Nghiên cứu định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp HPLC

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
NGUYỄN THỊ HANH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN
TRONG CHẾ PHẨM RẮN PHÂN LIÈU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 2002- 2
/>' \ ' '
f ị' »■ \ —
ỉ ĩ \
% t Ằ
V:v -< M .i
Người hướng dẫn : TS Đoàn Cao Sơn
TS Nguyễn Hải Nam
Nơi thực hiện : Khoa KN các dạng bào chế - VKN
Thời gian thực hiện : 9/2006 đến 5/2007
Hà nội, tháng 5/2007
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại khoa kiểm nghiệm các
dạng bào chế - Viện kiểm nghiệm thuốc TW và bộ môn Hóa Dược trường Đại
học Dược Hà Nội. Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các thầy hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn
Hóa dược và các cán bộ khoa KNCDBC - Viện KNTTW.
Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc tớ i:
- Tiến sĩ Đoàn Cao Sơn -Trưởng Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế
Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế.
- Tiến sĩ Nguyễn Hải Nam - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược
Hà nội.
- Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Thảo - Cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng
bào chế-Viện KNTTW.

Là những người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt chỉ bảo tôi những ý kiến
quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô các kĩ thuật viên bộ
môn Hóa Dược, các cán bộ khoa KNCDBC - Viện KNTTW đã tạo điều kiện tốt
• 7 • • • •
nhất để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban Giám hiệu, phòng đào tạo
và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thòi gian ngồi trên ghế
nhà trường.
Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn sát cánh bên
tôi động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Nguyễn Thị Hạnh
A1K57
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CETIRIZIN 3
1.1.1. Công thức cấu tạo 3
1.1.2. Tính chất 3
1.1.3. Tác dụng dược lỷ 4
1.1.4. Tác dụng không mong muốn 4
1.1.5. Chỉ định

4
1.1.6. Một sổ chế phẩm 5
1.1.7. Các phương pháp định lượng
.
5
1.2. T ỔNG QUAN VÈ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 6

1.2.1. Khái niệm sắc kỷ và sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC)

.
6
1.2.2. Nguyên tắc của quả trình sắc kỷ

7
1.2.3. Cơ sở lý thưyết sắc kỷ
.
8
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
.
9
1.2.5. Các thông sổ đặc trưng của quá trình sắc kỷ và các yếu tố ảnh hưởng 10
1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc kỷ

.

.

14
1.2.7. ứng dụng của HPLC
.

18
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN
NGHIÊN CỨU 21
2.1. Đ ỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u
21
2.2. PHƯƠNG TIỆN, DỤNG cụ , HÓA CHẤT

21
2.2.1. Hóa chất

.
.

.

21
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 22
2.3. NỘI DUNG 22
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23
2.4.1. Các thông sổ thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu

23
2.4.2. Cách đánh giá kết quả
23
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ
.

25
3.1. XÂY DựNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐÊ ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN
TRONG CHẾ PHẨM 25
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn sắc kỷ
25
3.1.2. Khảo sát tỉnh thích hợp của hệ thống sắc kỷ 30
3.1.3. Khảo sát độ tuyến tỉnh của phương pháp 31
3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
.

