Khảo sát hàm lượng vitamin b12 trong một số chế phẩm vitamin sản xuất trong nước đang lưu hành trên thị trường hà nội

p
m
BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
* * * * * *
NGUYỄN ĐỨC HOÀNG LONG
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG VITAMIN Bj2 TRONG MỘT
SỐ CHẾ PHẨM VITAMIN SẢN x u ẤT TRONG Nước
ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THI TRƯỜNG HÀ NÔI
ỈÊ
( KHOÁ LUẬN TÓT N G p i^ Đ ^ C sĩ KHÓA 2000-2005 )
m m m
Người hướng dẫn : TÍCH
TH.S. NGUYỄN LÂM HỔNG
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH - ĐỘC CHẤT
ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Thời gian thực hiện : 2/2005 ĐẾN 5/2005
Hà Nội 5-2005
m
LỜI eĂm 0H
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến thầy TRẦN tích
TH.S NGUYỄN THỊ KlỀU ANH - TH.S NGUYỄN lầm HỒNG - những thầy
cô đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo bộ môn Hoá Phân
Tích - Độc Chất cùng toàn thể các bộ môn, Ban Giám Hiệu trường ĐH Dược
Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện để tôi hoàn thành khoá luận.
Do thời gian hạn chế nên khoá luận không thể tránh khỏi những thiếu
sót, rất mong sự đóng góp ý kiến của thầy cô, bạn bè để khoá luận của tôi
được hoàn thiện hơn.
Tôi xỉn chán thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2005
Sinh viên
NGUYỄN ĐỨC HOÀNG LONG
MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Đặt vấn đề

1
Phần 1: Tổng quan

3
1.1 Tmh hình chất lượng một số viên chứa 3 Vitamin B|, Bg, Bị2 đang lưu
hành trên thị trường Việt Nam


3
1.1.1 Tinh hình chất lượng một số thuốc chứa 3 Vitamin B|, Bj2 của các
công ty nước ngoài

3
1.1.2. Tinh hình chất lượng của một số thuốc chứa 3 Vitaminh B|, Bg, B|2
được sản xuất trong nước
-
3
1.2 Tổng quan về Cyanocobalamin (Vitamin B12)

5
1.2.1 Công thức phân tử - cấu tạo 5
1.2.2 Tính chất hóa lý 6
1.2.3 Tác dụng dược lý 6

1.3 Các chỉ tiêu đánh giá hàm lượng của vitamin 3 B


- 6
1.4 Các phương pháp đã tiến hành để định lượng Vitamin B|2 7
1.4.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
7
1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

8
Phần 2: Đối tượng, phương tiện, nội dung, phương pháp
nghiên cứu

16
2.1 Đối tượng nghiên cứu -

16
2.2 Phương tiện nghiên cứu



16
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu


—17
2.3.1 Cách lấy mẫu


17

2.3.2 Lựa chọn các điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao

17
2.3.3 Áp dụng các điều kiện đã chọn để định lượng Vitamin Bị2 trong một số
chế phẩm Vitamin



17
2.4 Phương pháp xử lý số liệu




-— 18
Phần 3: Kết quả nghiên cứu 20
3.1 Mẫu dùng để định lượng


20
3.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký 20
3.2.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký 20
3.2.2. Khảo sát độ phù hợp của hệ thống sắc ký



22
3.2.3. Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ

22

3.2.4. Khảo sát độ chính xác của phưcmg pháp 23
3.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp sắc ký

24
3.3 Kết quả định lượng


—




25
3.3.1. Độ đồng đều hàm lượng B|2 trong các chế phẩm thuốc viên 25
3.3.2. Định lượng Bị2 trong các chế phẩm thuốc viên

27
3.3.3. Định lượng B|2 trong chế phẩm thuốc tiêm 33
Bàn luận 34
Phần 4: Kết luận và đề xuất

35
4.1 Kết luận
35
4.2 Đề xuất
36
Tài liệu tham khảo
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CtyCP : Công Ty CỔ Phần
Cty : Công ty

