Bước đầu đánh giá sinh khả dụng viên nén diclofenac tác dụng kéo dài

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM BẢO TÙNG
BƯỚC ĩ)Xu ĐÁNH GIÁ SINH KHẦ DỌNG
VIÊN NÉN DICLOFENAC TÀC DỤNG KÉO DÀI
^a ố ^ iên huóng dẫn:
PGS.TS. Võ Xuân Minh
TS. Phạm Thị Minh Huệ
Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế
Thời gian thực hiện: tháng 02-05/2005
HÀ NỘI, 0 5-2005
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tói:
PGS.TS. Võ Xuân Minh
TS. Phạm Thị Minh Huệ
đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình định hưóng nghiên cứu và
thực hiện khoá luận tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Bộ môn Bào chế, Bộ
môn Dược lý Trường đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm Nghiệm-Bộ Y Tế đã
giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá luận.
Tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên
khích lệ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội ngày 20/05/2005
Sinh viên:Phạm 3 ả o Tùng
MỤC LỤC
■ ■
Lời cảm ơn Trang
Danh mục chữ viết tắt
Mục Lục
Đ ặt Vấn Đ ề 1
PHẦN 1 - TỔNG QUAN 3

1.1. Natri diclofenac và các dạng bào chê dạng tác dụng kéo dài 3
1.1.1. Natri diclofenac 3
1.1.2. Một số nghiên cứu bào chế diclofenac dạng tác dụng kéo dài

4
1.1.3. Một số dạng bào chế của diclofenac có trên thị trưòíng

.
8
1.2. Sinh khả dụng và tương đương sinh học 9
1.2.1. Khái niệm 9
1.2.2. Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đưomg sinh học

9
1.2.3. Một số nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng dạng tác dụng kéo dài
của natri diclofenac 14
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

18
2.1. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
18
2.1.1. Nguyên liệu 18
2.1.2. Chế phẩm đối chiếu 18
2.1.3. Thiết bị 18
2.1.4. Súc vật thí nghiệm 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1. Phương pháp bào chế viên nén Diclofenac-KD
19
2.2.2. Đánh giá tiêu chuẩn chất lượng viên nén Diclofenac-KD
19

2.2.3. Đánh giá sinh khả dụng invivo 22
2.3. Kết quả thực nghiệm và bàn luận 27
2.3. l. Nghiên cứu bào chế viên nén Diclofenac-KD ở quy mô pilot

27
2.3.2. Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng viên nén Diclofenac-KD 28
2.3.3. Đánh giá sinh khả dụng invivo viên nén Diclofenac-KD 29
23.3.1 'Xây dựng phương pháp định lượng diclofenac trong huyết tương

29
23.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong huyết tương

31
23.3.3. Đánh giá sinh khả dụng ỉn vivo viên nén Diclofenac-KD
và viên đối chiếu 38
2.4. Bàn luận 43
2.4.1. Bào chế viên nén Diclofenac-KD
43
2.4.2. Xây dựng phuofng pháp định lượng diclofenac trong huyết tương

43
2.4.3. Phương pháp đánh giá SKD invivo 44
PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT

45
3.1 Kết luận 45
3.2. Đề xuất 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC CHỮVIẾT t ắ t
AUC Area under curve -

Diện tích dưới đường cong nồng độ thời gian
Cmax Nồng độ dược chất cực đại trong máu
CP Chinese pharmacopoeia
Dược điển Trung Quốc.
DĐVN Dược điển Việt Nam
HPLC High performance liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD Limit of determination
Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification
Giới hạn định lượng
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
MRT Thòi gian lưu trú trung bình
Mean retention time
RSD Relative Standard deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SD Standard deviation
Độ lệch chuẩn
SKD Sinh khả dụng
ti/2 Thời gian bán thải
TB Giá trị trung bình
TDKD Tác dụng kéo dài
TĐSH Tương đương sinh học
Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong máu
USP The United States pharmacopoeia
Dược điển Mỹ
ĐẶT VÂN ĐỀ
■
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật,

công nghệ dược phẩm cũng đã đạt được những tiến bộ vượt bậc. Những công
nghệ mới đã giúp tạo ra những dạng bào chế hiện đại, những phương pháp
đánh giá chất lượng thuốc tiên tiến. Thuốc tác dụng kéo dài (TDKD) là một
trong những phát minh nói trên. Dạng thuốc này có nhiều uu điểm nổi bật: có
khả năng kiểm soát được quá trình giải phóng dược chất, duy trì nồng độ
thuốc trong máu một thòd gian dài, do đó giảm được số lần dùng thuốc cho
bệnh nhân, giảm tác dụng phụ, và nâng cao hiệu quả điều trị.
Natri diclofenac là thuốc giảm đau chống viêm phi steroids, đã được
nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu bào chế dưới dạng TDKD giúp
điều trị hiệu quả các bệnh mạn tính. Mặc dù trên thế giói đã có nhiều biệt
dược nổi tiếng chứa natri diclofenac dạng TDKD uy tín lâu năm, nhưng ở
nước ta thuốc này vẫn chưa được phát triển, do công nghệ sản xuất và kỹ thuật
đánh giá khá phức tạp và tốn kém.
Đánh giá sinh khả dụng (SKD) in vivo là một trong những phuofng pháp
hiện đại để đánh giá chất lượng thuốc, được coi là phương pháp tin cậy và
chính xác giúp các nhà sản xuất lựa chọn được công thức và kỹ thuật sản xuất
tối ưu. Hiện nay việc đánh giá SKD in vivo trở thành phép thử bắt buộc khi
tiến hành đăng ký lưu hành các dạng thuốc TDKD, đó là thước đo chất lượng
đích thực của sản phẩm được sản xuất ra bởi các nhà sản xuất khác nhau.
Vói mục đích thăm dò xây dựng phương pháp và đánh giá SKD in vivo
viên nén Diclofenac TDKD chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: **Bước đầu
đánh giá sinh khả dụng viên nén diclofenac tác dụng kéo dàư’ với ba mục
tiêu chính sau:
Bào chế viên nén Diclofenac TDKD ở quy mô pilot, và đề xuất một
số chỉ tiêu chất lượng sản phẩm.
Xây dựng phương pháp chiết xuất và định lượng natri diclofenac trong
huyết tương.
Sơ bộ đánh giá SKD in vivo viên nén Diclofenac TDKD.
PHẦN 1 - TỔNG QUAN
1.1. NATRI DICLOFENAC VÀ CÁC DẠNG BÀO CHẾ TÁC DỤNG

