả hệ ở hình 3.4 cho biết:
- Vi rút clade 1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm
2003, tiếp tục lưu hành ở các tỉnh
phía Nam đến ít nhất thời điểm gần đây.
- Tương tự, năm 2007, vi rút clade 2.3.4 xuất hiện và lưu hành đến đầu năm
2010 thì dần dần bị thay thế bởi các vi rút clade 2.3.2.
- Từ tháng 2/2010, vi rút clade 2.3.2 (xuất hiện lần đầu tiên từ cuối năm
2006)
xuất hiện trở lại (clade 2.3.2.1a).
- Đến tháng 3/2012 vi rút clade 2.3.2.1 a bị thay thế bằng clade 2.3.2.1b.
- Vi rút clade 2.3.2.1c xuất hiện tại Hà Nội (5/2012); hai tháng sau (7/2012) ở
Quảng Bình. Dịch chủ yếu ở vịt, khác với hiện tượng thường thấy ở gà trước đây.
Đặc tính di truyền của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412

Chúng tôi đã giải trình tự toàn bộ genome của vi rút A/Dk/VN/QB7412, tổng
độ dài là 13.067 bp và 8 phân đoạn (bảng 3.11).
Bảng 3.11. Gene có mức tương đồng cao nhất với
A/Dk/VN/QB7412
TT Gene KH Mã số GB Số nu Giống* (%) Mã GB
1
Enzyme polymerase PB2
PB2 KF182738
2280 2278 99,91 CY146705
2
Enzyme polymerase PB1
PB1 KF182739
2274 2270 99,82 AB786690
3
Enzyme polymerase PA
PA KF182740
2151 2149 99,91 AB807879
4
Protein hemagglutinin
HA KF182741
1704 1703 99,94 KM821606
5
Nucleocapsid protein
NP KF182742
1497 1496 99,93 AB786685
6
Enzyme neuraminidase
NA KF182743
1350 1349 99,93 AB769254
7

Matrix protein
M KF182744
982 982 100 AB828363
8
Nonstructural protein
NS KF182745
829 829 100 AB786680

-13-
Chủng vi rút lựa chọn có cấu trúc gene bình thường, không chứa những đoạn
dư hoặc khuyết thiếu; có độ tương đồng cao nhất với các chủng có nguồn gốc ở
Việt Nam, ngoại trừ trường hợp PB2, tương đồng cao với rút A/duck/Hunan/
S4234/2011 (CY146705) ở mức 99,91% (chỉ sai khác 2 nucleotide trong số 2280
nucleotide. Thông tin phân tích khác đã đăng tải trên tạp chí Vi rút Gene và tạp chí
Nghiên cứu Vi rút năm 2014, không trình bày tại luận án này.
3.2.2.

Kết quả thích nghi vi rút A/Dk/VN/QB7412 trên phôi trứng gà
Chúng tôi đã nghiên cứu thích ứng chủng vi rút A/Dk/VN/QB7412 trên hai
loại ”môi trường” nuôi cấy vi rút với mục đích tạo được dòng thích nghi và nhân
lên cao nhưng đảm bảo ổn định cả về kháng nguyên tính đảm bảo đủ tiêu chuẩn
chủng gốc để làm văc xin.
Bảng 3.12. Chỉ số EID
50
của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412
TT Tiếp đời lần (Pass#)
[HA] EID
50
MDT Ghi chú
1 1

8 6,23 27,20 Seed 1
2 5
9 8,70 33,60

3 10
10 8,83 35,52 Master seed
4 15
10
8,83 35,95
5 20
10
8,90 36,78
Để tạo chủng sản xuất văc xin trên phôi trứng, bắt đầu từ tiếp đời 1 (Pas#1) vi
rút có EID
50
là 6,23log
10
/ml, 8log
2
HA chúng tôi đã tiếp đời liên tục vi rút trên phôi
trứng gà 10 ngày tuổi đến đời thứ 20. Kết quả đánh giá khả năng nhân lên qua các
đời (bảng 3.12) cho thấy: từ đời thứ 10, vi rút ổn định về khả năng gây nhiễm (8,83
log
10
EID
50
/ml) và lượng kháng nguyên (protein HA) là 10log
2
HA.
3.2.3.

