Toàn văn khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai loài drosera

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
oOo



QCH NGƠ DIỄM PHƯƠNG



KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC
HP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI
DROSERA




Chuyên ngành: Sinh hóa
Mã số: 62 42 30 15



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2011

LỜI CAM ĐOAN

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang i






LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những kết quả trong
nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác.


NCS. Quách Ngô Diễm Phương

LỜI CẢM ƠN

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ii

Lời cảm ơn
Công trình này là kết quả hơn 3 năm học tập và nghiên cứu của tôi tại Bộ môn
Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hoá Sinh học thuộc Khoa Sinh, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên với rất nhiều sự dạy bảo, quan tâm và giúp đỡ.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến

PGS. TS. Bùi Văn Lệ, người đã đề ra hướng nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp
trên đối tượng cây bắt ruồi ở Việt Nam bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật và
tận tình chỉ dạy cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được thực hiện, hoàn
thành luận án này.
Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS. TS. Nguyễn
Kim Phi Phụng
– Khoa Hóa, trường ĐH Khoa học Tự nhiên. Cô là người đã
đặt nền móng đầu tiên cho khối kiến thức Hóa học mà tôi có được để ứng dụng trong
luận án này. Mặc dù không là người hướng dẫn, nhưng Cô luôn ở bên cạnh, đốc thúc,
hỗ trợ tinh thần cho tôi trong lúc thực hiện luận án.
Thời gian làm thực tập sinh ở nước ngoài đã giúp tôi trưởng thành hơn trong
chuyên môn, trong tác phong học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn
Bộ Giáo
dục Đào tạo và Chương trình trao đổi hợp tác Danida (ENREKA).
Bên cạnh
đó, cho phép tôi được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến
PGS. TS. Ole
LỜI CẢM ƠN

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iii

Vang
, người đã hướng dẫn, dạy bảo tôi, luôn tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên
cứu trong suốt quãng thời gian tôi ở Đan Mạch. Cho tôi được nói lời cám ơn đến tất
cả Thầy Cô, bạn bè ở Lab Molecular Mechanisms of Dietary Components; Khoa
Science, Systems and Models; Trường ĐH Roskilde, Đan Mạch đã hướng dẫn
những thao tác đầu tiên khi tôi vàoLab cũng như đã tạo nên những tình cảm ấm áp,
thân thiện. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến các bạn du học sinh Việt Nam ở
Roskilde; đặc biệt là chị Thảo Trân, Tuyết Phương, Thu An, Như Ngọc, Thành
Tâm

đã chia sẽ cuộc sống và giúp đỡ tôi như gia đình ở nơi xa xứ.
Cho tôi được gửi lời cám ơn đến Thầy Cơ GS. Trần Thanh Vân và học bổng
Odon Vallet.
Cám ơn các Thầy Cơ Bộ mơn Sinh hóa đã quan tâm tìm hiểu và xét duyệt ngay
khi ý tưởng của luận án được hình thành.
Trân trọng cám ơn các
Thầy Cơ tham gia Hội đồng, Thầy Cơ tham gia phản
biện kín
đã dành thời gian xem xét, đánh giá cũng như góp ý để luận án được chỉnh
chu, hoàn thiện hơn.
Cám ơn toàn thể
Thầy Cơ đồng nghiệp của tôi tại Khoa Sinh, Trường ĐH
Khoa học Tự nhiên, TP. HCM đã dạy dỗ từ những ngày tôi mới chập chững bước
vào giảng đường đại học cho đến ngày hôm nay cũng như đã cổ vũ tinh thần và hỗ trợ
khi cần thiết để tôi hoàn thành luận án. Đặc biệt xin được cám ơn Cơ Phượng, anh
Huy, KPNam
đã góp ý và sữa chữa bài vở giúp tôi.
LỜI CẢM ƠN

