Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
%$* »9^ «ỉ« «9^ mỊ^ «2^ «Ỹ^ %f^ »$4 «1^
•Ị^ •ĩ^ *31^ •ĩ^ •ậ^
TRẦN THỊ THU TRANG
XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
AMIKACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI DETECTƠ TÁN XẠ BAY HƠI
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2000- 2005)
^? ĩffiỂ àỉáư íẩn ạ. : Th.s Nguyễn Thị Kiều Anh
Th.s Nguyễn Tuấn Anh
* 9 ^ iA ự ie /ù ẹ ft : Phòng Đông Dược- Viện Kiểm Nghiệm
Q X ià ỉạ ừ ín . ¿AạHe A iên. : Tháng 3- 5/ 2005
Hà Nội- 5/ 2005
N ' r j • A
D + 3 /^ i’ ■
e Ầ m y i M
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm
ơn Thạc sĩ Nguyễn Thị Kiều Anh, Thạc sĩ Nguyễn Tuấn Anh , người
đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài này.
Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Đông Dược- Viện Kiểm
Nghiệm, các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá Phân Tích - Trường
Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành
khoá luận.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo đã giảng dạy và
giúp đỡ em trong thời gian học tập tại nhà trường.
Em xỉn chân thành cảm ơn !
s v : Trần Thị Thu Trang
Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ
. 1
Phần 1: TỒNG QUAN
1.1 Đại cương về amikacin Sulfat 3
1.2 Một số phương pháp định lượng amikacin 4
1.3 Phương pháp khảo sát trong khóa luận 9
Phần 2: ĐÔÌ TƯỢNG, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u
2.1. Dụng cụ hoá chất và đối tượng nghiên cứu 17
2.1.1. Dụng cụ và hoá chất 17
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 17
2.2. Nội dung nghiên cứu
17
2.3. Phương pháp nghiên cứu
.
18
2.3.J Chuẩn bị mẫu phân tích 18
2.3.2 Điều kiện định lượng 19
23.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
19
Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 21
3.2. Thẩm định phương pháp định lượng amikacin

27
3.3.1. Độ chọn lọc 27
3.3.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 28
3.3.3. Độ chính xác của phương pháp
30
3.3.4. Độ đúng của phương pháp 30
3.4. ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng

amikacin trong chế phẩm 31
Phần 4: KÊT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
NHữ^G CHỮVIẾT TẮT
AMK : Amikacin sulfat
ELSD : Detectơ tán xạ bay hơi
( Evaporative Light- Scattering Detector)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
( High- Performance Liquid Chromatography)
IS : Chuẩn nội ( Internal Standard)
MeOH : Methanol
SKS : SỐ kiểm soát
Ký hiệu
Nội dung Trang
Bảng 1
Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký
27
Bảng 2
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
29
Bảng 3
Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
30
Bảng 4
1
I
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
31
Báng 5

Kết quả định lượng amikacin Sulfat trong chế phẩm
31 1

.


.

1
DANH MỤC CÁC HÌNH
Ký hiệu
Nội dung
Trang
Hình 1
Sắc ký đồ phân tích AMK với pha động có muối amonifomat
21
Hình 2
Sắc ký đồ thu được khi pha động là hệ 1 (a) và hệ 2 (b)
22
Hình 3
Sắc ký đồ thu được khi pha động là hệ 3 (a), hệ 4 (b), hệ 5 (c)
23
Hình 4
1
Sắc đồ thu được khi tốc độ dòng 0,5 ml/phút (a); 0,8 ml/ phút
(b); 1 ml/ phút (c)
24
Hình 5
Sắc ký đồ thu được khi tốc độ dòng khí là 1,8 1/ phút (a) và 2
1/ phút (b)