Kết quả thích nghi vi rút A/Dk/VN/QB7412 trên tế bào dòng
Tương tự, kết quả tiếp đời trên tế bào dòng, đến đời thứ 10, vi rút có khả năng
gây nhiễm ở chỉ số 8,63log
TCID và lượng kháng nguyên đạt mức 10log
10 50 2
HA
(bảng 3.13).
của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412
Bảng 3.13. Chỉ số TCID
50
TT Tiếp đời lần (Pas#)
HA TCID
50
Ghi chú
1
Pas#1 7,50±0,55 3,23±0,12 Từ Pas#1 phôi g
à
2
Pas#4 7,67±0,52 3,43±0,12

3
Pas#5 7,83±0,41 5,43±0,12
4
Pas#7 8,33±0,52 5,43±0,12
5
Pas#8 8,83±0,41 8,10±0,20
6
Pas#10 10,17±0,41 8,63±0,12 Master seed
7

Pas#12 10,00±0,89 8,70±0,20

8
Pas#15 10,17±0,41 8,83±0,31

3.2.4.

Đặc tính độc lực của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412 sau tiếp đời
Độc lực của chủng vi rút cường độc dùng trong sản xuất văc xin vô hoạt theo
phương pháp truyền thống thường được sử dụng là một tiêu chí đánh giá chủng
giống gốc văc xin. Để đánh giá sự thay đổi độc lực của vi rút sau tiếp đời chúng tôi
so sánh đời 1 và đời 5 vi rút trên phôi gà. Kết quả bảng 3.14 cho thấy, vi rút tăng

-14-
khả năng gây nhiễm trên phôi 6,30 lên 8,70log EID
10 50
nhưng giảm độc lực (thời
gia gây chết kéo dài hơn). Đồng thời, vi rút cũng giảm độc lực trên gà, LD
50
giảm
(từ 4,77 xuống 4,97log
LD nghĩa là 1,6 lần)
10 50
Bảng 3.14. Chỉ số ELD
50
và LD50 của vi rút cúm A/Dk/VN/QB7412
Đối tượng Chỉ số gây chết trên phôi gà Độc lực trên gà
Tiêu chí ELD
50
(log) MDT (giờ) LD

50
(log) MDT (giờ)
Lần TN Pass# 1 Pass# 5 Pass# 1 Pass# 5 Pass# 1 Pass# 5 Pass# 1 Pass# 5
1
6,30 8,50 27,00 34,80 5,10 4,90 42,20 46,00
2
6,10 8,70 28,20 32,40 4,70 4,70 41,20 49,40
3
6,30 8,90 26,40 33,60 5,10 4,70 40,80 47,00
Trung bình
6,23
± 0,12
8,70
± 0,20
27,20
± 0,92
33,60
± 1,20
4,97
± 0,23
4,77
± 0,12
41,40
± 0,72
47,47
± 75
3.2.5.

Đặc tính di truyền của cúm A/Dk/VN/QB7412 qua tiếp đời và yếu tố
thích nghi “ký chủ mới”

Để theo dõi và đánh giá sự ổn định về di truyền của vi rút qua tiếp đời, chúng
tôi đã giải trình tự toàn bộ (1771 nucleotide) gene HA (mã hóa thành phần kháng
nguyên chủ yếu) của 24 tiếp đời vi rút khác nhau:
- Bệnh phẩm: Hoàn chỉnh toàn bộ trình tự làm đối chiếu gốc (1 trình tự)
- Gene HA của các tiếp đời 1,5, 10, 15 và 20 trên phôi gà (7 trình tự: riêng tiếp
đời 1 được giải trình tự ở 3 phòng thí nghiệm khác n
hau).