33
3.1.5. Khảo sát độ đủng của phương pháp: 36
3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM 40
3.3. BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ
42
KÉT LUẬN 44
Chú giải chữ viết tắt
HPLC : High Performance liquid chromatography
ACN : Acetonitril
MeOH : Methanol
mg : miptgam
ml : mipilit
|J,1 : microlit
|im : micromet
g : gam
KNCDBC : Kiểm nghiệm các dạng bào chế
KNTTW : Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
ĐẶT VẤN ĐÈ
Dị ứng là tình trạng tổn thương và rối loạn bệnh lý điển hình thể hiện
phản ứng miễn dịch của cơ thể với các dị nguyên. Nhưng con người sống trong
môi trường và luôn phải chịu tác động yếu tố ngoại cảnh vì vậy dị ứng rất dễ xảy
ra, có thể xảy ra với mọi đối tượng khác nhau. Để điều trị các rối loạn trên một
nhóm thuốc kháng histamin ra đời với tác dụng kháng histamin trên thụ thể Hi.
Nhưng các thuốc trước đây khi sử dụng luôn gây khó khăn cho con người trong
công việc và sinh hoạt do tác dụng phụ gây buồn ngủ, cùng việc sử dụng liều
nhiều lần trong ngày. Kháng histamin thế hệ 2 ra đời là một giải pháp hữu hiệu
khắc phục nhược điểm trên nên kháng histamin thế hệ 2 nhanh chóng được sử
dụng rộng rãi và phổ biến trong đó điển hình có cetirizin [1,8].
Cetirizin là kháng histamin có tác dụng mạnh, kéo dài, chọn lọc trên thụ

thể Hi- Hiện nay trên thị trường dược phẩm trong nước và nước ngoài có hàng
ngàn chế phẩm cetirizin được sản xuất. Chính vì vậy việc đảm bảo chất lượng
cho rất nhiều chế phẩm của một thuốc như vậy là vấn đề đáng được quan tâm.
Các dược điển European 4th, BP 2005 [9, 10] mới chỉ có chuyên luận kiểm tra
cetirizin dạng nguyên liệu mà chưa có chuyên luận kiểm tra chất lượng các dạng
chế phẩm của cetirizin. Vì vậy xây dựng một phương pháp định lượng có thể
dùng cho cả dạng nguyên liệu và viên nén một cách chính thống là hết sức cần
thiết.
Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, với sự phát triển vượt bậc của khoa
học kĩ thuật, đã có nhiều thành tựu mới được đưa vào ứng dụng đem lại cho
chúng ta những phương pháp kiểm nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao. Một
trong những phương pháp đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương
pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng có kết quả
nhiều hoạt chất trong đa dạng các loại chế phẩm.
1
Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu định
lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ thể sau:
- Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng cetirizin
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành Dược một phương
pháp kiểm nghiệm cetirizin có tính đăc hiệu, độ chính xác cao, độ đúng cao.
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng nhanh và chính xác
một số chế phẩm rắn phân liều có chứa cetirizin đang lưu hành trên thị trường
Việt Nam.
2
PHẦN 1. TÒNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VÈ CETIRIZIN [ 8, 13, 14, 15]
1.1.1. Công thức cấu tạo
_ , Mô phỏng cấu tạo của cetirizin
Công thức cấu tạo cetirizin.

Công thức phân tử : C18H25CIN2O3
Khối lượng phân tử: 461,82
Tên khoa học: acid (RS)-2-[2[4[(4-Clorophenyl)phenylmethyl]piperazin-
1-yl] ethoxy]acetic.
1.1.2. Tính chất
Cetirizin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, pKai = 2,9 tương
ứng pKa cuả nhóm cacboxylic, pKa2 = 8,3 tương ứng pKa nhóm amin bậc 3.
Tan tốt trong nước, đặc biệt là trong aceton và methylen clorid.
Trong phân tử cetirizin có dây nối liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh
sáng tử ngoại. Phổ hấp thụ của dung dịch 20 Ịig/ml trong dung dịch acid
hydrochloric R (10,3 g/1) trong giới hạn quét phổ từ 210 nm đến 350 nm có cực
3
đại hấp thụ tại 230 nm với độ hấp thụ riêng 359-381 [9,10].
1.1.3. Tác dụng dược lý
- Tác dụng dược lực học:
Cetirizin là chất thuộc nhóm dẫn chất của piperazin, là chất chuyển hoá
của hydroxyzin (oxy hoá nhóm chức -OH alcol thành -COOH) có tác dụng đối
kháng histamin mạnh, kéo dài và đặc biệt chọn lọc trên thụ thể Hj. Cetirzin có
tác dụng an thần, gây ngủ và kháng cholinergic đều rất yếu, không kháng
serotonin. Cetirizin ức chế giai đoạn sớm của phản ứng dị ứng qua trung gian
histamin và cũng làm giảm sự di dời của các tế bào viêm. Giảm giải phóng các
chất trung gian ở giai đoạn muộn của phản ứng dị ứng. Chất này có tác dụng bảo
vệ dưỡng bào, giảm đáng kể đáp ứng hen suyễn với histamin.
- Tác dụng dược động học:
Cetirizin sau khi uống hấp thu rất nhanh, nồng độ thuốc trong huyết tương
đạt được sau 30 phút đến 60 phút. Trên nghiên cứu những người tình nguyện với
10 mg cetirizin mỗi ngày, uống trong 10 ngày nồng độ đỉnh huyết tương đạt 311
ng /ml, nửa đời huyết tương xấp xỉ 11 giờ, liên kết với protein mạnh 93 %.
Thời gian bán huỷ trung bình khoảng 8,3 giờ.
Thuốc chịu ảnh hưởng chuyển hoá của hệ enzym cytochrom 3A4P. Thuốc