HPLC : High-Performance Liquid Chromatography - HPLC
p : page
PA : Tinh khiết phân tích
SDK : SỐ Đăng Ký
TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng
TNHH : Trách nhiệm hữu hạn
TP : Thành phố
TW : Trung ương
VKN : Viện Kiểm Nghiệm
ĐẶT VẤN ĐỂ
Trong thời gian gần đây, tình hình chất lưcmg thuốc đang được coi là
vấn đề bức xúc không chỉ của riêng ngành Dược mà còn là của nhiều ban
ngành, tổ chức và của toàn dân. Thuốc kém chất lượng sẽ gây hậu quả rất lớn
đến sức khoẻ của bệnh nhân, ảnh hưởng xấu đến kết quả điều trị, gây thiệt hại
về kinh tế, làm giảm uy tín của các nhà sản xuất
Theo thống kê của Viện kiểm nghiệm, Bộ y tế, từ năm 2001 đến năm
2004 thuốc không đạt tiêu chuẩn chất lượng chiếm một tỷ lệ khá cao, khoảng
3%-10% tổng số mẫu kiểm nghiệm. Trong tổng số các chế phẩm thuốc bị rút
giấy phép đăng ký có hơn 30% thuốc là do không đạt tiêu chuẩn chất
lượng [6 , 25].
Trong các mặt hàng thuốc thì chế phẩm viên có chứa 3 loại Vitamin B|,
Bộ, B|2 là loại thuốc có nhiều vi phạm về tiêu chuẩn chất lượng của thuốc.
Điều này không chỉ xảy ra đối với những thuốc sản xuất trong nước mà còn
xảy ra cả đối với những thuốc ngoại nhập của các hãng nổi tiếng trên thế giới.
Hàng năm, vẫn có tới hàng trăm lô thuốc Viamin không đạt tiêu chuẩn chất
lượng bị đình chỉ lưu hành trên thị trường Việt Nam [6 ].
Trong khi đó, việc tiến hành kiểm tra một cách có hệ thống, toàn diện
về chất lượng thuốc trên thị trường vẫn chưa đựợc tiến hành. Viện kiểm
nghiệm, Bộ y tế, cũng như các trung tâm kiểm nghiệm chỉ kiểm tra chất lượng
thuốc đối với những mẫu do cơ sở sản xuất tự mang đến hoặc các mẫu do

đoàn thanh tra gửi về. Số lượng mẫu thuốc kiểm tra hằng năm chiếm khoảng
50% tổng số các mặt hàng thuốc đang được lưu hành trên thị trường [6].
Xuất phát từ thực tế đó, với mong muốn có một đánh giá toàn diện về
vấn đề chất lượng một số sản phẩm thuốc Vitamin 3B lưu hành tại Việt Nam
để từ đó có những đề xuất cho công tác quản lý, sản xuất tại các Doanh nghiệp
trong nước chúng tôi tiến hành thực hiện khoá luận:
"Khảo sát hàm lượng Vitamin Bị2 trong một số chề phấm Vỉtamiĩi
sản xuất trong nước đang lưu hành trên thị trường Hà Nội "
Khóa luận được thực hiện với các mục tiêu sau:
1, Lựa chọn phương pháp lấy mẫu, khảo sát các điều kiện định lượng Vitamin
Bj
2
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2 . Áp dụng các điều kiện khảo sát trên để xác định hàm lượng Vitamin B|2
trong một số chế phẩm vitamin 3B của các công ty trong nước đang lưu hành
trên thị trường Hà Nội.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 TÌNH HÌNH CHẤT LƯỢNG MỘT số THUỐC VIÊN CHỨA 3
VITAMIN Bi, Bé, Bi2 đ ang LUU hành tại v iệ t n am
1.1.1 Tình hình chất lượng một số thuốc chứa 3 Vitamin B5, B12 của
các công ty nước ngoài:
Hiện nay, trên thị trưòỉng thuốc Việt Nam, các sản phẩm vitamin 3B
nhập khẩu của các công ty nước ngoài chiếm tỷ lệ khá lớn, chủ yếu của các
hãng Dược phẩm có tên tuổi trên thế giới.
Phần lớn, trong các chế phẩm vitamin 3B của các công ty nước ngoài
đều chứa hàm lượng hoạt chất B|2 khá cao, [7, 14] , với công thức bào chế
thưòỉng là:
Thiamin hydroclorid 250mg
Pyridoxin hydroclorid 250mg
Cyanocobalamin lOOOmcg