25
Hình 6
Sắc ký đồ thu được khi đặt nhiệt độ detectơ 100°c (a) và
105"C (b)
25
Hình 7
Sắc ký đồ minh hoạ xác định sự phù hợp của hệ thống sắc ký
26
Hình 8
Sắc ký đồ (a):mẫu trắng; (b): mẫu trắng thêm chuẩn nội; (c):
mẫu chuẩn AMK có thêm chuẩn nội
28
Hình 9
Đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích
pic AMK/ IS vào nồng độ AMK
29
ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay trên thị trường các chế phẩm kháng sinh rất phong phú và đa
dạng. Aminoglycosid là nhóm kháng sinh lớn, rất có hiệu quả trong điều trị,
đặc biệt với các nhiễm khuẩn nặng. Là một kháng sinh trong họ, amikacin
được chỉ định trong các trường hợp như; nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn tiết
niệu, viêm phổi
Với kháng sinh aminoglycosid, phương pháp vi sinh được sử dụng phổ
biến trong kiểm nghiệm, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một số hạn chế:
tốn nhiều thời gian, độ chính xác chưa thật cao, không có khả năng định tính
và đặc biệt khó khăn khi định lượng chế phẩm kháng sinh là hỗn hợp nhiều
thành phần.
Để khắc phục hạn chế này, một số các phưofng pháp phân tích hiện đại
đã được ứng dụng như: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),
phương pháp điện di mao quản (EC) hay phưoỉng pháp sắc ký lófp mỏng Tuy

nhiên, do đặc điểm cấu tạo phân tử: không có khả năng hấp thụ tử ngoại hoặc
phát huỳnh quang, cho nên muốn sử dụng được các detectơ thông thường
(huỳnh quang, UV- VIS ) thì kháng sinh aminoglycosid cần phải được dẫn
xuất hoá trước cột hoặc sau cột. Kỹ thuật này phức tạp, quá trình phân tích trải
qua nhiều giai đoạn và môi trường độc hại Do đó việc xây dựng một
phương pháp định lượng trực tiếp là cần thiết.
Detectơ tán xạ bay hơi (ELSD) phát hiện các chất trực tiếp, dựa trên
nguyên tắc: tiểu phân chất phân tích ít bay hơi hơn pha động tán xạ ánh sáng
lase và cho các đáp ứng khác nhau, ứng dụng ELSD trong hệ thống HPLC để
xây dựng một phương pháp mới có khả năng định lượng các aminoglycosid
nhanh, trực tiếp, kỹ thuật đơn giản và có độ chính xác đảm bảo, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài:
"Xây dựng phương pháp định lượng amikacỉn bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao với detectơ tán xạ bay hơi".
* Đề tài được tiến hành với mục tiêu:
• Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng HPLC với
ELSD
• ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng amikacin
trong chế phẩm.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ AMIKACIN SULFAT: [1], [8], [13]
Công thức:
HO.
/—0
H2N, Ấ
ì HO T 0 HN
/— 0, Òh V-<.' h 'oh
/ o H XHO { )
0H V
(C22H 43N50i 3 ),2 H 2 S 0 4

Tên khoa học. 6-0-(3-amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-4-0-(6-amino-6-deoxy-a-D-
glucopyranosyl)-1-A/-[(2S)-4-amino-2-hydroxybutanoyl]-2-deoxy-D-streptannine sulphate
Tên chung quốc tê: Amikacin Sulfat
Tính chất lý hoá: Amikacin S u lfa t dạng bột kết tinh trắng tan tốt trong nước,
khó tan trong alcol và aceton. Không có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại.
Dược lý và cơ chế tác dụng:
Amikacin là một kháng sinh bán tổng hợp. Thuốc diệt khuẩn nhanh do
gắn hẳn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom và ngăn chặn sự tổng hợp protein của
vi khuẩn.
Thuốc có tác dụng mạnh trên các vi khuẩn gram âm đặc biệt các trực
khuẩn ưa khí và tác dụng được trên một số vi khuẩn gram dương ( s.
pneumoniae, s. pyogenes ).
Chỉ định:
Amikacin được chỉ định để điều trị nhiễm khuẩn nặng đe doạ lính
mạng, đặc biệt chưa biết nguyên nhân hoặc nhiễm khuẩn nghi do vi khuẩn
gram âm. Có hiệu quả tốt trong điều trị nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn tiết
niêu
Liều dùng:
Người lớn, trẻ em có có chức năng thận bình thường: 15 mg/kg/ngày,
tiêm bắp, truyền tĩnh mạch, tiêm dưới da 1- 2 lần/ ngày. Không tiêm tĩnh
mạch trực tiếp.
Dạng thuốc: Lọ dung dịch tiêm amikacin Sulfat; lọ bột đông khô kèm nước
cất pha tiêm.
Một số biệt dược: Amikacin; Amikaye (Hàn quốc); Amikacin Sulfat;
Opekacin (Mỹ); Amiklin (Pháp); Licacin (Italia); Opekalin (Hồng kông)