Hình 3.5. Cấu trúc gene HA chủng A/Dk/VN/QB7412
- Gene HA của các tiếp đời 1,5, 10, và 15 trên tế bào MDCK (4 trình tự),
- và trình tự của những vi rút nuôi cấy trở lại từ tế bào lên phôi trứng và gà.
Kết quả cho thấy cấu trúc của gene HA là ổn định về thành phần các phân

-15-
đoạn, độ dài; Không có đoạn thêm hay cắt bớt nucleotide (hình 3.5). Kết quả ở
bảng 3.15 cho biết trình tự gene HA qua các tiếp đời có độ tương đồng trên 99%,
sai khác so với chủng gốc chỉ từ 5-7 nucleotide (1-3 amino acid).
Bảng 3.15. Tương đồng (%) gene HA sau tiếp đời trên trứng và tế bào
TT Nguồn gốc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 Phôi gà-Pass#20 100
100
99,89
99,94
99,83
99,89
99,77 99,72 99,72 99,72
2 Phôi gà-Pass#15
100
100 99,89
99,94

99,83
99,89
99,77 99,72 99,72 99,72
3 Phôi gà-Pass#10 99,65 99,65 100 99,83 99,83 99,77 99,66 99,60 99,60 99,60
100 100
4 Phôi gà-Pass#5 99,65 100 99,89 99,83 99,72 99,66 99,66 99,66
99,
82 99,82 99,82 99,82
99,
72
99,
55 99,55
5 Phôi gà-Pass#1 100 99,60
99,55
99,
82 99,82
99,
82
6 QbDk3-HA 99,47 99,65 100 99,77
99,
72
99,
83 99,83
7 TbMDCK-Pass#1 99,47 99,47
99,12
99,47 99,29
99,65
100
99,94 99,94
99,83

8 TbMDCK-Pass#5 99,47 99,47
99,12
99,47 99,29
99,65 100
100 99,89 99,77
9 TbMDCK-Pass#10 99,47 99,47
99,12
99,47 99,29
99,65 100 100
100 99,89
10 TbMDCK-Pass#15 99,65 99,65 99,29 99,65 99,47
99,82 99,82 99,82 99,82
100
(567 amino acid, phía dưới và 1771 nucleotid, phía trên của bảng)
Yếu tố thích nghi “ký chủ mới” (môi trường nuôi cấy vi rút)
Bảng 3.16. Biến đổi nucleotide và amino acid ở các tiếp đời
Kiếu
1 1 1 1 2 2 3c 3c 3c 3e 3c
TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
TT-Nu 1330 1336 1407 1613 675 1515 1261 1586 1683 1557 1616
E20 C C A T G C A A A T G
E15 C C A T G C A A A T G
E10 C C A G G C A A A G G
E5 C C A T A C A A A G G
E1 T C A T A C A A A G G
QbDk3 C C A T G G A A A T C
C1 C C A T G C G C C T C
C5 C T A T G C G C C T C
C10 C C A T G G G C C T C
C15 C C C T G G G A C T C

TT-AA 444 446 469 538 225 505 421 529 561 519 539
E20 Leu Leu Leu Val Leu Pro Arg Tyr Ala Ser Gly
E15 Leu Leu Leu Val Leu Pro Arg Tyr Ala Ser Gly
E10 Leu Leu Leu Gly Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Gly
E5 Leu Leu Leu Val Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Gly
E1 Leu Leu Leu Val Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Gly
QbDk3 Leu Leu Leu Val Leu Pro Arg Tyr Ala Ser Ala
C1 Leu Leu Leu Val Leu Pro Gly Ser Phe Ser Ala
C5 Leu Phe Leu Val Leu Pro Gly Ser Phe Ser Ala
C10 Leu Leu Leu Val Leu Pro Gly Ser Phe Ser Ala
C15 Leu Leu Leu Val Leu Pro Gly Tyr Phe Ser Ala

-16-
Ghi chú: E: các tiếp đồi trên phôi gà, C: trên tế bào,
QbDk3: Trình tự gốc (bệnh
phẩm). TT-nu và TT-AA số thứ tự nu và amino acid trên coding region của trình tự gốc.
So sánh trình tự gene HA của các tiếp đời cho thấy: Không có đột biết ở vùng
5’ và 3’ gene. Vùng HA1: 1011 nucleotide hoàn toàn giống nhau ở 10 trình tự [1
bệnh phẩm, 5 tiếp đời trên phôi gà (Pas# 1, 5, 10, 15 và 20) và 4 tiếp đời trên tế
bào MDCK (Pas# 1, 5, 10 và 15), ngoại trừ có 2 thay đổi G675A ở mẫu phôi gà
Pas# 1 và 5, nhưng không làm thay đổi trình tự amino acid; nghĩa là cấu trúc bậc 1
(trình tự amino acid) của HA1 không thay đổi ở các tiếp đời.