KÉO DÀI
1.1.1. Natri diclofenac coo" Na^
Tên khoa học: [2-(2,6-dichloroanilino)phenyl] acetic acid
Tính chất hoá lý:
Natri diclofenac là một acid yếu, pKa = 4,0, tồn tại dưới dạng bột kết tinh hoặc
tinh thể màu trắng đến trắng ngà; dễ tan trong ethanol, methanol (24mg/ml), hơi
tan trong nước (9mg/ml ở pH7), ít tan trong aceton (6mg/ml). Hệ số phân bố dầu
nước là 13,4. Natri diclofenac hấp thụ tử ngoại thấp, cực đại hấp thụ trong
methanol ở 283nm 8 =1,05 X 10^, trong đệm pH 7,2 ở 276nm s =1,01x10^ ;
A‘V = 309-351.[4], [5], [37], [45].
Tác dụng dược lý:
Diclofenac là một thuốc chống viêm phi steroid, có tác dụng chống viêm giảm
đau, hạ sốt. Theo các tài liệu hiện nay [6], thuốc được chỉ định trong điều trị thấp
khớp và viêm khớp cấp hoặc mạn tính, thoái hoá khófp, viêm đốt sống cứng khớp.
Người lófn uống 75-150mg/ngày; trẻ em: uống l-3mg/kg thể trọng/ngày, chia
làm 2-3 lần. Tổng liều tối đa của natri diclofenac là 150mg/ngày. Tác dụng phụ
hay gặp nhất là ở đường tiêu hoá trên vói các triệu chứng như: đau bụng, buồn
nôn, nôn, ỉa chảy, viêm loét đường tiêu hoá. Thuốc làm kéo dài thời gian chảy
máu, giảm tiểu cầu và giảm bạch cầu. [
6
], [35].
Dược động học:
Diclofenac hấp thu nhanh và hầu như hoàn toàn qua đưòfng tiêu hoá. SKD đường
uống đạt khoảng 50% so vói đường tiêm tĩnh mạch. Với viên natri diclofenac
dạng TDKD, nồng độ thuốc cực đại trong huyết tương đạt khoảng
0,8|xg/ml sau khi uống thuốc 2-3h [23]. Diclofenac phân bố rộng khắp các mô và
dịch cơ thể. Thể tích phân bố biểu kiến là 0,12 - 0,17 1/kg. Thuốc liên kết cao với
protein huyết tưoíng (99,7%).
Khoảng 50-60% liều dùng đưcmg uống bị chuyển hoá qua gan lần đầu chủ yếu
do bị glucuronic hoá sau khi hydroxyl hoá. Thời gian bán thải trong huyết tưofng

là 1,2 - 2h. Diclofenac thải trừ khỏi cơ thể dưới dạng đã chuyển hoá, phần lớn
qua nước tiểu từ 50-70%, thải trừ hết sau 96 giờ. Hệ số thanh thải huyết tương
trung bình khoảng 263 - 350 ml/phút. [6], [23], [44], [35].
1.1.2. Một sô nghiên cứu bào chê diclofenac dạng tác dụng kéo dài
Diclofenac thường được sử dụng để điều trị các bệnh mạn tính, nên người
bệnh thường phải dùng thuốc nhiều lần trong thời gian kéo dài. Do vậy, chế
phẩm diclofenac TDKD rất có ý nghĩa trong điều trị. Trên thế giới cũng như
trong nước, đã có nhiều công trình nghiên cứu bào chế natri diclofenac dưới dạng
thuốc uống TDKD, sử dụng nhiều loại tá dược vói những cơ chế giải phóng dược
chất khác nhau.
Những nghiên cứu ở ngoài nước gồm:
Hệ màng bao khuếch tán:
Màng bao khuyếch tán thường là một màng polyme không tan trong dịch
tiêu hoá, có khả năng kiểm soát tốc độ giải phóng dược chất.
Ampol Mitrevej, Nuttanan Sinchaipanid và các cộng sự [24] đã nghiên cứu sử
dụng phức hợp chitosan-alginat và chitosan-pectin làm màng bao film cho pellet
diclofenac TDKD. Pellet được bao bằng chitosan-alginat 1% hay chitosan-
pectin 3% đều cho TDKD tốt. Thử độ hoà tan cho thấy dược chất giải phóng
khoảng 60% sau 12h và 85% sau 24h.
Trong một công trình nghiên cứu về công thức bào chế và độ ổn định của dạng
siêu vi nang (nanocapsules) chứa natri diclofenac, ss. Guteưes, H. Fessi và các
cộng sự [42] đã sử dụng tá dược là poly(DL-lactide). Siêu vi nang natri
diclofenac TDKD được bào chế bằng kỹ thuật polyme hoá liên pha, dựa trên
nguyên tắc phản ứng giữa 2 monome trong pha dầu và nước khi nhũ tương hoá
sẽ tạo màng polyme bao lấy hoạt chất tạo thành vi nang. Sau đó các vi nang
được đóng vào nang hoặc dập viên thành dạng thuốc sử dụng.
Hệ cốt trơ khuếch tán:
Hệ này được bào chế theo nguyên tắc phân tán natri diclofenac dạng bột
mịn vào một cốt trơ xốp, không tan trong đường tiêu hoá.
Trong nghiên cứu bào chế vi cầu chứa natri diclofenac, các tác giả [30] đã sử