1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMIKACIN
Trong dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc, và các tài liệu khác đã công bố một
số phương pháp được áp dụng để định lượng AMK.
1.2.1. Phương pháp vi sinh: [17]

Nguyên tắc: AMK khuếch tán vào môi trưòfng dinh dưỡng đặc đã cấy vi sinh
vật chỉ thị, tạo ra các vòng ức chế vi sinh vật có đưòfng kính tỷ lệ thuận với
logarit nồng độ tưoỉng ứng. Hoạt lực của chất thử được so sánh với chất chuẩn
theo phương pháp thống kê.
Các điều kiện định lượng:
Chủng thử: Bacillus subtilis
Môi trường: Pepton 5 g
Cao thịt bò 3 g
K2HPO4 3g
Thạch 15- 20 g
Nước 1000 ml
pH= 7,8- 8,0
Nồng độ amikacin Sulfat định lượng; 0,9- 4,5 lư / ml
Điều kiện ủ: Nhiệt độ: 35- 37 °c
Thời gian: 14- 16 giờ
Phương pháp này có thời gian phân tích dài, độ chính xác chưa thật cao.
Gần đây phương pháp HPLC, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), điện
di mao quản (CE) được nghiên cứu ứng dụng như một công cụ hiệu quả nhằm
rút ngắn thời gian phân tích cũng như có thể định tính, định lượng các chế
phẩm là hỗn hợp nhiều thành phần. Trong đó HPLC là phương pháp sử dụng
rộng rãi hơn cả.
1.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC): [7]
Các tác giả ứng dụng kỹ thuật HPTLC để định lượng AMK với các điều
kiện sau:
Dung dịch AMK 1 mg/ ml được chấm lên bản mỏng silicagel
6OF254 (dùng cho HPTLC)
Dung môi triển khai: CH3OH: 25%NH3: cnc\,= 5: 5: 1
Dung dịch phát hiện: 0,5% Ninhydrin trong n- butanol
Kết quả định lượng được tính toán dựa trên mật độ vết đo ở bước
sóng 498 nm. Với khoảng tuyến tính 500- 3000 ng/ ụl.

1.2.4 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detectơ huỳnh quang: [15]
AMK trong huyết tương sau khi xử lý được dẫn xuất hoá với thuốc thử
1- methoxycarbonyl- indolizine- 3,5- dicarbaldehyde 15 phút trong bóng tối.
Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng điện di mao quản điện động
mixen ( MEKC) trong ống mao quản ( 75 cm X 50 ụm), ở nhiệt độ 40 “c, và
đặt điện thế 30 kv.
Pha động: 40 nM- sodium dodecyl sulfat trong 20 nM đệm phosphat-
borat pH= 7.
Detectơ huỳnh quang: bước sóng phát xạ 482 nm, bước sóng kích thích
414 nm.
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Trong dược điển Anh, Mỹ cũng như một số tài liệu tham khảo khác đã
sử dụng hệ thống HPLC để định lượng AMK với các detectơ thích hợp khác
nhau. Một số các chương trình sắc ký đã được áp dụng
aJ Phương pháp HPLC với detectơ điện hoá: [20]
Theo dược điển Mỹ 27, AMK được định lượng bằng phương pháp
HPLC dựa trên các điều kiện:
Cột: 250 X 4 mm với chất nhồi L47 (cột trao đổi anion, nhóm liên kết
triethylamin)
Pha động: Dung dịch NaOH 0,115 N
Tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 ụl
Detectơ điện hoá.
bJ Phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang: [19]; [21 ]
* Chương trình 1: Dẫn chất hoá trước cột: [19]
Sau khi loại protein và tạp chất trong mẫu huyết tương chứa AMK, tiến
hành dẫn xuất hoá mẫu thử với thuốc thử 0-phthalaldehyde, sản phẩm tạo
thành được phân tích bằng phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang theo
các điều kiện sau:
Cột: Kromasil 100 C18 (15 cm X 4 mm, 5ụm)