Vùng HA2: Đột biến điểm xảy ra ở vùng HA2, tập trung ở 10 vị trí (bảng 3.16,
hàng thứ 3). Phân tích 11 vị trí đột biến (1 ở HA1 và 10 ở HA2), chúng tôi cũng đã
xác định có 3 kiểu (bảng 3.16, hàng 1): Kiểu 1, đột biến ngẫu nhiên không lập lại ở
các tiếp đời (không di truyền, 4 điểm ở gene HA2); Kiểu 2, đột biến mang tính đặc
thù cho tiếp đời trên phôi gà hoặc tế bào MDCK nhưng không dẫn đến thay đổi
amino acid (2 điểm); và kiểu 3, đột biến điểm dẫn đến thay đổi amino acid và

mang tính đặc hiệu theo “ký chủ” mới (3c: Tế bào, 3e: Trứng, bảng 3.16).

Hình 3.6. Vùng chỉ báo yếu tố thích nghi vật chủ của protein HA
Bảng 3.17. Biến đổi kiểu gene HA2 theo “k
ý chủ”
Kiểu gene
Kiểu gen
e trên TB. MDCK
Kiểu gene phôi gà
nu
G C C T C A A A G G
Thứ tự nu 1261 1586 1683 1557 1616 1261 1586 1683 1557 1616
Cell1 G C C T C
A A A T G
Cell5 G C C T C
A A C G G
Cell10 G C C T C
A A A T G
Cell15 G
A
C T C
A A A T G
Nguồn HA
Trên TB. MDCK
Sau cấy chuyển sang phôi gà
Kết quả tóm tắt ở hình 3.6 cho thấy sau khi vi rút được tiếp đời trên phôi trứng
và tế bào với kiểu gene xác định (tùy trình tự nucleotide tại 5 vị trí). Có thể gọi vi
rút phân lập lần đầu trên phôi gà (có trình tự nucleotide gần nhất với vi rút ở bệnh
phẩm) là chủng tiền thân (7412TT), chủng thích nghi trên phôi gà là 7412PG và
trên tế bào MDCK là 7412TB, kiểu gen các chủng thích nghi và 7412TT như sau:

7412TT: 1261A 1586A 1683A 1557T 1616C
7412PG: 1261A 1586A 1683A 1557G 1616G
7412TB: 1261G 1586C 1683C 1557T 1616C

-17-
Kiểm chứng giả thiết tính đặc hiệu của “ký chủ” mới, chúng tôi phân tích các
vị trí đột biến điểm trên đây ở trình tự gene HA của vi rút gây nhiễm trên gà từ các
tiếp đời Pas#1, 5, 10 và 15 trên tế bào. Tại các “điểm nóng” đột biến, thay đổi
thành phần nucleotide xảy ra như mong đợi, tuy nhiên chỉ xác định được 2 điểm
(vị trí 1261 và 1683) là những điểm đột biến luôn xảy ra ở “ký chủ” mới. Những vị
trí khác có
hiện tượng “lại tổ” (bảng 3.18).
Bảng 3.18. Biến đổi kiểu gene HA2 theo “thích ứng ký chủ”
Kiểu gene
Kiểu gen
e trên TB. MDCK
Kiểu gene trên bệnh phẩm vịt
nu
G C C
T C
A A A
T C
Thứ tự nu 1261 1586 1683 1557 1616 1261 1586 1683 1557 1616
Cell1 G C C
T C
A C A
T C
Cell5 G C C
T C
A A C

T
G
Cell10 G C C
T C
A A C
T
G
Cell15 G
A
C
T C
A A C
T
G
Nguồn HA
Trên TB. MDCK
Sau gây nhiễm cho gà


Hình 3.7. Phả hệ gene HA2 của các vi rút sau tiếp đời
Tiến hóa của quá trình thích nghi trên phôi gà và tế bào MDCK hiển thị rõ
ràng theo 2 hướng khác nhau tại các cây phả hệ hình 3.7. Tuy nhiên các biến đổi di
truyền do hiện tượng “lại tổ” đã làm ch
o cây phả hệ không có thứ tự từ đời thấp
đến đời cao mà ngược lại các đời 1 và 10 luôn xa vi rút gốc hơn những đời khác
(hình 3.7). Việc lựa chọn đời 10 để làm giống gốc là phù hợp với hiệu quả nhân vi
rút và đặc tính di truyền của gene HA không quá gần chủng gốc.
3.2.6.