Trong vài năm gần đây, tình hình chất lượng thuốc nhập khẩu đã được
tăng lên đáng kể.Theo báo cáo tổng kết công tác kiểm nghiệm năm 2004 của
VKN, trong tổng số 5.865 mẫu thuốc nhập khẩu được lấy để kiểm tra chất
lượng chỉ có 78 số mẫu không đạt TCCL, chiếm 1,33% (so với năm 1999 là
7,8%). Tuy nhiên, trong số các chế phẩm không đạt TCCL, chế phẩm vitamin
3B vãn chiếm một tỷ lệ khá cao (khoảng 10% so với tổng số mẫu 3B được lấy
để kiểm nghiệm), và tất cả đều do hàm lượng vitamin Bị2 thấp so với tiêu
chuẩn [6 , 25].
1.1.2 Tình hình chất lượng một sô thuốc chứa 3 Vitamin Bi, Bg, B12
sản xuất trong nước.
Hiện nay, các chế phẩm vitamin 3B sản xuất trong nước đang ngày
càng chiếm một tỷ lệ lớn trên thị trường. Từ năm 2001 đến năm 2005, đã có
khoảng hơn 27 chế phẩm vitamin 3B của các công ty, xí nghiệp đã được cấp
số đăng ký lưu hành. Tuy nhiên, chất lượng thuốc của các công ty trong nước
so với thuốc nhập khẩu vẫn có sự chênh lệch lớn. Tỷ lệ thuốc trong nước
không đạt TCCL cao hơn gấp 2,5 so với thuốc nhập khẩu. Chất lượng thuốc
giữa các công ty trong nước vẫn có sự khác nhau giữa thuốc của các xí nghiệp
trung ương với các công ty cổ phần, công ty TNHH hoặc giữa các cơ sỏ đạt
GMP với các cơ sở chưa đạt GMP. Vài năm gần đây nhiều văn bản hoặc thông
báo thu hồi thuốc của Bộ y tế đối với những lô thuốc của các xí nghiệp trong
nước đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành như :
- Văn bản số 4478/QLD ngày 5-9-2000 về việc thu hồi lô thuốc bao
phim Vitamin B„ Bộ, B,2 có SKS: 24070500-05.02, SDK: QY-K7-47-97 của xí
nghiệp 30-Cty đầu tư Miền Đông-Bộ Quốc Phòng (SAP) do thuốc không đạt
chất lượng về hàm lượng B|2 [9].
- Thông báo số 7086/QLD ngày 18/12/00 về việc thu hồi thuốc Vitamin
Bị, Bg, Bj2 lô số 030400, của Xí nghiệp Dược phẩm TW 25 vì không đạt TCCL
về hàm lượng B|2 [2 0].
- Thông báo thu hồi thuốc số 4477/QLD 5/9/2000 đối với sản phẩm
Edphavit có SKS 160600-1201 của Cty Dược phẩm Quận 8 TP Hồ Chí Minh

[21].
- Thông báo số 7111/QLD-CL ngày 5/11/03 về việc thu hồi thuốc Tribf
(viên bao phim Vitamin Bị, Bg, B12) lô số 010203 của CTCP Hoá Dược Phẩm
Mekophar [22].
Điều đó chứng tỏ chất lượng thuốc sản xuất trong nước còn có nhiều
vấn đề cần quan tâm.
Hầu hết, các chế phẩm vitamin 3B sản xuất trong nước thường có hàm
lượng dược chất như sau [14]:
Thiamin mononitrat 125 mg
( hoặc thiamin hydroclorid )
Pyridoxin hydroclorid 125 mg
Cyanocobalamin 125mcg
Một số chế phẩm của các cơ sở, xí nghiệp khác lại chứa hàm lượng
Cyanocobalamin thấp hơn, như:
CTCP Dược phẩm Hà Tây viên nén Vitamin B|, B|2, Bg bao phim chỉ chứa 50
mcg B,2, hoặc Cty Dược vật tư y tế Phú Thọ viên nén Vitamin chỉ có hàm
lượng Cyanocobalamin là 10 mcg [7, 14].
Một số chế phẩm 3B thường gặp khác: Medtri - B của Qy Dược phẩm
TW Huế; TRIBF của Xí nghiệp Dược phẩm TW - 24; Triovit B của xí nghiệp
Dược phẩm TW 25; TrivitaBF của Qy CPDP - Dược liệu (Pharmedic); Vitamin
B1-B6-B12 của QyCP Dược phẩm Dược Liệu Mekong (Mekopharma);
Newcobex của Qy dược vật tư y tế Phú Thọ [7, 8,14].
1.2 TỔNG QUAN VỀ CYANOCOBALAMIN (VITAMIN B12) [1,8, 14, 28, 29,
30,31],
1.2.1 Công thức phân tử - cấu tạo
Công thức vitamin B|2 rất phức tạp, chủ yếu gồm hai thành phần chính là
nucleotit và phần cobamin, được nối với nhau qua mạch isopropanol.
MH,COC*rUCrl C'rU
MHjCOQI
-CHjCHjCOMHj