Pha động; MeOH: H2O = 69; 21 (v/v) có chứa trikali EDTA (2,2 g/1)
Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút
Thê tích tiêm; 20 Ml
Detectơ huỳnh quang: bước sóng kích thích 360 nm, bước sóng phát xạ
435 nm
* Chương trình 2: Dẫn chất hoá sau cột: [21 ]
Wiehert B, Schreier H, Derendorf H đã thực hiện nghiên cứu định lượng
AMK trong dịch sinh học. Amikacin và chất chuẩn nội tobramycin được tách
ra khỏi huyết tương bằng phương pháp sắc ký gel trao đổi ion, sau đó tiến
hành rửa giải với dung dịch Na2S04, thu được dung dịch chạy sắc ký.
Cột sắc ký: Nucleosil C-18 (150 X 4,6 mm, 10 ụm )
Pha động: gồm Natri Sulfat 0,2 M; Natri pentane sulphonate 0,02M và
1 ml acid acetic trong vừa đủ lOOOml nước (pH= 3,3)
Tốc độ dòng: 1,2 ml/ phút
AMK sau khi được tách ở cột sắc ký, phản ứng với thuốc thử o-
phthalaldehyde và mercaptoethanol trong đệm borat pH= 10,4, phản ứng được
thực hiện ở 50 °c.
Detectơ huỳnh quang: bước sóng kích thích 340 nm, bước sóng phát xạ
418 nm.
cJ Định lượng AMK bằng phương pháp HPLC với detectơ ư v
* Chương trình 1: [11]
AMK được dẫn chất hoá với thuốc thử 1- napthylisothiocyanate ở 70"C,
thêm methylamineacetonitril. Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng hệ
thống HPLC theo chương trình sắc ký:
Cột sắc ký: Lichro Cart RP- C18
Pha động: H p : CHgCN^ 57: 43 (v/v)
Detectơ u v : bước sóng 230 nm
Thể tích tiêm; 10 ụ 1
* Chương trình 2: [9], [18]
Amikacin được dẫn chất hoá với thuốc thử acid 2,4,6 - trinitrobenzene sulfonic

có pyridine trong môi trường phản ứng. Hỗn hợp được làm nóng cách thuỷ tới
75°c trong vòng 45 phút, sau đó được làm lạnh tới nhiệt độ phòng và lọc qua
màng lọc có kích thước nhỏ hofĩi 0,5 ụm được dung dịch chạy sắc ký.
Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh; cột Cjg (250x 4,6 mm, Sụm)
Pha động: CH3OH: K2HPO4 0,27% =72: 28 .
Điều chỉnh pH tới 6,5 bằng dung dịch KOH 0,4 N
Tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 ụ ỉ
Detectơ UV: Bước sóng 340 nm.
* Chương trình 3: [12]
Cũng tiến hành dẫn xuất hoá AMK với acid 2,4,6-
trinitrobenzensulfonic trong môi trường pyridin có thêm 4-
dimethylaminopyridin ở nhiệt độ 75° c trong 75 phút. Sau đó làm lạnh xuống
nhiệt độ phòng, thêm dung dịch acid triAuoroacetic. Lung, K. R.; Kassal,
K.R.; Green, J.s.; Hovsepian, P.K đã chọn các điều kiện sắc ký như sau:
Cột sắc ký: Zorbax SB- C18 (15 cm X 4,6 mm)
Pha động: KH2PO4 0,02 M: CH3CN: CRjOU= 45: 41: 14, chỉnh
pH= 7,7 bằng dung dịch NaOH 50%
Tốc độ dòng: 2 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 MI
Detectơ UV; bước sóng 350 nm.
Như đã trình bày ở trên, AMK không định lượng được trực tiếp bằng
phương pháp HPLC với detectơ huỳnh quang hoặc u v . Do phân tử không
chứa các nhóm chức hấp thụ tử ngoại hoặc có khả năng phát xạ do đó cần phải
tiến hành dẫn xuất hoá.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành triển khai một phương pháp
mới sử dụng detectơ tán xạ bay hơi- có khả năng phát hiện trực tiếp các chất ít
bay hơi hơn pha động, không dựa trên đặc tính quang học của chất phân tích,
thích hợp cho định lượng kháng sinh aminoglycosid. Trên cơ sở đó xây dựng
phương pháp định lượng AMK bằng HPLC với ELSD.