Tính ổn định về kháng nguyên của A/Dk/VN/QB7412 qua tiếp đời

Để lựa chọn một tiếp đời tại đó vi rút có khả năng nhân lên rất tốt, điều quan
trọng là đặc tính kháng nguyên của vi rút được bảo tồn và tương đồng với chủng

-18-
nguyên gốc. Kết quả ở bảng 3.19 cho thấy tại các đời 2, 5, 10, 15 và 20 vi rút luôn
nhận biết kháng thể chuẩn tương đương với kháng nguyên chủng gốc. Tương tự,
khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên qua các tiếp đời cũng ổn định, đạt trên
6log
HI trong phản ứng HI sử dụng chủng gốc làm kháng nguyên.
2
Bảng 3.19. Hiệu giá HI (log2) của các kháng nguyên với kháng thể chuẩn
TT
Kháng nguyên Nước trứng TT Kháng nguyên Nuôi cấy tế bào
1
Nước trứng đời 2 8,00±0,63
1
Nước trứng đời 2 8,00±0,63
2
Nước trứng đời 5 8,00±0,89
2
Tế bào đời 1 8,00±0,00
3
Nước trứng đời 10 8,00±0,63
3
Tế bào đời 5 8,00±0,63
4
Nước trứng đời 15 7,83±0,41
4
Tế bào đời 10 8,17±0,75
5

Nước trứng đời 20 8,17±0,41
5
Tế bào đời 15 7,83±0,75

Trung bình 8,00±0,12 8,00±0,12

Bảng 3.20. Hiệu giá HI (log2) của gia cầm sau miễn dịch 14 ngày
TT Kháng
nguyên SốL HI D0 HI D14 ≥4log2 4 5 6 7 ≥ 8
Kháng nguyên tiếp đời trên phôi gà

1
Đối chứng 10 0,30±0,48 0,20±0,42 0
2
Nước trứng đời 2 30 0,30±0,47 6,10±1,09 30 3 4 13 7 3
3
Nước trứng đời 10 30 0,37±0,49 6,13±1,14 30 3 4 13 6 4
4
Nước trứng đời 20 30 0,43±0,57 6,07±1,14 30 4 3 13 7 3
Kháng nguyên tiếp đời trên tế bào MDCK

1
Đối chứng 10 0,50±0,53 0,30±0,48 0
2
Tế bào MDCK đời 5 30 0,27±0,45 6,33±0,76 30 0 3 16 9 2
3
Tế bào MDCK đời 10 30 0,33±0,48 6,60±0,86 30 0 3 10 13 4
4
Tế bào MDCK đời 15 30 0,30±0,47 6,57±0,86 30 0 2 14 9 5
Những kết quả này cho thấy chủng giống gốc được lựa chọn để sản xuất vắc

xin vô hoạt là ổn định cả về đặc tính di truyền và kháng nguyên, đảm bảo tiêu
chuẩn của giống gốc. Đồng thời cũng cho biết các dấu ấn di truyền để phân biệt
chủng sản xuất vắc xin với nhau so với chủng gốc.
3.3. Miễn dịch của văc xin vô hoạt chế từ chủng A/Dk/VN/QB7412
3.3.1.

Khả năng gây miễn dịch của văc xin A/Dk/VN/QB7412 vô hoạt trên vịt
Văc xin vô hoạt bổ trợ nhũ dầu (được chế tạo từ 2 nguồn vi rút: Nuôi cấy trên
phôi gà và trên tế bào MDCK) được thử nghiệm trên vịt (và gà) nuôi ở phòng thí
nghiệm và trên thực địa. Trong phòng thí nghiệm khả năng sinh miễn dịch của vắc
xin được đánh giá bằng 2 phương pháp: bảo hộ huyết thanh học và thử thách
cường độc.
Kết quả hiệu giá HI của gà và vịt được tiêm
vắc xin vô hoạt chế từ phôi trứng
(bảng 3.21) và chế trên tế bà
o MDCK (bảng 3.22) cho biết kháng nguyên vô hoạt
(vắc xin) chế từ phôi gà hoặc trên tế bào đều cho hiệu giá kháng thể đạt từ 6-7log
2