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iv

Cám ơn toàn thể các em đang học tập và làm việc tại phòng Công nghệ Sinh học
Thực vật B23. Cho tôi được đặc biệt cám ơn: Lan Anh, Cẩm Tú, Vòng
BínhLong, Lưu Ly, Xuân Sơn, Hữu Hoàng, Minh Tuấn, Thanh Minh,
Hiền đã hỗ trợ bất cứ lúc nào tôi cần.
Gửi lời cám ơn đến: Bích Chiêu, Bích Tuyền, Hoàng Thò Thu, Phương Thy,
Thanh Minh, Bích Thùy, Phi Yến, những “người bạn học trò” của Cô đã dốc hết
tâm huyết để cùng Cô nghiên cứu luận án này.
Gửi lời cám ơn đến các bạn cùng khóa Cao học Sinh hóa K13 đã thường xuyên
quan tâm và động viên tôi cho đến giờ phút này. Đặc biệt, cho tôi nói lời cám ơn đến

Thiên Hoàng, chò Như, anh Nhứt.
Cuối cùng, tôi xin phép được dâng tặng thành quả của công trình này cho gia đình
tôi, chỗ dựa vững chắc nhất của tôi trong những năm qua. Cám ơn Ba Mẹ đã tạo mọi
điều kiện tốt nhất về vật chất và tinh thần để tôi có thể học tập, nghiên cứu khoa học
và đạt được kết quả này. Cám ơn anh chò hai và vợ chồng út đã luôn ở bên cạnh, giúp
đỡ, cổ vũ. Gia đình thực sự đã giúp tôi có thể toàn tâm toàn ý với luận án này.
Chân thành cám ơn.

Quách Ngô Diễm Phương.
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
Lôøi caûm ôn ii
MỤC LỤC v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU x
DANH MỤC BẢNG xiii
DANH MỤC HÌNH xvi
MỞ ĐẦU 1
1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera 3
1.1.1 Đặc điểm phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm phân bố 5
1.1.3 Đặc điểm hình thái 6
1.1.4 Đặc tính sinh học 11
1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] 13
1.1.6 Thành phần hóa học 14

1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng 17
1.1.8 Tình hình nghiên cứu 20
1.2 Tăng năng suất thu nhận hợp chất trong nuôi cấy tế bào thực vật 22
1.2.1 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 22
1.2.2 Tối ưu khả năng tích lũy hợp chất của tế bào thực vật 24
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vi

1.2.3
Can thiệp vào con đường sinh tổng hợp hoạt chất 29
2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35
2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 35
2.1.1 Vật liệu 35
2.1.2 Phương pháp 35
2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
nguyên liệu in vitro của Drosera 38

2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học được sử dụng để sàng lọc phân
đoạn cao chứa hoạt chất 38

2.2.2 Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro
của hai loài Drosera 41

2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập được 42
2.2.4 Xác định cấu trúc và hàm lượng hợp chất 49
2.2.5 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu
tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này 51

2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt

chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh 51

Vật liệu 51
Phương pháp 52
2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera
52

2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt
chất của cây con 52

2.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây
con 53

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vii

2.3.4
Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy
hoạt chất của cây con 54

2.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng
trưởng và sự tích lũy hoạt chất 54

2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và
tích lũy hoạt chất 55

2.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát 55

2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất
lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 56

Vật liệu 56
Phương pháp 56
2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 56
2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 59

2.5 Xử lý thống kê 62
3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 63
3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 63
3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 63
3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên 63
3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 66
3.1.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture
System) trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con
hoàn chỉnh [24] 69

3.1.5 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh 72
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang viii

3.2
Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
nguyên liệu in vitro của Drosera 72

3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết 72
3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa 74

3.2.3 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào in vitro 84
3.2.4 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu
tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này 100

3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh 101

3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng của D.
burmanii 102

3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin trong cây con tái sinh 104

3.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 109
3.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất (phenylalanine và tyrosine) lên
sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin 111

3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng
trưởng và tích lũy hoạt chất 113

3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và
tích lũy hoạt chất 120

3.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát 122

3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt
chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 123

3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 123

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ix

3.4.2
Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống
nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 134