1.3. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TRONG KHOÁ LUẬN
1.3.1. Khái quát về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):[2],
[3], [4], [5], [20]
Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý dùng để tách,
định tính, định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau
giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào nhau: Pha
tĩnh (nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải). Pha động và mẫu
thử được bơm qua cột với áp suất cao, các chất phân tích sẽ di chuyển theo pha
động qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ theo ái lực của chúng với hai pha và
dẫn đến sự tách các chất. Sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp
phụ hoặc trao đổi ion
Quá trình tách sắc ký phụ thuộc vào pha tĩnh, pha động và chất phân
tích.
Pha tĩnh là thích hợp khi đáp ứng các điều kiện sau:
• Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
• Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký
nhất định.
• Tính chất bề mặt phải ổn định.
• Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
• Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
Các chất phân tích sau khi vào cột được tách là do sự tương tác khác nhau với
pha tĩnh. Nó sẽ được di chuyển ra khỏi cột nhờ quá trình rửa giải của một
dung môi hay hỗn hợp các dung môi thích hợp, đó chính là pha động.
* Pha động
Bản chất dung môi, tỷ lệ các thành phần , pH, quyết định đến hiệu suất
tách của quá trình sắc ký, pha động phải được lựa chọn một cách thích hợp.
Pha động có thể ảnh hưởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu giữ của
chất tan, hiệu lực cột tách, độ phân giải các chất, độ rộng, sự cân đối
pic Chính vì thế, pha động trong sắc ký phải thoả mãn một số điều kiện:
• Trơ đối với pha tĩnh

• Hoà tan được chất cần phân tích
• Bền vững, nhanh đạt được cân bằng trong quá trình sắc ký
• Có độ tinh khiết cao
• Phù hợp với loại detectơ dùng để phát hiện các chất phân tích
• Có tính kinh tế và không quá hiếm
Các chất sau khi ra khỏi cột được phát hiện bởi detectơ. Một detectơ lý tưởng
phải đạt được những yêu cầu: [5;
• Độ nhạy cao
• Đáp ứng được với chất cần phân tích
• Thể tích chết ngoài detectơ nhỏ
• Không phá huỷ mẫu
• Độ lặp lại tốt, dễ sử dụng.
Có một số loại detecto như: detectơ UV- VIS , detectơ điện hóa, detectơ
huỳnh quang, detectơ tán xạ bay hơi (ELSD), detectơ khúc xạ ánh sáng
Hiện nay phương pháp HPLC được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong
phân tích dược phẩm. Là thiết bị dùng để định tính, định lượng đồng thời
nhiều chất cho kết quả có độ tin cậy cao. Tuỳ theo đặc tính của chất phân tích,
hệ thống HPLC sẽ được kết nối với các detectơ thích hợp. Như đã trình bày ở
trên, với hoạt chất amikacin, có rất nhiều phương pháp định lượng đã được
nghiên cứu dùng HPLC với các detectơ: điện hoá, huỳnh quang hay u v . Mỗi
phương pháp đều có những điểm ưu việt nhất định, trong nghiên cứu này
chúng tôi muốn trình bày một phương pháp mới nhằm mở rộng hơn nữa phạm
vi ứng dụng của HPLC, đồng thời cung cấp một phương pháp định lượng
AMK với thời gian phân tích hợp lý, kỹ thuật đcm giản và cho kết quả tin cậy:
Phương pháp HPLC với detectơ tán xạ bay hơi.
* Detectơtán xạ bay hơi ( Evaporatỉve Light Scatterìng Detector ): [6]; [10];
[14]; [16]
ELSD mới được đưa vào sử dụng ở Việt Nam dùng để phát hiện các
chất không hấp thụ ánh sáng tử ngoại. Pha động chứa chất phân tích được mù
hoá cùng với khí trơ và được bay hơi trong ống gia nhiệt. Các tiểu phân chất