HI (thông thường, log
2
HI ≥4 được xem là đạt hiệu lực). Như vậy kết quả thử đáp
ứng miễn dịch trong điều kiện phòng thí nghiệm chứng tỏ vắc xin vô hoạt chế từ
chủng gốc A/Dk/VN/QB7412 (7412PG và 7412TB) đạt các yêu cầu về kháng

-19-
nguyên và khả năng gây miễn dịch.
Bảng 3.21. Hiệu giá HI của gia cầm tiêm văc xin vô hoạt (nước trứng)
TT Đối tượng Nhóm
SốL HI ≥4log2 4 5 6 7 8 9 10

Ngày gây miễn dịch (D0)

1
Đối chứng 20 0,35±0,49 0
2
Gà 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 0,28±0,45 0
3
Đối chứng 20 0,25±0,44 0
4
Vịt 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 0,23±0,42 0
Sau gây miễn dịch 21 ngày (D21)

1
Đối chứng 20 0,15±0,37 0
2
Gà 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 7,43±0,78 40 3 21 12 4
3
Đối chứng 20 0,10±0,31 0
4
Vịt 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 7,13±1,22 40 1 3 5 18 8 4 1

Bảng 3.22. Hiệu giá HI của gia cầm tiêm văc xin vô hoạt (tế bào MDCK)
TT Đối tượng Nhóm
SốL HI ≥4log2 4 5 6 7 8 9 10

Ngày gây miễn dịch (D0)

1
Đối chứng 20 0,21±0,42 0
2
Gà 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 0,28±0,45 0
3
Đối chứng 20 0,45±0,60 0
4
Vịt 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 0,20±0,41 0

Sau gây miễn dịch 21 ngày (D21)
1
Đối chứng 20 0,15±0,37 0
2
Gà 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 7,63±0,81 40 3 14 18 5
3
Đối chứng 20 0,38±0,54 0
4
Vịt 3 tuần tuổi
Tiêm văc xin 40 7,05±1,01 40 4 4 21 8 3

3.3.2.

Kết quả xác định liều công cường độc của chủng A/Dk/VN/QB7412
Để đánh giá hiệu lực vắc xin bằng thử thách cường độc, chúng tôi đã xác định
liều gây chết 50% gà (bảng 3.23): LD
đối với gà là 4.97log và MDT là 41,4
50 10

giờ.

LD50 của chủn k/VN/QB741
Lần thí nghiệm LD g) M )
Bảng 3.23. g vi rút A/D 2 trên gà
50
(lo DT (giờ
1
5,10 42,20
2
4,70 41,20
3
5,10 40,80
Trung bình
4,97± 0,23 41,40 ± 0,72
Trên cơ sở đó chúng tôi đã áp dụng một 10 lần và 100 lần LD
50
để gây nhiễm

-20-
cho gà. Sau 3 lần lập lại tại liều 10 x LD
50
có 29/30 gà bị chết, tại liều 100 x LD
50

có 100% gà chết với các triệu trứng điển hình. Liều này được sử dụng trong thử
thác
iệu lực vắc xin theo TCVN2014, tại đó lô đối chứng
phải có ít nhấ
B củ rút /Q vịt

TT Độ pha loãng Số l ng số chết T )
h cường độc.
Áp dụng quy trì
nh xác định liều đối với vịt gặp rất nhiều khó khăn do không
thể đạt được tỷ lệ chết 100%. Đây là một vấn đề khó khăn trong thực hiện thư
thách cường độc và đánh giá h
t 80% vịt chết.
ảng 3.24. MLD a chủng vi A/Dk/VN B7412 trên
ượ ỷ lệ (% MDT
1 [1/1]
6 5 83,33 105±30
2 [1/2]
6 5 8 3,33 129±40
3 [1/4]
6 6 100 118±26
4 [1/8]
6 6 100 104±42
5 [1/16]
6 3 50,00 154±30
6 [1/32]
6 2 33,33 120±34
Cộng [lô 1-6] 27 122±35 36 75,00
7 [1/64]
6 1 16,67 181
8 [1/128]
6 1 16,67 172
Cộng [lô 1-8] 48 29 60,42 134±37
Chúng tôi đã áp dụng phương pháp xác định liều gây chết tối thiểu (MLD)
(bảng 3.24), liều gây chết tối thiểu được xác định là tiếp đời 2 virus trên phôi gà,
hiệu giá 8log