1 bl^CHjCOM H^
i ' ì
OIjCHjCO M H CHj— ộ 0 —
‘— o ~
1
CH,
H
•'CrljOH
‘3 o
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Vitamin Bị
2
Công thức phân tử: Cộ2H88CoNị3 0 ị4P; p.t.l: 1329,36+x.
Tên khoa học: a-(5,6-dimethylbenzimidazol-l-yl) cobamid
(cyanid;hydroxyd )
Tỷ lệ các nguyên tố trong phân tử: c 55.83%, H 6.54%, Co 4.35%,
N 14.47%, o 16.53%, p 2.29%.
1.2.2 Tính chất lý hoá:
Vitamin B|2 là những tinh thể màu đỏ tối hay bột kết tinh màu đỏ, rất dễ
hút ẩm (khoảng 12 % nước khi để ra ngoài không khí), tan được trong nước,
ethanol, không tan trong ether và cloroform.
Dung dịch trong nước có pH từ 3,5 đến 7.
Cyanocobalamin hấp thu mạnh bức xạ tử ngoại và cả bức xạ vùng khả
kiến. Vì thế người ta dựa vào tính chất này để định tính và định lượng nó.
Dung dịch Cyanocobalamin trong nước có 3 cực đại hấp thụ ở các bước
sóng 278nm, 361nm và 550nm. Tỷ số hấp thụ ở 361nm so với độ hấp thụ ở
278nm là 1,7 đến 1,9 và 361 so với 550nm là 2,9 đến 3,4. Vì thế nên vitamin
B|2 thường được định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 361nm,
lấy 207 là hệ số hấp phụ riêng (l%,lcm) hoặc ở bước sóng 550nm, với hệ số
hấp phụ riêng là 64 (l%,lcm).
1.2.3 Tác dụng dược lý:

Vitamin Bị2 tham gia cấu tạo nucleprotein, DNA thymin và làm trucfng
thành hồng cầu. Ngoài ra, nó cũng giúp cho quá trình phân chia, tái tạo tế bào;
giúp cho sự trưởng thành của tế bào và bảo vệ các mô khi có nhiễm trùng,
nhiễm độc, đặc biệt đối với tế bào thần kinh.
Vitamin B|2 có tác dụng điều chỉnh một số rối loạn thần kinh
1.3 CÁC CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CỦA VITAMIN Bi2 TRONG
CHẾ PHẨM.
Trong các Dược điển, viên nén bao phim 3B không có chuyên luận
riêng, các chỉ tiêu chất lượng của viên 3B hầu hết do các nhà sản xuất tự xây
dựng nên. Dựa vào các tài liệu tham khảo và các TCCL cơ sở, chúng tôi đánh
giá hàm lượng của Vitamin B|2 trong viên 3B gồm các chỉ tiêu sau:
+ Độ đồng đều về khối lượng viên: Độ đồng đều về khối lượng viên
được qui định theo tiêu chuẩn của các Dược điển. Thường thì viên 3B có khối
lượng lớn hcfn 250 mg. Trong tổng số 20 viên đem cân, không được quá 2 viên
có khối lượng chênh lệch quá khoảng giới hạn của khối lượng trung bình và
không được có viên nào có chênh lệch gấp 2 lần độ lệch tính theo tỷ lệ. Khối
lượng viên > 250 mg thì độ lệch tính theo tỷ lệ phẩn trăm là 5% [8].
+ Độ đồng đều hàm lượng: viên nén chứa nhiều hoạt chất, trong tổng số
10 viên bất kỳ đem thử không có quá 1 viên có giá trị hàm lưcmg nằm ngoài
khoảng giới hạn 85% - 115% của hàm lượng trung bình và không có một viên
nào nằm ngoài giới hạn 75% - 125% của hàm lượng trung bình [8].
+ Địnhlượng: Tiến hành định lượng bằng phưcmg pháp HPLC với những
điều kiện đã khảo sát thì hàm lượng Vitamin Bj2 so với hàm lượng ghi trên
nhãn nằm trong khoảng giới hạn từ 90% đến 120% [23, 24].
1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÃ TIÊN HÀNH ĐỂ định LƯỢNG B,2 trong viên 3B
1.4.1 Phưong pháp quang phổ tử ngoại khả kiến [2, 4, 8]
* Nguyên tắc định lượng:
Sử dụng đặc tính hấp thụ tử ngoại của các chất để từ đó xác định chúng.
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại dựa trên định luật Lambert-Beer :
Mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng xác định tỷ lệ thuận