phân tích được phát hiện do tán xạ ánh sáng. Đáp ứng của detectơ không phụ
thuộc vào đặc tính quang học của chất hoà tan, các chất ít bay hơi hơn pha
động có thể được phát hiện. Mỗi tiểu phân trong mẫu đều được phát hiện và
cho các tín hiệu tưcmg ứng. ELSD thường dùng để phát hiện các chất như:
đường, lipid, polimer, acid amino, steroid, catechins, ginsenoids, kháng sinh
không hấp thụ UV, Ngày nay ELSD dần được ứng dụng rộng rãi trong hệ
thống HPLC như một công cụ rất hiệu quả.
Sơ đồ phát hiện:
Dung dịch rửa giải Khí N2
Khí thải
• Nguyên tác hoạt động:
ELSD hoạt động dựa trên nguyên tắc:
Bước 1: Quá trình mù hoá
Dòng dung dịch rửa giải được đi qua một đầu kim phun, sau đó chúng được
trộn với khí N2 hình thành nên trạng thái sưcmg mù (aerosol).
Bước 2: Bay hơi pha động
Dòng sương mù được đi qua một ống gia nhiệt, tại đây pha động được bay hơi
còn lại các tiểu phân chất phân tích.
Bước 3: Phát hiện
Các tiểu phân chất phân tích đi qua ống đo có chiếu chùm tia lase, hiện tượng
tán xạ ánh sáng xảy ra.
Tiểu phân chất phân tích (ít bay hơi hơn pha động) tán xạ ánh sáng lase
và cho các đáp ứng khác nhau, tín hiệu này sẽ được máy tính ghi lại thông qua
các tín hiệu điện và được minh hoạ trên sắc đồ, hình 1.1:
Hình 1.1: Giản đồ sắc kỷ hai chất 1 và 2.
Trong đó:
to (Thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ
thống sắc ký.
Ir (Thời gian lưu): Thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào
cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.

ír (Thời gian lưu thực) = tf, - íq.
ỗ( (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa pic tại các điểm uốn tương ứng.
(Oq 5 (Độ rộng pic ở nửa chiều cao) = 2,354ôt.
(Oj,: Độ rộng đáy pic.
1.3.2 Một sô thông sô đặc trưng: [2]; [3]; [4]; [5]; [20]
* Thời gian lưu tỵ:
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ
thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh pic. Thời gian lưu Ir cho thông tin về mặt
định tính đối với mỗi chất khi tiến hành sắc ký trong điều kiện nhất định.
* Hệ sô dung lượng k':
Trong thực nghiệm k' được tính theo công thức:
k ' = — = ~ = ^ - 1
/q Íq Íq
Hệ số dung lượng cho ta biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha,
tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha
động ở thời điểm cân bằng. Trên thực tế k nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt
nhất, các giá trị k lớn hơn chỉ dẫn đến sự doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian
lưu kéo dài, k’ thấp tương ứng với chất bị rửa giải ở thời điểm gần với thời
điểm bơm mẫu và do đó làm giảm khả năng tách.
* Hệ sô chọn lọc a:
a = ^ = (k 2 > k ',)
Để tách riêng hai chất thường chọn a nằm trong khoảng 1,05 ^ 2 .
* Hiệu lực cột:
Hiệu lực cột sắc ký được đánh giá thông qua hai thông số: số đĩa lý
thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký coi như có N tầng lý
thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân
bằng. Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H.
Số đĩa lý thuyết (N) trên một đofn vị độ dài của cộ t:
N =
ỈR

2
= 16
2
= 5,54
tu
_co,_
_ 0)0,5 _
Chiều cao của đĩa lý thuyết:
— với L: chiều dài cột sắc ký.
N V J
* Độ phân giải Rg.'
Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc
ký và được tính theo công thức:
R,
__U77Ợ
" 0 , 5 I + ^ 0 , 5 2
Trường hợp hai pic có độ lớn gần bằng nhau thì:
Rg = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R5 = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
Rs = 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%-
Độ phân giải phụ thuộc hệ số k2 (hệ số dung lượng của cấu tử ra sau),
độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:
D . ^'2
/? ,. = X