2
HA, độ pha loãng 1/32, nhỏ mũi 200µl. Thử nhiều lần lặp lại, chúng
tôi cũng đã xác định được liều gây chết 83,3% vịt thí nghiệm là tiếp đời 2 virus
trên phô
3.25.
T h cường ịt bằng k/VN/Q
Lần TN Số Số ết T )
i gà, hiệu giá 8log
2
HA, độ pha loãng 1/8 (bảng 3.25).
Bảng
hử thác độc cho v vi rút A/D B7412
TN ch ỷ lệ (% MDT
1
10 8 80,00 111±29
2
10 8 80,00 101±27
3
10 9 90,00 109±31

30 25 83,33 107±28

3.3.3.

Đặc tính bảo hộ nguyên chủng và bảo hộ chéo của văc xin cúm vô hoạt
chế
.3.2.1a, 2.3.2.1b, clade1 theo liều hướng dẫn của phòng thí

ngh
ới dị clade vắc xin có khả năng

bảo hộ ít nhất là 87,18% với gà và 82,05% với vịt.

từ chủng A/Dk/VN/QB7412
Căn cứ vào liều thử thách cường độc đã xác định. Chúng tôi tiến hành công
cường độc cho gà và vịt được gây miễn dịch (một liều duy nhất, 3 lô lập lại). Để
thử đáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo chúng tôi cũng đã thử thách cường độc với các
chủng thuộc clade 2
iệm Viện Thú y.
Kết quả ở bảng 3.26 cho thấy: Đối với đồng clade 2.3.2.1c vắc xin có khả năng
bảo hộ 97,44% gà và 92,31% vịt thí nghiệm.
Đối v


-21-
Bảng 3.26. Kết quả thử thách cường độc gia cầm được tiêm văc xin cúm
vô hoạt chế từ chủng A/Dk/VN/QB7412
KN Lô1 KN Lô2 KN Lô3* KN Lô3** Tổng
TT
Các Clade
dùng thử thách
Đối
Tượng
Số
TN
Số
sống
Số
TN
Số
sống

Số
TN
Số
sống
Số
TN
Số
sống
Số
TN
Số
sống
Tỷ lệ
bảo hộ
(%)
Vịt
1 Clade 1
ĐC 3 1 5 1 5 0 10 1 23 3 13,04

MD 9 8 10 7 10 8 10 9 39 32
82,05
2 Clade 2.3.2.1a
ĐC 3 1 5 1 5 1 10 1 23 4 17,39

MD 9 8 10 9 10 8 10 9 39 34 87,18
3 Clade 2.3.2.1b
ĐC 3 1 5 1 5 1 10 1 23 4 17,39

MD 9 9 10 8 10 9 10 9 39 35 89,74
4 Clade 2.3.2.1c

ĐC 3 0 5 1 5 0 10 0 23 1 4,35

MD 9 9 10 8 10 9 10 10 39 36
92,31
Gà
1 Clade 1
ĐC 3 0 5 0 5 0 10 1 23 1 4,35

MD 9 8 10 8 10 9 10 9 39 34
87,18
2 Clade 2.3.2.1a
ĐC 3 0 5 0 5 0 10 1 23 1 4,35

MD 9 8 10 8 10 9 10 9 39 34 87,18
3 Clade 2.3.2.1b
ĐC 3 0 5 1 5 0 10 1 23 2 8,70

MD 9 9 10 9 10 9 10 9 39 36 92,31
4 Clade 2.3.2.1c
ĐC 3 0 5 1 5 0 10 0 23 1 4,35

MD 9 9 10 9 10 10 10 10 39 38
97,44
Tổng

A 4 clade
Gà 36 34 40 34 40 37 40 37 156 142 91,03
B 4 clade
Vịt 36 34 40 32 40 34 40 37 156 137 87,82