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 14
4.1 Kết luận 14
4.2 Đề nghị 1
DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN 15
TÀI LIỆU THAM KHẢO 15
PHỤ LỤC a

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
4E-BP1 : the Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) Binding Protein 1
ABS : Absorbent
AFM : Atomic Force Microscopy
AI : hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất (%)
AOS : Active oxide species
BA : 6-benzylaminopurine
BHA : butylate hydroxy aldehyde
BSA : Bovine Serum Albumine
COSY : COrelation SpectroscopY
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DLD-1 : dòng tế bào ung thư ruột kết ở người
DMSO : Dimethyl sulphoxide
DTT : 1, 4-DiThioTreitol
DW : Dry weight (trọng lượng khô)
FBS : Fetal Bovine Serum
FTC : Ferric thyociante
FW : Fresh weight (trọng lượng tươi)
GB5 : Gamborg B5
HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation.
HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation.
HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

I : tỷ lệ ức chế sự tăng sinh tế bào (%)
IAA : indoleacetic acid
IBA : 3-indolebutyric acid
IC50 : Inhibitory Concentration of 50% growth
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xi

IR : Infrared
KN : Kinetine
LB : Luria – Bertani
MS : Murashige & Skoog, 1962
mTOR : mammalian Target Of rapamycin
mTORC1/2 : mammalian TOR Complex 1/ 2
NAA : Naphthalene Acetic Acid
NMR : Nuclear Magnetic Resonance
OD : Optical Density
PAL : Phenylamine ammonia lysase
PBS : Phosphate Buffer Saline
PDK : Protein Dependent Kinase
PDK1/ 2 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 1/ 2
PI : Protease Inhibitor
PI3K : PhosphoInositide 3-Kinase
PIP
2 : PhosphatidylInositol (4,5)-BiPhosphate
PIP
3 : PhosphatidylInositol (3,4,5)- TriPhosphate
PKB : Protein Kinase B
PKC : Protein Kinase C
pmTOR : phosphor mTOR

PTEN : Phosphatase and TENsin homolog
PVDF : PolyVinylidene DiFluoride
PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone
Raptor : Regulatory Associated Protein of mTOR
Rheb : Ras Homolog Enriched in Brain
Rictor : rapamycin-Insensitive Companion of mTOR
ROS : Reactive Oxygen Spices
S6K1 : p70-S6 Kinase 1
SAR : Systemic Acquired Resistance
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xii

SRB : SulfoRhodamine B
TAL : Tyrosine ammonia lyase
TBA : ThioBarbituric Acid
TBS : Tris Buffered Saline
TCA : Trichloroacetic acid
TMS : TetraMethylSilane
TSC1/ 2 : Tuberous Sclerosis Complex1/ 2
TTC : TriphenylTetrazolium Chloride
UV : Ultra Violet
vitE : Vitamin E
KÍ HIỆU
J : Hằng số ghép cặp
MHz : Megahertz
s, d, t : Singlet (mũi đơn), Doublet (mũi đôi), Triplet (mũi ba)
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xiii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone 15
Bảng 1.2. Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone 15
Bảng 1.3. Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera 15
Bảng 1.4. Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera 18
Bảng 1.5. Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D. burmanii 19
Bảng 1.6. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera 20
Bảng 1.7. Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong
thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera 21

Bảng 2.1. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng 37
Bảng 2.2. Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D 61
Bảng 3.1 . Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự nhân chồi bên 64
Bảng 3.2 . Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa 67
Bảng 3.3. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn, lỏng 70
Bảng 3.4. Phần trăm nước của hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro 72
Bảng 3.5. Thu suất các loại cao từ bột cây Drosera 73
Bảng 3.6. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các loại
cao theo phương pháp Yen và Duh (1993) 74

Bảng 3.7 . Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. indica 76
Bảng 3.8. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các phân
đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993) 77

Bảng 3.9. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC 80
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA 81
Bảng 3.11. Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát 82
Bảng 3.12. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau
khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết (100µg/ml) 84

Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. burmanii 86
Bảng 3.14. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau
khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn (100µg/ml) 86