X —
4 a \ + k\_
Như vậy, để tăng độ phân giải Rs ta có thể tăng N (dùng cột có hiệu lực
cao hơn hoặc giảm tốc độ dòng pha động); tăng k'2 (bằng cách thay đổi thành
phần pha động); tăng a (bằng cách thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần

pha động).
* Hệ số bất đối xứng (Tỷ. cho biết mức độ đối xứng của pic trên sắc ký đồ
co,.
T=
^0,05
2/
Với f khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến mép
đường cong phía trước ở tại 1/20 chiều cao pic; Woo5 là độ rộng pic ở 1/20
chiều cao pic. Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp
nhận được.
1.3.3. Các phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký: [3]
Các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của các chất tỷ
lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó
* Phương pháp chuẩn ngoại:
Là phương pháp trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến
hành sắc ký dưới cùng điều kiện. So sánh diện tích (chiều cao) pic của chất
phân tích trong mẫu chuẩn và trong mẫu thử sẽ tính được nồng độ các chất
phân tích trong mẫu thử.
* Phương pháp chuẩn nội:
Cho vào trong mẫu thử và mẫu chuẩn một lượng như nhau chất chuẩn
nội thích hợp. Chất chuẩn nội giúp cực tiểu hoá các sai số có thể xảy ra trong
quá trình xử lý mẫu, do máy móc và kỹ thuật tiến hành
Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã khảo sát. So sánh tỷ số diện tích pic của
chất thử và chuẩn nội trong mẫu thử với tỷ số diện tích pic chất chuẩn và
chuẩn nội trong mẫu chuẩn, từ đó sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu
thử.
* Phương pháp thêm chuẩn:
Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn ngoại và chuẩn nội. Thêm
vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành
phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện.

Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ AC
(lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng diện tích pic AS theo công thức :
c = s * AC/ AS
ưu điểm là có độ chính xác cao, loại trừ được nhiều sai số do các yếu tố ảnh
hưởng và trong quá trình xử lý mẫu.
* Phương pháp chuẩn hoá diện tích
Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành
phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích
của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp này yêu cầu tất cả
các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện. Kỹ thuật này được dùng
để xác định tạp chất trong mẫu thử.
Trong quá trình phát hiện, các đáp ứng của ELSD còn bị ảnh hưởng bởi
một số yếu tố như: quá trình phun mù, tốc độ bay hơi pha động, sự ngưng tụ
các tiểu phân, khả năng tán xạ ánh sáng của phân tử chất không bay hơi Do
đó để đảm bảo cho quá trình định lượng được chính xác, giảm thiểu các sai số
có thể xảy ra chúng tôi lựa chọn phương pháp định lượng dùng chuẩn nội.
Tobramycin Sulfat được lựa chọn do đáp ứng các yêu cầu đối với chất
chuẩn nội: [3]
<♦ Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội được tách hoàn toàn
và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích.
Có cấu trúc hoá học tương tự chất thử
♦♦♦ Không phản ứng với bất cứ thành phần nào của mẫu thử
Có đô tinh khiết cao và dễ kiếm.
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN c ú u
2.1. Dụng cụ- hoá chất và đôi tượng nghiên cứu:
2.1.1. Dụng cụ và hoá chất:
Dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao; Merck-Hitachi, Detectơ Altech ELSD
2000 và được nối với máy tính IBM, máy in Laser.

- Bộ lọc dung môi
- Cân phân tích.
- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết: Bình định mức chính xác lOml, 20ml,
25ml; ống đong, pipet chính xác,
Hoá chất
- Chất chuẩn amikacin Sulfat (chuẩn asean 914 IU/ g- SKS: 89040)
- Methanol: dùng cho sắc ký lỏng
- Acid 2,2,3,33-Pentafluoropropionic
- Tobramycin Sulfat (chất đối chiếu 99,2%)
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu:
Thuốc tiêm Amikacin chứa amikacin Sulfat 500 mg/ 2ml, (sản xuất bởi
IL.Dong pharm.Co., LTD. SKS: 402001 và 009001).
2.2 Nội dung nghiên cứu:
2.2.1. Xây dựng phương pháp HPLC sử dụng ELSD định lượng amỉkacin
trong chế phẩm
<♦ Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Sử dụng cột sắc ký có sẵn Lichrosorb RP 18 (250 X 4 mm, 10 ụm), chúng
tôi tiến hành khảo sát các điều kiện:
* Tỷ lệ các thành phần trong pha động
* Tốc độ dòng của pha động
* Tốc độ khí của detectơ
* Nhiệt độ của detectơ
Từ các điều kiện đã lựa chọn chúng tôi tiến hành đánh giá sự ổn định của hệ
thống sắc ký.
*t* Thẩm định phương pháp định lượng amỉkacỉn
* Khảo sát độ chọn lọc
* Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ AMK và tỷ lệ diện tích pic
AMK/IS.
* Khảo sát độ chính xác của phương pháp
* Khảo sát độ đúng của phương pháp .

Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử nằm
trong khoảng tuyến tính. Tiến hành sắc ký mẫu thử song song với mẫu chuẩn
theo chương trình đã chọn.
2.2.2. ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng amikacin trong chê
phẩm.
Để đảm bảo cho quá trình định lượng giảm thiểu các sai số chúng tôi sử
dụng phương pháp định lượng dùng chuẩn nội. ở đây tobramycin Sulfat được lựa
chọn do đáp ứng được các yêu cầu: trong cùng điều kiện sắc ký amikacin Sulfat
và tobramycin Sulfat có thời gian lưu thích hợp, hai pic tách tốt, đồng thời chuẩn
nội không gây ảnh hưởng cho quá trình sắc ký
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
Amikacin Sulfat và tobramycin Sulfat là các chất tan rất tốt trong nước.
Chúng tôi lựa chọn nước làm dung môi pha loãng.
* Pha dung dịch chuẩn nội IS (nồng độ 1 mg/ ml): Cân chính xác 25mg
tobramycin Sulfat chuẩn hoà tan trong bình định mức 25 ml.
* Pha dung dịch gốc A: Cân chính xác khoảng 10 mg amikacin Sulfat
chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, thêm nước đến vạch, lắc đều.
* Pha dung dịch chuẩn S: Hút chính xác 2 ml dung dịch A và 2 ml dung
dịch IS cho vào bình định mức 20 ml, cho nước đến vạch, lắc đều, lọc qua màng
lọc 0,45 ụm. Thu được dung dịch đối chiếu là hỗn hợp amikacin Sulfat chuẩn
100 ụg/ ml và tobramycin Sulfat 100 Mg/ ml.
* Pha dung dịch thử TI (nồng độ 1 mg/ ml): Hút chính xác 1 ml amikacin
Sulfat 250 mg/ ml cho vào bình định mức 25ml, thêm nước đến vạch, lắc đều.
Dung dịch thu được có nồng độ khoảng 10 mg/ ml. Hút chính xác 2 ml dung
dịch này pha loãng trong bình định mức 20 ml được dung dịch có nồng độ
khoảng 1 mg/ ml.
* Pha dung dịch thử có chuẩn nội: Hút chính xác 1 ml dung dịch Tl, 1 ml
dung dịch IS cho vào bình định mức 10 ml, thêm nước đến vạch, lắc đều. Dung
dịch thu được có nồng độ AMK khoảng 100 ỊJg/ ml và IS 100 Mg/ ml

2.3.2. Điều kiện định lượng
■ Cột Lichrosorb RP 18 (250 X 4mm, 10 ụm)
■ Detectơ : Alltech ELSD 2000
■ Pha động: CH3OH: 0,3% acid pentafluoropropionic / HjO = 50:50
■ Tốc độ dòng : 0,8 ml/ phút
■ Nhiệt độ detectơ : 105 °c
■ Tốc độ dòng khí; 2 1/ phút
2.3.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả:
Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ với tỷ số diện tích
pic (chất phân tích và chất chuẩn nội) trên sắc đồ. So sánh tỷ số diện tích pic của
mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung dịch phân tích từ đó
tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định lượng.
Công thức tính như sau:
Rj X c X D
X(mg/ml) = —

Rc X 1000
Trong đó;
Rc: lần lượt là tỷ số diện tích pic amikacin Sulfat/ tobramycin
sulfat của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
C: nồng độ của dung dịch chuẩn (Mg/ml)
D: hệ số pha loãng.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê. Các công
thức liên quan được sử dụng trong quá trình tính toán:
* Độ lệch chuẩn:
* Độ lệch chuẩn tương đối:
t
1 = 1
______________________________
n - 1

RSD (%) = ^100
X
Trong đó: X ị; là kết quả của lần xác định thứ i
n : số lần xác đinh