3.3.4.
Miễn dịch bảo hộ và thải trùng của văc xin cúm vô hoạt chế từ chủng
A/Dk/VN/QB7412

Để đánh giá m
iễn dịch bảo hộ thải trùng và không thải trùng chúng tôi đã sử
dụng 7 lô thí nghiệm có hiệu giá HI trong huyết thanh trước khi thử thách cường
độc từ 2-7log
.
2
Bảng 3.27. Thải vi rút ở gia cầm sau thử thách cường độc
Dịch mắt Dịch ổ nhớp
Lô
HI
D21
Số
lượng
Ph
ân lập*
rRT-PCR
Đến**
PI-D
Phân lập*
rRT-PCR
Đến**
PI-D
Ghi chú
Gà
1 7 5 1
R

1 0 [Dịch mắt
+RTPCR
]
2 6 5 0 0
3 5 5 1 0
4 4 5 1 3 1 3
5 3 5 5 5*** 5 6*** 4/5 gà chết PI-D3-5
6 2 4 4 4 4 4 Có 4 gà: Chết PI-D3-4
7 0 5 5 3 5 3 Gà chết tại PI-D3

-22-
[HI]
Vịt


1 7 5 0
2 6 5 0
3 5 5 1 2 1 1
4 4 5 2 3 1 4
5 3 5 5 6*** 5 6*** 3/5 vịt chết PI-D3-5
6 2 3 3 5 3 5 Có 3 vịt: Chết PI-D3-5
7 0 5 5 3 3 3 Vịt chết 3 ngày

Kết quả bảng 3.27 cho biết gia cầm thí nghiệm có hiệu giá HI ≥4-5log2 được
bảo hộ nhưng vẫn thải trùng. Gia cầm thí nghiệm có hiệu giá HI từ 6log2 trở lên
không thải vi rút sau khi công cường độc.
3.3.5.

Kết quả thử nghiệm bảo hộ của văc xin cúm A/H5N1 vô hoạt chế từ
chủng A/Dk/VN/QB7412 trên gia cầm nuôi tại thực địa

Để kiểm tra khả năng bảo hộ của vắc xin đối với gia cầm nuôi tại thực địa,
chúng tôi đã áp dụng thử hiệu lực trên 500 gà và 250 vịt.
Bảng 3.28. Hiệu giá kháng thể (HI) của gia cầm tiêm văc xi
n
Hiệu giá kháng thể HI (log
2
)
Gà Vịt
Ngày sau
miễn dịch
Số mẫu
Kiểm tra
≤3
4 5 6 7 8
TB
≤3
4 5 6 7 8 TB
14 50

0 2 6 8 21 13 6,85
21 50 0 0 0 17 18 15 6,96 0 0 1 4 9 36 7,60
28 50 0 0 0 21 15 14 6,86 0 0 5 1 4 40 7,58
60 50 0 0 8 22 13 7 6,38 0 0 0 12 11 27 7,30
Bảng 3.29. Kết quả thử thách cường độc gia cầm miễn dịch ở thực địa
Vịt
Gà
Chủng vi rút
Lô miễn
dịch
Đối

Chứng
Lô miễn
dịch
Đối
Chứng
Clade 2.3.2.1a
A/Ck/VN/HT0310
9/10
(90%)
4/5
(80%)
10/
10
(100%)
4/5
(80%)
Clade 2.3.2.1b
A/MDk/VN/BN0612
9/10
(90%)
4/5
(80%)
10/
10
(100%)
4/5
(80%)
Clade 2.3.2.1c
A/Dk/VN/QB7412
10/10

(100%)
5/5
(100%)
10/
10
(100%)
5/5
(100%)
Clade 1
A/Ck/VN/HN3303
8/10 4/5
(80%)
9/10
(90%)
4/5
(80%)
(80%)
Kết quả ở bảng 3.28 về hiệu giá kháng thể và kết quả thử thách cường độc với
những đối tượng gia cầm này (bảng 3.29) cho thấy các kết quả trong phòng thí
nghiệm được lập lại tại điều kiện thực địa, trong đó hiệu giá miễn dịch bảo hộ đạt
trên 6log
2
HI và có ít nhất trên 80% gia cầm được bảo hộ khi thử thách cường độc
bằng 4 chủng vi rút cường độc các clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c và clade 1.