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xiv

Bảng 3.15. Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14 87

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh của
tế bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng 89

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên kích thước của tế
bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng 91

Bảng 3.18. Nồng độ protein tổng của sinh khối tế bào khi bị cảm ứng bởi hợp chất
B và rapamycin theo thời gian 94

Bảng 3.19. Ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein
mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian 96

Bảng 3.20. Phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR và HMBC của hợp chất B 99
Bảng 3.21. Kết quả định lượng quercetin và plumbagin trong Drosera bằng HPLC
101

Bảng 3.22. Các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii 102
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây 104

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin
trong cây con 105

Bảng 3.25. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây 107

Bảng 3.26. Ảnh hưởng mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây con 108

Bảng 3.27. Ảnh hưởng NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây
con 109

Bảng 3.28. Ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con 111

Bảng 3.29. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con 113

Bảng 3.30. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tích lũy plumbagin ở hai bộ phận rễ
và lá D. burmanii 116

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xv

Bảng 3.31. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con 117

Bảng 3.32. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin ở lá và rễ của
D. burmanii 119

Bảng 3.33. Ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy
plumbagin của D. burmanii 120

Bảng 3.34. Kết quả định lượng plumbagin trong cây con D. burmanii in vitro đã
được ứng dụng các kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng
HPLC 123

Bảng 3.35. Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của
lớp mỏng tế bào 123

Bảng 3.36 . Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D. burmanii 125
Bảng 3.37. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 127
Bảng 3.38. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 128
Bảng 3.39. Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau 134
Bảng 3.40. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng
trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera 135

Bảng 3.41. Ảnh hưởng ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và tích lũy
plumbagin 137

Bảng 3.42. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của
dịch huyền phù tế bào 139

Bảng 3.43. Ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích

lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmanii 142

Bảng 3.44.Ảnh hưởng của acid salicylic lên lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của dịch huyền phù tế bào 145

Bảng 3.45. Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D. burmanii
đã được ứng dụng kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng
HPLC 146


DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên
trình tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome 4

Hình 1.2. Sự phân bố Drosera trên thế giới (vùng có màu xanh lá) 5
Hình 1.3. Các dạng cấu trúc thân của Drosera 6
Hình 1.4. Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera 7
Hình 1.5. Màu sắc đa dạng của hoa Drosera 9
Hình 1.6. Mặt cắt ngang của hoa Drosera 9
Hình 1.7. Các dạng nang chứa hạt của Drosera 10
Hình 1.8. Hình thái hạt Drosera 10
Hình 1.9. Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D. indica L. 12
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-
glucoside tách chiết từ các loài Drosera . 16

Hình 1.11. Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera 16

Hình 1.12. Một số hình thái lạ mắt của Drosera 19
Hình 2.1 . Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên 36
Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định 37
Hình 2.3. Con đường truyền tín hiệu mTOR và những cơ chất có liên quan 46
Hình 2.4. Phương pháp Western Blot 46
Hình 2.5. Buồng đếm tế bào và quy tắc đếm trong 1 ô lớn có thể tích 0,1mm
3
59
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera 64
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. indica L. sau 5
tuần 65

Hình 3.3. Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. burmanii sau 5
tuần 65

Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera 67
Hình 3.5 . Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. indica sau 5 ngày 68
Hình 3.6. Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. burmanii 68
DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvii

Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của việc ứng dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2
bước lên khả năng tạo chồi của Drosera (trái: D. indica, phải: D. burmanii)
70

Hình 3.8. Cây con Drosera hoàn chỉnh với đầy đủ các bộ phận, kể cả rễ trên môi
trường MS lỏng (trái: D. indica, phải: D. burmanii) 72

Hình 3.9. Biểu đồ biễu diễn năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp

của Den và Duh (1993) 74

Hình 3.10. Năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp của Den và Duh
74

Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm
Yen & Duh 77

Hình 3.12 Năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh 77
Hình 3.13 .Tinh thể hình kim của hợp chất A 78
Hình 3.14. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 500nm để theo dõi động
học của phản ứng 80