với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem đo.
D = k.l.c
Trong đó k : là hệ số hấp thụ
c : nồng độ dung dịch
1 : bề dày lớp dung dịch đem đo
Khi c = 1% (kl/tt), 1 = Icm, thì D = k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu
là E (1%, Icm). Như vậy, khi c tính theo nồng độ phần trăm (kl/tt), 1 tính
bằng cm thì :
D = E(l% ,lcm ).c
1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2, 3, 4, 8,15,17,18,
26,31,32].
* Khái niệm:
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chia tách trong đó
pha động là chất lỏng, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân
chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay
một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.
Quá trình sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân
loại theo kích cỡ.
* Nguyên tắc định lượng:
Dung dịch hỗn hợp vitamin được đưa qua van bơm mẫu và được pha
động kéo qua cột phân tách nhờ một bơm cao áp. Tại cột, xảy ra quá trình tách
các vitamin trong hỗn hợp dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng
giữa hai pha không hoà tan đựơc vào nhau, luôn tiếp xúc nhau. Một pha tĩnh
luôn lưu giữ các Vitamin trên cột theo những lực tương tá khác nhau, và một
pha động chảy qua cột luôn rửa giải các Vitamin ra khỏi cột với các mức độ
mạnh yếu khác nhau. Kết quả là các Vitamin được rửa giải ra khỏi cột với thời
gian khác nhau tạo ra sự phân tách. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký đó
là tổng của các tưcfng tác. Có thể minh hoạ bằng hình dưới đây:
Hình 12 Sơ đồ biểu thị mối liên quan của các tương tác trong sắc ký
Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi

cột trước tiên nếu lực lưu giữ nó là nhỏ nhất, và ngược lại. Đối với mỗi chất,
sự lưu giữ được qui định bởi ba lực thành phần: Fj, F2, F3 . Trong đó, lực F|, F2
là quyết định nhất, còn lực F 3 ảnh hưởng không lớn. Lực F| là lực lưu giữ chất
phân tích trên cột, F2 là lực kéo nó ra khỏi cột. Nên với các chất khác nhau thì
các lực F|, F2 sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong
cột với tốc độ khác nhau và sẽ tách hẳn nhau khi đi ra khỏi cột. Sau khi đi ra
khỏi cột, các chất sẽ được phát hiện bằng các detector và được chuyển qua bộ
phận xử lý. Kết quả sau khi được xử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị
trên màn hình. Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là
thời gian lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc đồ, và
tín hiệu phân tích định lượng là diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được.
* Các đại lượng đặc trưng:
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại
và ghi thành sắc ký đồ:
Hình 13 Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2
> ÍỊị (Thời gian lưu): Thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm
vào cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, các chất khác nhau thì thời
gian lưu khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký HPLC đã chọn. Thời gian
lưu là đại lượng đặc trưng để phát hiện định tính các chất.
Trong một số phép phân tích, nếu tp, qua nhỏ thì sự tách kém, còn Ir quá
lớn (tR>20 phút) thì píc bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài. Để
thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một số yếu tố trong các yếu tố phụ
thuộc trên.
> to(Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký
> t¡ị. (Thời gian lưu thực) = t^-tQ
> Wqị(Độ rộng pic ở nửa chiều cao)
> wỊ, (Độ rộng đáy pỉc)
> Độ chọn lọc a (Selectivity)
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất

A và B có K'a và K'b khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị
ở độ chọn lọc a a = ^ = iK\ # K'b)
^ B ^RA~^ữ
a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2.
> Hệ số phân bố (K):
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đăc trưng bởi hệ số phân
bố K, nó được tính theo công thức;
K =
Trong đó: Cs, Cm
lần lU0 là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động.

Khi nồng độ chất tan không quá cao thì K là một hằng số, chỉ phụ thuộc
vào bản chất các pha và chất tan, nhiệt độ.
> Hệ số dung lượng (K')
Là đại lượng đặc trưng cho một chất, phụ thuộc vào bản chất của chất
phân tích và đặc tính của pha tĩnh và pha động, không phụ thuộc vào tốc độ
dòng cũng như chiều dài của cột.
c,
Q: lượng chất trong pha tĩnh
lượng chất trong pha động
K' thấp thì sự tách sẽ kém, trên thực tế K' nằm trong khoảng từ 2-5 là
tốt nhất.
> Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao của đĩa (H):
Để đặc trưng cho hiệu lực của cột, người ta sử dụng số đĩa lý thuyết (N)
và chiều cao của đĩa (H). Ta có thể tính số đĩa lý thuyết N theo công thức:
N =16
hoặc N =5,54
w,
1/2