dụng ethylcellulose làm tá dược tạo cốt trơ. Vi cầu được bào chế bằng kỹ thuật
nhũ tương và bốc hcd dung môi: hoà tan natri diclofenac, ethylcellulose trong
hỗn hợp dung môi gồm methanol, dicloromethan, và aceton. Natri alginat, pectin,
gelatin và một số tá dược khác được sử dụng làm tá dược điều khiển tốc độ giải
phóng. Tạo nhũ tưofng trong môi trường nước có chất nhũ hoá, nhờ khuấy trộn.
Lọc và sấy khô để thu được vi cầu.
Một số tác giả cũng tiến hành bào chế vi cầu nhưng dùng tá dược polyvinyl
alcohol. Bào chế vi cầu bằng cách tạo nhũ tưofng nước trong dầu đã được tài iiệu
[40] mô tả, vói pha nước là dung dịch natri diclofenac trong polyvinyl-alcolhol
và glutaraldehyde; pha dầu là hỗn hợp dầu parafin. Nhũ tương được hình thành
bằng cách khuấy trộn sau đó thêm acid hydrocloric để tạo vi cầu.
Ehba. Hosni [28] đã nghiên cứu bào chế viên nén natri diclofenac TDKD từ
vi hạt có chứa polycarbophyl với 2 cỡ hạt khác nhau (0,18 - 0,33mm và 0,5-
0,8mm). Natri diclofenac được hoà tan vào trong ethanol. Polycarbophyl với 2 cỡ
hạt nghiên cứu được thêm vào dung dịch thuốc nói trên. Sau khi polycarbophyl
trưcỉng nở, tiến hành bay hơi cồn để thu được vi cầu chứa dược chất, có thể sử
dụng để dập thẳng thành viên nén.
Hệ cốt sơ nước ăn mòn:
Tá dược tạo cốt thường là sáp hoặc chất béo đóng vai trò là khung mang
thuốc. Natri diclofenac được phân tán trong cốt dưới dạng bột mịn. Đây là
phương pháp được sử dụng tương đối phổ biến và đã được áp dụng để bào chế
một số biệt dược nổi tiếng của nước ngoài như Voltaren LP 100, Voldal LP 100.
Sử dụng phương pháp trên các tác giả Yasuhiko Miyagawa, Toshio Okabe [47]
trong công trình nghiên cứu của mình đã bào chế được dạng thuốc giải phóng có
kiểm soát chứa natri diclofenac, sử dụng phương pháp đùn tạo hạt, với cốt bằng
sáp Carnauba, tá dược điều khiển giải phóng là hydroxy-propylcellulose hoặc
Eudragit L-100.
Hệ cốt thân nước:
Trong hệ này cốt thường là các polyme thân nước như hydroxypropyl-
methylcellulose(HPMC), gôm xanthan Natri diclofenac cũng được phân tán vào

cốt như vói hệ sơ nước ăn mòn.
Theo M. Victoria Velasco [39], có thể bào chế dạng viên nén natri diclofenac
bằng phương pháp dập thẳng với các tá dược HPMC và aerosil. Ảnh hưởng của tỷ
lệ tá dược, kích thước tiểu phân polyme và lực nén tới khả năng giải phóng dược
chất cũng đã được khảo sát, kết quả cho thấy yếu tố ảnh hưcmg chính là tỷ lệ giữa
natri diclofenac và HPMC.
J. Sujja Areevath và cs [32] nghiên cứu bào chế dạng viên nang diclofenac
TDKD chứa các viên cốt mini (kích thước 3-5,5mm) làm từ 4 loại gôm thiên
nhiên thân nước. Kết quả cho thấy vói 3 loại gôm locust bean, karaya, và gôm
xanthan, chế phẩm có khả năng giải phóng kéo dài với các mức độ khác nhau.
Cốt với gôm xanthan, giải phóng dược chất theo động học bậc 0 khi đạt tới sự
cân bằng giữa 2 quá trình khuếch tán và hoà tan.
Khác vói nghiên cứu trên, M. J. Fernández- Hervás và cộng sự [38] đã sử dụng
chitosan và natri aliginat điều chế vi cầu diclofenac TDKD. Kết quả nghiên cứu
cho thấy chitosan làm tăng tốc độ giải phóng do làm tăng độ xốp của vi cầu.
Ngoài ra, các tác giả còn nhận thấy có thể điều khiển tốc độ giải phóng dược chất
bằng cách thay đổi tỷ lệ chitosan/natri alginat hoặc tỷ lệ dược chất/ tỷ lệ tá dược
tạo cốt.
Hệ giải phóng dược chất theo cơ chế áp suất thẩm thấu:
Hệ này được bào chế bằng công nghệ cao và có nhiều ưu điểm nổi trội.
Dược chất được dập thành viên sau đó bao một màng bán thấm có “miệng” giải
phóng dược chất. Nước từ dịch tiêu hoá qua màng bán thấm vào viên tạo một áp
suất thẩm thấu đẩy thuốc qua “miệng” có khả năng điều khiển tốc độ giải phóng
dược chất.
Meena Rani và Brahmeshwar [36] đã nghiên cứu bào chế 2 dạng viên nén natri
diclofenac: dạng viên bao bằng màng thẩm thấu và dạng viên bao có bofm thẩm
thấu, với đưòfng kính của miệng bơm là 500^m. Màng thẩm thấu là màng bao
chứa cellulose acetate 2%. Dạng viên bao bằng màng thẩm thấu có thêm PEG
400 hoặc triacetin để tạo cấc lỗ xốp giải phóng dược chất. Dạng viên bao có bơm
thẩm thấu sử dụng một kỹ thuật đặc biệt tạo (đục) lỗ có đường kính 500 |Lim làm