Hình 3.15. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 532nm để theo dõi động
học của phản ứng 81

Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập so
với vitE và BHA ở cả hai phương pháp FTC và TBA 82

Hình 3.17. Biều đồ thể hiện tỷ lệ % ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 của các loại cao
chiết 85

Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi
cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn 86

Hình 3.19. Cô lập và thu nhận hoạt chất B 88
Hình 3.20. Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của
hợp chất B ở các nồng độ khác nhau 89

Hình 3.21. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng

độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng) 89

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xviii

Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào
DLD-1 92

Hình 3.23. Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48 giờ cảm ứng
được quan sát dưới kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10x 93

Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hợp chất B (4µM) và rapamycin
(0,5µM) lên hàm lượng protein tổng của lysate tế bào DLD-1 95

Hình 3.25. Biều đồ thể hiện ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu
hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian 97

Hình 3.26. Tín hiệu phát quang của kháng thể bắt cặp với các protein mTOR,
pmTOR, và S6K 98

Hình 3.27. Biểu đồ thể hiện các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii 102
Hình 3.28. Các giai đoạn tăng trưởng của D. burmanii nuôi cấy in vitro 102
Hình 3.29. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây 104

Hình 3.30. Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích
lũy plumbagin của cây. Trong đó, ở MS1/8 và MS0 các chồi con không có
dấu hiệu tăng sinh và chết 104

Hình 3.31. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích
lũy plumbagin của cây 105

Hình 3.32. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự tăng trưởng của D. buramnii in vitro
106

Hình 3.33. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây 107

Hình 3.34. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tăng trưởng của D. buramnii in
vitro. Từ trái sang phải: pH5,2; pH5,8; pH6,4 107

Hình 3.35. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự
tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con 108

Hình 3.36. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây con 109

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xix

Hình 3.37. Ảnh hưởng của NAA lên sự phát triển của rễ và sự tăng trưởng của cây
in vitro 110

Hình 3.38. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tích lũy
plumbagin của cây con 112

Hình 3.39. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng tăng trưởng
và sự tich lũy plumbagin 114

Hình 3.40. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng
của salicylic acid đến sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii 114

Hình 3.41. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của D.burmanii 117

Hình 3.42. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng
của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii 118

Hình 3.43. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên khối lượng
cây tươi 120

Hình 3.44. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên hàm lượng
plumbagin 120

Hình 3.45. Biều đồ thể hiện ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả
năng sống của lớp mỏng tế bào 124

Hình 3.46. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ lá D.burmanii 126
Hình 3.47. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ rễ D.burmanii 126
Hình 3.48. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo dưới ảnh hưởng của 2,4-D, NAA,
KN 128

Hình 3.49. Hình thái mô sẹo dưới tác động kết hợp của 3 loại hormone 129
Hình 3.50. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo 131
Hình 3.51. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào 132
Hình 3.52. Tế bào D. burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC. 133
Hình 3.53. Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D. burmanii có
mật độ tế bào ban đầu khác nhau 135

DANH MỤC

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xx

Hình 3.54. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng
trưởng và sự tích lũy plumbagin 137

Hình 3.55. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và tích lũy
plumbagin 140

Hình 3.56. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng
trưởng và tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmanii 143

Hình 3.57. Con đường tổng hợp plumbagin từ tiền chất tyrosine thông qua các đơn
vị acetate 144

Hình 3.58. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 145

Hình 3.59. Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác động lên quá
trình sinh tổng hợp
14
7