Trong đó ; + Wg là chiều rộng pic ở đáy pic
+ w ị/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết
được tính bằng công thức:
N
> Độ phân giải (Rs):
Độ phân giải là đại lượng đặc trưng mức độ tách khác nhau của hai chất
trên một cột sắc ký.
Công thức tính:
hoặcR
w,-nv.
w +w
Trong thực tế, nếu các pic cân đối (Gauss) thì độ phân giải tối thiểu để
2 pic tách khỏi nhau là R =1.5.
> Hệ số bất đối xứng T (Tailing factor)
Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc
đồ thu được, T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nữa pic tại điểm — hoặc
Ậ- chiều cao pic.
20
T= —
~ 2a
Với : ^ là độ rộng pỉc đo ở — chiều cao pic
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí — chiều cao pic.
Khi T < 2,5 thì phép định lượng có thể chấp nhận được, nếu T > 2,5 thì
điểm cuối của pic rất khó xác định, cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để
làm cho pic cân xứng hơn.
* Pha tĩnh trong HPLC:
Pha tĩnh là các chất nhồi cột sắc ký, có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có
nhiều thành phần. Đó là một yếu tố quyết định hiệu quả phân tích. Nó là chất

rắn, xốp và có kích thước hạt rất nhỏ, đường kính hạt khoảng từ 3-10 Ịxm, diện
tích bề mặt riêng thường từ 50-500mVg.
Tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà chọn pha tĩnh có thể là loại sắc
ký phân bố pha thuận, sắc ký phân bố pha đảo, sắc ký hấp phụ trao đổi ion
hoặc sắc ký rây phân tử
Nhưng căn cứ theo trạng thái thì pha tĩnh chỉ có hai loại là rắn hoặc
lỏng, nếu pha tĩnh là chất rắn thì ta có sắc ký lỏng rắn LSC (Liquid Soli
Chromatography), nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký lỏng lỏng LLC
(Liquid Liquid Chromatography).
• Điều kiện một pha tĩnh:
+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong
điều kiện sắc ký nhất định
+ Tính chất bề mặt phải ổn định
+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
+ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
• Chế tạo pha tĩnh: Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền
sau: nền Silicagel, nền oxyd nhôm, nền cao phân tử hữu cơ, trên nền mạch
carbon.
Trong đó, pha tĩnh trên nền Silicagel ưu việt hơn và được sử dụng cho cả
2 loại: sắc ký hấp phụ và sắc ký phân bố. Với những đặc tính nổi trội nên sắc
ký phân bố đã được ứng dụng rộng cho cả sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
Ví dụ:
+ Silicagel trung tính: dùng cho sắc ký phân bố pha thuận,bề mặt
chứa các nhóm -OH phân cực. Pha động của loại này là các chất không phân
cực hoặc ít phân cực.
+ Silicagel đã alkyl hóa: sử dụng cho sắc ký phân bố pha đảo.
Nhóm -OH của Silicagel trung tính được alkyl hóa bằng các gốc alkyl của
mạch carbon thẳng C8C|8 hoặc vòng như phenyl. Pha động thường là các
chất phân cực.

* Pha động trong HPLC:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột sắc ký. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ, hỗn hợp dung môi.
Dựa vào đặc điểm chất cần phân tích mà ta chọn hệ dung môi sao cho khả
năng tách chiết là tốt nhất. Pha động quyết định thời gian lưu của chất tan và
hiệu quả tách sắc ký.
Trong sắc ký phân bố pha thuận: Pha động phải là các dung môi hữu cơ
không phân cực hoặc ít phân cực như: n-hexan, n- heptan, cloroform
Trong sắc ký phân bố pha đảo: Pha động là hệ dung môi của những
dung môi đồng tan với nước, cũng có khi nước lại là thành phần chính của pha
động như methanol, acetonitril Trong nhiều trường hợp, thành phần pha
động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất
tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để dùng trong sắc ký
tạo cặp ion.
• Pha động thoả mãn các điều kiện sau:
+ Trơ với pha tĩnh
+ Hoà tan được chất mẫu
+ Bền vững theo thời gian
+ Có độ tinh khiết cao
+ Nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phù hợp với loại detector đã chọn
• Các yếu quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của
một hỗn hợp mẫu:
+ Bản chất của dung môi để pha pha động
+ Thành phần của các chất tạo nên pha động
+ Tốc độ của pha động
+ pH của pha động
* Phương pháp định lượng, cách đánh giá pic và cách tính kết quả trong
HPLC:
p Cách đánh giá diện tích pic