“miệng” giải phóng dược chất.
Những nghiên cứu trong nước:
Đã có một số tác giả nghiên cứu bào chế viên diclofenac TDKD bằng
những phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các công trình mới dừng ở qui
mô nghiên cứu, chưa có điều kiện để sản xuất ở quy mô công nghiệp
Hệ màng bao khuếch tán:
Tác giả Lê Hậu và cs [10] đã sử dụng máy tạo hạt tầng sôi để bào chế vi
hạt có chứa natri diclofenac và avicel (1:2), vi hạt được bao bằng Eudragit RLIOO
và PEG 6000 sau đó đóng nang. Kết quả đã tạo ra sản phẩm có khả năng giải
phóng kéo dài tói 12h. Cơ chế giải phóng dược chất theo kênh khuếch tán.
Sử dụng phương pháp bồi dần để tạo pellet natri diclofenac, các tác giả [17] dùng
tá dược bao là ethyl cellulose, diethylphtalat, talc, titan dioxid. Nghiên cứu cho
thấy tốc độ giải phóng dược chất phụ thuộc nhiều vào thành phần ethyl cellulose
có trong màng, trong khi đó các thành phần khác ảnh hưởng không đáng kể.
Hệ cốt sơ nước ăn mòn:
Một nghiên cứu bào chế viên nén TDKD bằng phương pháp xát hạt nóng
chảy là sáp Camauba sử dụng làm tá dược dính đồng thời là tá dược kiểm soát
giải phóng dược chất đã mang lại nhiều ưu điểm. Kết quả thử độ hoà tan so sánh
với viên Voltaren là gần giống nhau/2~ 61,1% [16].
Hệ cốt thân nước:
Lê Thị Thu Huyền đã nghiên cứu bào chế viên diclofenac TDKD vói tá
dược là gôm xanthan, lactose kết hợp với lực nén để kiểm soát sự giải phóng
dược chất. Kết quả đánh giá độ hoà tan sơ bộ cho thấy viên giải phóng tốt, thể
hiện được TDKD, sau 8 h giải phóng được 90 - 100% [12].
Khi kết hợp dicalci phosphat để kiểm soát sự giải phóng dược chất, viên nén khó
đạt được sự giải phóng hằng định theo động học bậc 0 [8].
1.1.3. Một sô dạng bào chê của diclofenac có trên thị trường
Theo khảo sát, đến năm 2005, đã có 123 chế phẩm, phổ biến nhất là dạng
viên nén, viên nang (dạng thuốc qui ước hoặc TDKD, hàm lượng 25mg, 75mg,
lOOmg), thuốc đạn (25mg, lOOmg). Một số dạng bào chế khác của diclofenac

cũng đã lưu hành như thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt, dạng gel xoa bóp dùng ngoài
[14],[20].
Số liệu thống kê theo các số đăng ký thuốc đã được cấp phép lưu hành ở Việt
Nam, thì hiện nay đang có khoảng 16 chế phẩm dạng viên chứa diclofenac hàm
lượng lOOmg, chủ yếu là dạng viên bao tan trong ruột và TDKD. Một số biệt
dược thông dụng và có uy tín được kê trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Một số biệt dược của diclofenac dạng TDKD
Tên
Dạng bào chế
Tuổi thọ Công ty sản xuất
Supsyde CR
Viên nang
24th Raptakos and Brett Co., Ltd.
Dicloran SR
Viên nén bao 36th Strides Arcolab ltd.
Voltaren L.p Viên nén bao 60th Novatis Pharma AG
Umeran SR 100
Viên mini đóng nang 36th Umedica Laboratories Pvt. Ltd
Novo-Difenac SR
Viên nén 24th Cavi-Medic InC.
1.2. SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC
1.2.1. Khái niệm
Sinh khả dụng: là đại lượng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ một chế
phẩm bào chế vào tuần hoàn chung và đưa đến nơi tác dụng.
Trong đó, mức độ hấp thu được biểu thị bằng diện tích dưới đường cong nồng độ
- thời gian (area under curve - AUC) và Cn,axỉ tốc độ hấp thu được xác định bằng
các đại lượng: và [3], [19], [26], [46].
Sinh khả dụng in vivo được biểu thị dưới 2 dạng: SKD tuyệt đối và SKD tương
đối. SKD tương đối thường được dùng nhiều hơn trong nghiên cứu phát triển các
sản phẩm thuốc generic. Khi đó, người ta thực hiện so sánh chế phẩm thử với một