LỜI MỞ ĐẦU

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 1

MỞ ĐẦU
Từ ngàn xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ thiên nhiên để chữa bệnh, tuy nhiên,
nguồn dược liệu khai thác từ thiên nhiên cho đến nay vẫn không đủ để đáp ứng nhu
cầu sử dụng. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các nhà
khoa học đã phải tìm nhiều biện pháp để tổng hợp các dược phẩm có cơ cấu tương
tự các hợp chất mà người xưa đã khai thác từ thiên nhiên. S
ong, các dược phẩm
tổng hợp thường gây ra không ít những tác dụng phụ như giảm khả năng trị liệu,
gây độc tố…Do đó, việc nghiên cứu cây cỏ thiên nhiên nhằm tìm ra các hợp chất có
giá trị trị liệu để cung cấp thêm nguồn khai thác dược liệu là việc làm hết sức cần
thiết. Hơn nữa, nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học dựa trên các
phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro nhằm đảm bảo được một cách chủ động số
lượng cần t
hiết các hợp chất có giá trị trị liệu là điều mà các nhà khoa học luôn đề
cao hàng đầu và đang tích cực hướng đến.
Drosera, một loài thực vật bắt mồi mang nhiều đặc điểm khác lạ so với các loài
thực vật khác: có khả năng cảm ứng; có khả năng tiết ra nhiều loại hợp chất thơm,
ngọt ngào để thu hút côn trùng; có nhiều loại enzyme thủy phâ
n để tiêu hóa côn
trùng làm nguồn dinh dưỡng…Đặc biệt, chúng có một giá trị dược tính rất to lớn
trong điều trị các căn bệnh hiểm nghèo như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà,
hen suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến. Thế nhưng, theo kết quả từ bộ sưu
tập thực vật của Juniper và cộng sự [58], Drosera trong thiên nhiên hiện nay tương
đối hiếm. Loài cây này đang được đánh giá là loài có nguy cơ tuyệt chủng cao trên
thế giới, nhiều quốc gia đã phải ban hà
nh luật để bảo vệ chúng [20], [21]
Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ [5], có tất cả 3 loài Drosera. Tuy nhiên, cho đến
nay, người dân chỉ thường thấy 2 loài trong số đó là: D. indica L. và D. burmanni
Vahl. Theo Đỗ Tất Lợi [6], chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học,
dược tính, song dâ

n gian không ít người sử dụng chúng để chữa bệnh: ho gà, kiết lị,
lao hạch, cam tích, viêm loét, chai chân, nám…
LỜI MỞ ĐẦU

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 2

Trước những ghi nhận đó, nhằm hướng đến mục tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu
chủ động cung cấp hoạt chất có giá trị trị liệu cho ngành dược, luận án:
KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN
CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI DROSERA

Đã được hình thành với 3 nội dung chính:
¾ Thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera thu hái ở Việt Nam
¾ Sàng lọc, thu nhận và xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
nguyên liệu nuôi cấy in vitro của hai loài Drosera.
¾ Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất
có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro Drosera:
Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp
Bổ sung tiền chất
Sử dụng những nhân tố cảm ứng con đư
ờng sinh tổng hợp (elicitor, stress)
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 3

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera
1.1.1 Đặc điểm phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, Drosera thuộc: [9]

Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan)
Lớp: Magnoliopsida (Ngọc Lan)
Phân lớp: Rosidae (Hoa Hồng)
Bộ: Caryophyllales
Họ: Droseraceae
Giống: Drosera
Tên tiếng Anh: Sundew, Sondou, Doublom
Drosera là giống thực vật chiếm số lượng loài nhiều nhất trong nhóm thực vật ăn
thịt, với hơn 188 loài [77]
. Năm 1994, Seine và Barthlott đã chia các loài thuộc
giống Drosera vào 11 nhóm (section) thuộc 3 phân giống (subgenus) (hình 1.1)
− Phân giống Drosera: là phân giống lớn nhất, các loài thuộc phân giống này
được chia thành 7 section gồm Drosera, Ptycnostigma, Thelocalyx,
Phycopsis, Bryastrum, Lasiocephala, Coelophylla
− Phân giống Ergaleium: các loài thuộc phân giống này được chia thành 3
section gồm Stoloniferae, Erythrorhizae, Ergaleium
− Phân giống Regiae: chỉ gồm 1 loài duy nhất là D. regiae thuộc section
Regiae

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 4



Hình 1.1. Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình
tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome [122]