Đánh giá diện tích pic; Tính diện tích pic, thường dùng tích phân kế
hoặc dùng máy đã cài sẵn chương trình tính toán.
> Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Nguyên tắc định lượng: Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện
tích pic của nó. Các phương pháp định lượng trong sắc ký.
• Phươm pháp nsoai chuẩn: Dựa trên việc so sánh mẫu thử và mẫu
chuẩn được phân tích trong cùng một điều kiện. Kết quả của chất chưa biết
được tính toán dựa trên chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn.
• Phươne pháp nôi chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn
và mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký có thời
gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
• Phươns vháv thêm: Phương pháp này được sử dụng khi có ảnh
hưcmg của chất phụ. Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất
chuẩn. Các píc thu được của dung dịch chuẩn và của dụng dịch thử đựơc đo
trong cùng một điều kiện sắc ký. Phưoỉng pháp này có thể được thực hịên
nhiều lần. Với phương pháp thêm nhiều lần với các nồng độ khác nhau ta có
phương pháp thêm đường chuẩn.
• Phươns pháp phần trăm diên tích vic (hoãc phần trăm chiều cao DÌc)
Là phương pháp tính nồng độ mẫu thử dựa trên diện tích pic (hoặc chiều
cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng toàn bộ pic có trong sắc ký đồ.
Trong phương pháp HPLC, công thức này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của
Detector trên các chất là như nhau, nếu không thì mỗi chất phải cần có hệ số
điều chỉnh.
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG,
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CÚU:
- Trong 27 số đăng ký được Cục Quản Lý Dược Việt Nam cấp từ
năm 2 0 00 đến năm 2005, do hạn chế về thời gian và kinh phí nên chúng
tôi mới chỉ chọn được 6 công ty, xí nghiệp Dược trong nước có sản phẩm
viên nén bao phim Vitamin 3B đang được lưu hành nhiều trên thị trường

Hà Nội. Các công ty đó là: Xí nghiệp Dược phẩm TW 25, Cty Dược phẩm
TW Huế, CtyCP Dược phẩm Hà Tây, CtyCP Dược phẩm Bến Tre, Cty
Dược-vật tư y tế cửu Long, Cty Dược vật tư y tế Phú Thọ.
- Ngoài ra đối với thuốc tiêm Bj2 chúng tôi cũng mới chỉ chọn được 3
công ty có sản phẩm thuốc tiêm đang được lưu hành nhiều ở Hà Nội gồm: Xí
nghiệp Dược phẩm TW I, Xí nghiệp Dược phẩm TW 2, Cty Dược- vật tư y tế
Vĩnh Phúc.
2.2 PHƯƠNG TIỆN:
* Máy mốc - Duns cu :
- Hệ thống HPLC Merck- Hitachi
+ Bơm cao áp "Merck- Hitachi L- 6000 Pump
+ Detector u v " Merck - Hitachi L - 4000 u v detector
+ Máy tích phân " Merck - Hitachi D -2500 Chromato Intergration
+ Van tiêm mẫu Rheodyne 7125 - USA.
- Máy quang phổ Shimadzu - u v mini 1240 (USA).
- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45 |am.
- Máy lắc Latineo - Hà Lan.
- Máy đo pH Jen way - Anh.
- Máy ly tâm điện Jaucin - Pháp.
- Máy siêu âm Bransonic - USA.
- Máy khuấy từ Ikamag.
- Máy lọc nước siêu sạch Elga - Anh.
- Cân phân tích Satoriuos chính xác 0,1 mg.
- Dụng cụ thuỷ tinh: pipet,ống nghịêm,cốc có mỏ,bình định mức các loại,
* Hoá chất:
- Chất đối chiếu B12: chúng tôi sử dụng chất đối chiếu là bột vitamin Bj2
nguyên chất lấy của Viện Kiểm Nghiệm.
- Methanol (HPLC).
- Na2 HPƠ4 , H3 PO4 (PA).
- Nước cất.