chế phẩm đối chứng đã được nghiên cứu và được công nhận có hiệu quả cao.
Những nưốc có nền công nghiệp dược phát triển (Mỹ, Canada, úc, khối
Châu Âu) thưòíng qui định khi xin phép lưu hành một thuốc mói (dược chất mới,
dạng thuốc mód, đưòfng dùng mói) hoặc khi thay đổi công thức, kỹ thuật bào chế,
nguồn nguyên liệu đều phải đệ trình kết quả đánh giá SKD của chế phẩm [46].
- Tương đưong sinh học: là khái niệm chỉ hai chế phẩm thuốc có SKD khác
nhau không đáng kể khi dùng cùng một mức liều trong cùng điều kiện thử
nghiệm. [19], [46]
Hai khái niệm trên có thể khác nhau nhưng quá trình đánh giá SKD và TĐSH in
vivo thực chất là tương tự. Đánh giá SKD để xác định mức độ chất lượng và khả
năng phát huy tác dụng của sản phẩm. Đánh giá TĐSH để đánh giá chất lượng
của thuốc nghiên cứu nhằm tìm bằng chứng tưcmg đương phục vụ cho xét cấp
phép lưu hành và khả năng thay thế cho các chế phẩm phát minh. [26],
1.2.2. Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học
Tổ chức y tế thế giới, hiệp hội các nước Đông Nam Á, và một số các nước
tiên tiến khác đã có tài liệu hướng dẫn, quy định chung cho việc đánh giá SKD và
TĐSH. Các tài liệu kỹ thuật cũng đã được ghi trong một số dược điển: Mỹ, Trung
Quốc , trong đó hướng dẫn về đánh giá SKD dạng thuốc TDKD nói chung và cả
những chế phẩm chứa natri diclofenac [26], [44].
Qui định về đánh giá SKD và TĐSH bao gồm những nội dung cơ bản sau:
Quy định về chế phẩm
Thuốc đối chứng: Thuốc đối chứng được chọn nên là thuốc gốc (innovator) hoặc
một chế phẩm có uy tín đang lưu hành trên thị trưòỉng. FDA quy định khi đánh
giá chế phẩm diclofenac TDKD, thuốc đối chứng là Voltaren(Geiby) dạng
TDKD. [44].
Thuốc thử (thuốc nghiên cứu}: Thuốc nghiên cứu phải được sản xuất từ lô nghiên
cứu sản xuất công nghiệp vói cỡ lô bằng khoảng 10% cỡ lô sẽ được thiết kế cho
sản xuất hoặc tối thiểu 100 000 viên [44],
Thiết kế nghiên cứu
Trong đánh giá TĐSH, để hạn chế sự ảnh hưcmg của yếu tố cá thể, người ta

thường áp dụng thiết kế nghiên cứu chéo. Thiết kế chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn (ô
vuông la tinh 2 X 2) áp dụng khi cần so sánh 1 thuốc thử vói 1 thuốc chứng; hoặc
chéo, 3 thuốc, 3 giai đoạn (3 X 3) khi cần so sánh 2 thuốc thử với 1 thuốc đối
chứng. Tuy nhiên, trong nghiên cứu thăm dò hoặc khảo sát SKD, có thể đánh giá
trên một vài cá thể riêng biệt tuỳ điều kiện thực nghiệm [3], [19], [46].
Đánh giá SKD và TĐSH có thể thực hiện theo mô hình thiết kế đơn liều hoặc
đa liều. Với diclofenac, dược điển Mỹ 27 {USP 27) hướng dẫn thử đơn liều, 2
hoặc 3 giai đoạn. Một số tác giả đã tiến hành nghiên cứu sâu hofn với thiết kế đa
liều [31].
Đối tượng thử (subjects)
Nghiên cứu SKD và TĐSH in vivo tốt nhất là được đánh giá trên người tình
nguyện. Vói các thuốc có độc tính cao, thuốc có nồng độ trong máu thấp hoặc
khi thăm dò trong quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm, đánh giá SKD in
vivo có thể được tiến hành trên động vật thí nghiệm. Vói các chế phẩm TDKD,
việc sử dụng động vật thí nghiệm còn có ý nghĩa thăm dò mức độ giải phóng
dược chất, đề phòng thuốc giải phóng ồ ạt gây nguy cơ ngộ độc [3].
Trong các loài động vật, chó được xem như là loài phù hợp hcín cả trong đánh
giá TĐSH các dạng thuốc uống vì đưòfng tiêu hoá của chó tưcmg đối giống của
người, nhất là dạ dày.[3], [46].
Hầu hết các tài liệu đều hướng dẫn đối tượng thử phải nhịn đói khoảng 10 giờ
trước khi uống thuốc[44], [46]. Tuy nhiên, với chế phẩm diclofenac, một số tác
giả [31] đã nghiên cứu và cho rằng bữa ăn nhẹ 15 phút trước khi uống thuốc có
thể làm giảm độ chệnh lệch pH trong đường tiêu hoá và thuốc giải phóng được
ổn định hơn, điều này đã được chứng tỏ trên thực nghiệm.
Thời điểm lấy mẫu
Thiết kế thòi điểm lấy mẫu có ý nghĩa quan trọng để thu được đường cong
SKD đáp ứng yêu cầu. Đường cong SKD phải thể hiện rõ pha hấp thu và pha thải
trừ. Trong đó, nên có ít nhất 3 điểm trước khi đạt đỉnh Cmax (pha hấp thu), 3 điểm
xung quanh đỉnh, trên 6 điểm sau khi đạt đỉnh (pha thải trừ). Tổng số điểm lấy
mẫu nên nhiều hơn 11 [26]. Thòi gian lấy mẫu phải kéo dài tới 3-5 lần thời gian

bán thải của thuốc hoặc khi nồng độ trong máu thấp hơn 1/ 10-1/20 đỉnh Qax-
Với chế phẩm natri diclofenac TDKD, USP 21 hưófng dẫn 20 điểm lấy máu sau
khi uống [44].
Thẩm định phương pháp phán tích trong dịch sinh học
Phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học là phương pháp đánh giá
SKD trực tiếp và chính xác nhất [3].
Mẫu sinh học thưcmg có chứa nhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ chất
phân tích thường rất thấp. Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải được
thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu. Đây là một trong những nội
dung rất quan trọng có tính quyết định độ chính xác của kết quả [25].
Nội dung và các phucfng pháp thẩm định được hưótìg dẫn trong các tài liệu về
phân tích và được qui định trong các Dược điển [26], [44].
- Tính chọn lọc- đặc hiệu (selectivity - specificity):
Tính chọn lọc, hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng
chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể là chất phân huỷ, tạp chất,
hoặc các thành phần cản trở khác. Do vậy, kết quả phải thể hiện so sánh trên sắc
đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng [25], [26].
- Xắy dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính (Linearity):
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ thuốc
trong dịch sinh học. Đường chuẩn nên được xây dựng từ 5 nồng độ trở lên và
phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ cần khảo sát. Các mẫu để xây dựng đường
chuẩn là chất chuẩn pha trong huyết tương trắng [26]. Đường chuẩn phải có độ
tuyến tính cao, một số tài liệu qui định giá trị R phải ít nhất lớn hơn 0,98.
- Độ đúng (Accuracy):
Độ đúng của phucfng pháp là sự sai khác giữa nồng độ định lượng được và
nồng độ thực của chất cần phân tích. Có nhiều phương pháp xác định độ đúng
nhưng hay được sử dụng nhất là phương pháp thêm chính xác một lượng chuẩn
vào mẫu thử và đánh giá khả năng tìm lại tương đối [25]. Giá trị này phải nằm
trong khoảng 85-115%, nhưng có thể là 80-120% đối với điểm gần giới hạn định
lượng.