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cú u
Đánh giá hàm lượng vitamin Bị2 trong một số chế phẩm thuốc Vitamin
đang lưu hành trên thị trường Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao, chúng tôi đã tiến hành khảo sát lựa chọn:
2.3.1 Cách lấy mẫu:
- Mẫu Vitamin dùng để khảo sát được chúng tôi thu thập bằng phương
pháp lấy mẫu ngẫu nhiên, mua mẫu tại một số cửa hàng thuốc trên thị trường
Hà Nội. Chọn mua ngẫu nhiên 4 lô thuốc Vitamin chứa B12 của 6 công ty trên
đang được hành trên thị trường Hà Nội.
2.3.2 Lựa chọn các điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao:
+ Kiểu sắc ký áp dụng.
+ Cột tách.
+ Pha động (thành phần, pH, tốc độ dòng) để cho được kết quả tốt nhất.
+ Bước sóng thích hợp.
2.3.3 Áp dụng các điều kiện đã chọn để định lượng Vitamin B12 trong một
sô chê phẩm Vitamin
Trên cơ sở các điều kiện đã chon đó, chúng tôi tiến hành định lượng
bằng phưcỉng pháp so sánh diện tích pic của mẫiHhồs^ mẫu chuẩn đu
/ b p ^ ỉ s > \ / k y
hiện trên cùng một điều kiện sắc ký, tính ra hàm lượng Bi2 trong chế phẩm 3B
theo công thức:
S^xm,xhxn^
Trong đó, p : Hàm lượng vitamin Bị
2
trong viên (%)
S^., s ,: diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử
c : Hàm lượng mẫu chuẩn
ĩn : khối lượng trung bình viên ịmg)
n,: độ pha hãng của dung dịch thử
n^: độ pha loãng của dung dịch chuẩn

m^: lượng cân chất chuẩn ịmg)
m ,: lượng cân chất thử (mg)
h : hàm lượng vitamin ghi trên nhãn (mcg)
• Tiến hành định lượng vitamin Bj2 theo phương pháp của Dược điển Anh với
điều kiện sắc ký:
+ Cột Apolo C8 (150 X 4,6 mm ), 5|im
+ Dung môi động : Na2HP04 (10 %): Methanol = 63,5:36,5
+TỐC độ dòng : 1 .Oml/phút
+ Thể tích tiêm : 50|^1
+ Dung môi pha mẫu : nước cất
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến với bước sóng 361 nm
Chúng tôi định lượng lại vitamin B|2 chuẩn bằng phương pháp quang phổ tử
ngoại khả kiến trước khi tiêm dung dịch này vào hệ sắc ký, thông qua việc xử
lý thống kê các kết quả khảo sát để đánh giá chương trình sắc ký đã tiến hành.
2.4 Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê nhờ phần
mềm Exel thông qua các thông số đặc trưng sau:
1 ”
Giá trị trung bình : X = —Yxị
n /=1
Độ lệch chuẩn: s =
Ì2Ì
_________
n-\
V«
Khoảng tin cậy s =
Độ lệch chuẩn tương đối RSD% = ^ 100%
Jí
n: số lần xác định
x¡: kết quả xác định lần thứ i

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u
3.1 MẪU DÙNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG:
Mẫu dùng để định lượng là những mẫu đã chọn ở phần đối tượng nghiên cứu
3.2 KHẢO SÁT CHỌN ĐlỀU KIỆN SẮC KÝ:
Qua quá trình khảo sát thí nghiệm, nghiên cứu tính chất lý hoá của các
vitamin Bị, Bg, B|2 cũng như tham khảo các tài liệu chúng tôi đã chọn kiểu sắc
ký pha đảo, sử dụng cột C8 , lựa chọn pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát
hiện thích hợp để định lượng vitamin B|2 trong chế phẩm 3B.
3.2.1 Khảo sát chọn các điều kiện sắc ký:
* Lưa chon bước sổng: Vitamin B|2 có 3 cực đại hấp thụ ở các bước
sóng 278nm, 361nm, 550nm. Chúng tôi chọn bước sóng 361nm, là bước sóng
hấp thụ cực đại B|2 phát hiện được phổ sắc ký đồ của Bi2 với pic cân xứng, đủ
lớn.
* Lưa chon cốt: Cột dùng để chạy sắc ký mà chúng tôi sử dụng là cột
Apolo C8 (150 X 4.6 mm), 5jim
* Lưa chon pha đống:
Bảng 1: Tỷ lệ pha động và tốc độ dòng đã khảo sát
STT Pha động
Tốc đô dòng(ml/phút)
Methanol(%) Na2HPƠ4 10 %
Kết quả
1
40.5
59.5
0.5
2 38.5
61.5
1.0 Tốt nhất
3
37.5

62.5
1.5
4 36.5
63.5 Tốt nhất
2.0
5 35.5
64.5
2.5
Qua khảo sát, chúng tôi chọn pha động là hỗn hợp dung môi gồm: dung
dịch Na2HPƠ4 10% và Methanol có tỷ lệ về thể tích là Na2HPƠ4 (10%):