- Độ chính xác ị Précision ):
Độ chính xác của phưotìg pháp là mức độ thống nhất giữa các kết quả
riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng
nhất.
Trong đánh giá IĐSH, độ chính xác của phương pháp được xác định bằng độ lặp
lại (repeatabỉlity) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác ngày).
Phương pháp xác định là thực hiện phân tích trên một mẫu thử đồng nhất n lần (n
> 5 ) cùng một lúc và trong một thời điểm khác ngày [26]. Xác định độ lệch
chuẩn tương đối (RSD) giữa các lần thử. Nói chung, RSD không nên vượt quá
15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%.
- Giới hạn định lượng (Limit of Quantification - LOQ):
Giôfi hạn định lượng là nồng độ thấp nhất cho đáp ứng peak lớn hơn hoặc bằng 5
lần so với đáp ứng peak ở mẫu trắng (nếu có). Tại nồng độ đó, độ đúng và độ
chính xác phải đáp ứng qui đinh.
- Độ ổn định (Stability of the samples):
Quá trình phân tích đánh giá SKD và TĐSH thưòỉng kéo dài vì số lượng
mẫu lớn. Do vậy, các tài liệu đều hưófng dẫn nghiên cứu độ ổn định của chất cần
phân tích trong mẫu sinh học. Độ ổn định được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo
quản ỏ điều kiện lạnh (thưòíig ở -20‘’C đến - 80"C). Mẫu phân tích phải đảm bảo
ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử.
Trong hưófng dẫn đánh giá TĐSH in vivo cho chế phẩm natri diclofenac
TDKD, USP 27 cũng qui định phương pháp định lượng phải thoả mãn các tiêu
chí thẩm định như trên.
Các phương pháp định lượng natri diclofenac trong dịch sinh học:
Trước khi tiến hành định lượng phải chiết xuất được natri diclofenac từ
huyết tương. Có 2 phương pháp chiết hay được sử dụng là; phương pháp loại tạp
protein (tủa protein bằng dung môi hoặc acid), hoặc chiết xuất chất cần phân tích
bằng dung môi hữu cơ. Tùy vào tính chất của mỗi loại chất cần phân tích mà tìm
điều kiện chiết xuất tối ưu nhất.
Để phân tích natri diclofenac trong dịch sinh học, Tác giả Lê Hậu và các cộng sự

[11] đã dùng phuofng pháp kết tủa tạp protein với acid. Phuofng pháp này cũng
được một số tác giả khác sử dụng [34],[28],[29].
Mẫu dịch sinh học trong đánh giá SKD thường có nồng độ rất thấp, do đó, cần
thiết phải áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại và thiết bị có độ nhạy cao.
Một số phuofng pháp định lượng hay được sử dụng nhất là các phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc khí lỏng và sắc ký khí khối
phổ (GC-MS, LC-MS) trong đó HPLC được dùng phổ biến hơn cả. Một số điều
kiện HPLC dùng để định lượng diclofenac trong huyết tương được trình bày
trong bảng 1.2 sau.
Bảng 1.2: Một số điều kiện phân tích diclofenac trong huyết tương bằng HPLC
TLTK Cột sắc ký
Pha động
Thòi gian
lưu (phút)
34
250 X 5mm 5^m C18
(Machery & Nagel)
Meơí;nước:acid acetic (50:50:0,1)
'
34 250 X 4,6 5|a.m
Supelcosil LC-8
MeCN: dung dịch acid acetic pH
3,3 (50:50)
6
34 250 X 4,6mm 5|xm
Nucleosil C18
MeCN: nước (35:65) thêm natri
laurylsulfate ImM và NaH2PƠ4
lOmM, chỉnh pH 2,8
10,6

36
150 X 3,9mm 4|im
Novapak C- 18
MeCN:amoniacetat (40:60)
0,025M
-
33
125 X 4mm 5ịim
Lichrocart RP18
MeCN: dung dich acid acetic pH
3,5 (40:60)
16,21
22
150x4.6mm 4^im
Novapak C18
Natii acetate 0.004M -MeCN- acid
acetic băng (46:51:3)
""
10
Intersil 0DS-3-GL
C18
Methanol-đêm phosphat pH 2,5
(75:25)
28
150x3,9mmC18U-
Bondapak
MeCN: dung dịch acid acetic pH 3
(50:50)
6
31

150x3,9mm C18
Nucleosil
MeCN: KH2PO4 0,0 IM pH6,3
(35:65)
-
29
300x3,9mm C18
ụBondapack
MeCN:0,03%acid phosphoric
pH3,5 (45:55)
""
1.2.3. Một số nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng dạng tác dụng kéo
dài của natri diclofenac
Meena Rani và cs [36] đã nghiên cứu so sánh in vitro và SKD in vivo của
các dạng bào chế có chứa natri diclofenac có cốt là polyme, dạng viên bao màng
thẩm thấu và hệ bofm thẩm thấu. Nghiên cứu dùng 2 chế phẩm đối chứng là
Voltaren SR lOOmg và Voltaren dạng quy ước để so sánh. SKD in vivo được thiết
kế thử chéo trên 6 người tình nguyện khoẻ mạnh, lấy mẫu máu tại 8 thời điểm
trong 24h sau khi uống thuốc. Kết quả cho thấy các dạng bào chế có màng thẩm
thấu, và bơm thẩm thấu có khả năng duy trì nồng độ trong máu lâu hơn thể hiện
trên: giá trị nhỏ hơn và kéo dài hơn (Cn,ax~0,34|ig/ml, T„,a^~6h) so với
viên đối chiếu (Cn,ax~0,5|ig/ml, T m a x ~ 4h). Điều đó chứng tỏ viên có TDKD rõ rệt.
Các tác giả [31] đã tiến hành đánh giá SKD tương đối in vivo của viên Clofen
(dạng cốt HPMC) so vói Voltaren SR lOOmg trên 12 ngưòi tình nguyện, số lượng
người tình nguyện trong nghiên cứu này ít hofn so với quy định của dược điển
Trung Quốc {CP 2000): 18-24 người, của USP 27: ít nhất là 24 người. Người tình
nguyện không được sử dụng thuốc trong 14 ngày được ăn nhẹ 15 phút trước khi
uống thuốc. Nghiên cứu được thiết kế khá phức tạp: thử chéo 2 giai đoạn kết hợp
đơn liều vói đa liều, thòi gian giữa 2 giai đoạn là 1 tuần thời gian này phù hợp với
những yêu cầu của CP 2000 và USP 27. Kết quả cho thấy giá trị AUC của 2 chế

phẩm là tương đương nhau. Tuy nhiên, mức độ dao động nồng độ thuốc ( C m a x và
c„,in) của Clofen ỏ nghiên cứu đa liều nhỏ hơn so với của viên Voltaren. Như vậy,
kết quả đánh giá tương quan in vitro đã dự báo được mức độ hấp thu nhưng chưa
đủ để khẳng định về tốc độ hấp thu. Điều đó rất phù hợp với những qui định của
dược điển, vói các dạng thuốc TDKD luôn phải thực hiện đánh giá TĐSH in vivo;
kết quả in vitro chỉ có giá trị thăm dò hoặc để xây dựng tiêu chuẩn độ hoà tan khi
qui trình sản xuất đã ổn định.
Một công trình nghiên cứu viên nén natri diclofenac từ vi hạt chứa polycarbophyl
hàm lượng 50mg đã thử trên động vật thí nghiệm là chó để đánh giá SKD in vivo.
Chó từ 7-10 kg, số lượng 6 con đực loại chó chăn cừu, nhịn đói lOh trước khi
uống thuốc nhưng vẫn được uống nước tự do. Sau khi uống thuốc tiến hành lấy
4ml máu tại 9 thời điểm: 0,5h Ih l,5h 2h 2,5h 3h 4h 5h 6h, ít hofn quy định của
US? 27 và CP 2000 (nhiều hơn 11 điểm). Máu được lấy bằng cách đặt cannule ở
tĩnh mạch chân chó, được ly tâm để tách lấy huyết tưomg, bảo quản ỏ -20"C cho
đến khi định lượng. Phưomg pháp định lượng sử dụng chuẩn nội là acid
flufenamic 500ng. Nghiên cứu được thiết kế chéo và thời gian giữa 2 giai đoạn
thử là 2 tuần. Các kết quả về thông số dược động học trên chó có sự khác biệt so
với thử trên người do trọng lượng cơ thể của chó ít hcfn người 7- 10 lần. Giá trị
Cmax ~ 8^g/ml, ~ 3h, AUC ~25^g.h/ml [28]. Do việc đánh giá TĐSH là thực
hiện phép so sánh cả 2 chế phẩm trên cùng đối tượng, nên những kết quả nghiên
cứu trên động vật cũng rất có ý nghĩa.
Khi nghiên cứu bào chế diclofenac TDKD dạng cốt nhựa trao đổi ion có bao
hoặc không bao màng nylon, các tác giả [29] cũng đã thực hiện đánh giá so sánh
in vivo trên thỏ để xác định ảnh hưởng của yếu tố màng bao lên SKD của thuốc.
Thỏ được cho nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, thiết kế với 9 điểm lấy máu,
mỗi điểm lấy Iml máu tại ven tai thỏ. Mẫu phân tích được tạo tủa protein bằng
acid percloric 30%, sau đó hoà tan trong MeCN lắc 2 phút và ly tâm 5 phút để
loại tủa, tiến hành định lượng bằng phưoỉng pháp HPLC. Kết quả cho thấy không
có sự khác nhau về QaxVà AUCo_24h nhưng Tmax của chế phẩm có hạt bao chậm
hơn so với loại không bao. Như vậy, mặc dù thỏ là một loài không thích hợp lắm

trong đánh giá SKD (do hệ tiêu hoá của thỏ khác xa của ngưòi), nhưng vẫn được
sử dụng khi cần nghiên cứu thăm dò một yếu tố nào đó.
ở trong nước, đã có nhiều đề tài nghiên cứu về các dạng thuốc TDKD của natri
diclofenac, nhưng nghiên cứu về SKD và TĐSH của các chế phẩm diclofenac thì
còn rất hạn chế. Chúng tôi chưa tìm được nghiên cứu nào về đánh giá SKD in
vivo dạng viên nén diclofenac TDKD lOOmg, mới chỉ có một nghiên cứu đánh
giá SKD in vivo của dạng viên nang chứa pellet natri diclofenac TDKD.
Nhóm tác giả Lê Hậu, Lê Quan Nghiệm và cs [10],[11] đã nghiên cứu mối
tưcmg quan giữa độ phóng thích dược chất và tốc độ hấp thu in vivo của viên
nang diclofenac TDKD, xác định SKD in vivo và đánh giá TĐSH trên người tình
nguyện. Thử SKD in vivo được tiến hành thiết kế chéo 2 giai đoạn đơn liều trên
14 ngưòi tình nguyện chia làm 2 nhóm. Mẫu máu được lấy tại 12 thòfi điểm trong
vòng 24 giờ sau khi uống thuốc. Tách huyết tương bằng cách ly tâm 3000
vòng/phút trong 10 phút, bảo quản mẫu
ở -20°c. Diclofenac được chiết bằng
phương pháp tạo tủa protein bằng MeCN. Phương pháp định lượng được thẩm
định trên 6 chỉ tiêu; độ đúng, độ chính xác, hàm đáp ứng, độ đặc hiệu, giới hạn
định lượng, và hiệu suất chiết. So với quy định của một số tài liệu [26],[44],[46]
thiếu một chỉ tiêu về độ ổn định của mẫu huyết tương trong điều kiện bảo quản.
Theo chúng tôi chỉ tiêu này khá quan trọng do đặc thù định lượng mẫu huyết
tương phải kéo dài vài ngày thậm chí đến 1 tháng, do đó việc đánh giá độ ổn định
của mẫu trong điều kiện bảo quản là cần thiết. Các tác giả đã xây dựng đường
chuẩn natri diclofenac trong huyết tương với 9 điểm nồng độ từ 0,04|ig/ml -
2ịig/ml. Độ chính xác và độ đúng được đánh giá ở 3 nồng độ (nồng độ thấp,
nồng độ giữa và nồng độ trung gian) mỗi nồng độ 5 mẫu, kết quả thu được khẳng
định phương pháp có độ tin cậy cao. Kết quả đánh giá SKD in vivo cho thấy chế
phẩm thử đạt SKD tương đối bằng ~96 %, viên nang diclofenac TDKD được kết
luận là TĐSH vói chế phẩm Voltaren S.R lOOmg. Các tác giả cũng đã xác định
được có tương quan ỏ mức A (1:1) giữa SKD in vitro và in vivo, tác giả cho rằng
như vậy có thể sử dụng phương pháp thử tốc độ phóng thích dược chất là phù hợp

và có thể dùng để xây dựng chỉ tiêu tốc độ phóng thích dược chất.
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN cữu
2.1.1. Nguyên liệu
Bảng 2.1; Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu
Nguyên Mệá
Nguồn gốc
Tiêu cliiiẩii
Natri diclofenac
Trung Quốc
Dược điển Việt Nam m
Natri diclofenac chất đối chiếu
VKN - Bộ Y Tế ƯSP26
Gôm xanthan
Mỹ
USP22
Lactose
Pháp
British Pharmacopoeia 98
Talc; magnesi stearat
Trung Quốc
Dược điển Việt Nam III
Ethanol tuyệt đối
Việt Nam
Dược dụng
Acetonitril, methanol, acid
phosphoric 85%, cloroform,
acid acetic, natri acetat
Prolabo - Đức
Dùng cho HPLC

2.1.2. Chế phẩm đối chiếu
- Viên đối chiếu: Viên nén giải phóng kéo dài Voltaren® L.p lOOmg của công ty
Novatis Canada; SKS : TD 410, hạn dùng: tháng 12 năm 2006
2.1.3. Thiết bị
♦ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Thermofinigan - spectra system
o Cột sắc ký; Nucleosil C18 (250 X 4,6mm) 5|^m Alltech
o Detector u v 6000LP.
♦ Máy ly tâm Hermk Z200A (Đức);
♦ Máy lắc xoáy Velp scientifica
♦ Máy đo pH: Mettler Toledo MP220, (Đức)
♦ Máy siêu âm Ultrasonic (Đức);
♦ Tủ siêu lạnh Frigos (Đan mạch):
♦ Hệ thống thử độ hoà tan Valken - Varian (Mỹ).
♦ Máy dập viên Korsch, (Đức)
♦ Máy đo độ cứng ERWEKA,
♦ Máy đo độ mài mòn Pharma test, (Đức)
♦ Máy sấy, máy nhào, máy trộn bột khô ERWEKA.
♦ Cân phân tích: Sartorius
♦ Micropipet và các dụng cụ thuỷ tinh.
2.1.4. Động vật thí nghiệm
' Động vật thí nghiệm được lựa chọn là chó ta khoẻ mạnh giống đực, cân
nặng 10-12kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm với chế độ ăn uống
đầy đủ và được kiểm soát. Chó được để nhịn đói lOh trước khi tiến hành thí
nghiệm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.2.1. Phương pháp bào chế viên nén Diclofenac-KD
Lê Thị Thu Huyền và cộng sự [17] đã nghiên cứu xây dựng công thức bào
chế viên nén Diclofenac-KD sử dụng tá dược là gôm xanthan. ở quy mô phòng
thí nghiệm 6000 viên; viên nén đạt các chỉ tiêu chất lượng đề ra.
Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu phát triển bào chế viên nén Diclofenac-KD

trên quy mô pilot vói công thức như sau:
Natri diclofenac lOOmg
Gôm xanthan 45,6mg
Lactose ll,2mg
Ethanol 70% vđ
- Tiến hành bào chế 3 mẻ, mỗi mẻ 10000 viên.
- Bào chế viên nén theo phương pháp xát hạt ưót, sơ đồ X 1
2.2.2. Đánh giá tiêu chuẩn chất lượng viên nén DicIofenac-KD
Xác định độ cứng của viên
Thiết bị đo: Máy đo độ cứng của viên nén ERWEKA-TBH200
Đo lực gây vỡ viên của 20 viên, lấy giá tn trung bình và độ lệch chuẩn.
Hình 2.1 : Sơ đồ bào chế viên nén Diclofenac-KD

Xác định độ đồng đều khối lượng
Tiến hành theo DĐVN
ni.
Thử với 20 viên, không được quá 2 viên có độ
lệch vượt quá giói hạn cho phép, không có viên nào gấp đôi giới hạn đó.
Xác định độ mài mòn
- Thiết bị đo : Máy đo độ mài mòn của viên, Pharma-test.