được đào thải chủ yếu qua thận khoảng 70 %, qua gan khoảng 10 %.
1.1.4. Tác dụng không mong muốn
- Tác dụng không mong muốn xảy ra nhiều nhất là hiện tượng ngủ gà
phụ thuộc vào liều sử dụng.
- Ngoài ra thuốc có thể gây mệt mỏi, khô miệng viêm họng, chóng mặt,
buồn nôn, nhức đầu.
1.1.5. Chỉ định
- Cetirizin được chỉ định trong viêm mũi dị ứng dai dẳng, viêm mũi dị
4
ứng theo mùa.
- Mày đay mạn tính vô căn ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi. Cetirizin
chỉ định điều trị các dạng ngứa, ngứa kết hợp với tổn thương da.
Theo nghiên cứu mới nhất của trường đại học ở Mỹ cetirizin có tác dụng
làm giảm các tổn thương da ở những người điều trị prednisolon.
1.1.6. Một số chế phẩm
Hiện nay chế phẩm citirizine tương đối nhiều, có thể ở dạng đơn thành
phần:
- ZYRTEC viên nén 10 mg
- ZYRTEC dung dịch uống 1 mg/lml lọ 75 ml
- ZYRTEC dung dịch uống 10 mg/ml lọ 10 ml
V - Chế phẩm của hãng UCB PHARM
- CETINAX viên nén 10 mg -V
( - Chế phẩm của MEDOPHARM -TENAMYD CANADA
- HICET viên nén 10 mg bao phim ^
- Chế phẩm của công ty MICRO LABS LIMITED
- CEZIL viên nén 10 mg bao phim A
- Chế phẩm của công ty ALKEM LABS. ^
Ngoài ra cetirizin thường được kê đon với pseudoephedrin nên có ché
phẩm kết hợp với pseudoephedrin
- ZYRTEC-D, VILIX-D chế phẩm của ƯCB PHARM.

1.1.7. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12]
Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng đã được
đưa ra như sau:
* Phương pháp chuẩn độ acid - base [9, 10]
Cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 0,lg cetirizin hoà tan
5
trong 100 ml dung dịch gồm 30 thể tích nước và 70 thể tích aceton. Chất chuẩn
độ dùng là dung dịch NaOH 0,1 M. (ti/ íL ^
lml NaOH 0,1M tương ứng với 15,39mg C21H27CI3N2O3
* Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [7, 11, 12]
- Phương pháp 1 [7] :
+ Cột C18 (phenomenex) ^ • i
+ Pha động;dung dịch đệm phosphat 0,0IM (l,36g KH2PO4 trong
1000ml H2O): acetonitril tỉ lệ 70:45
+ Detector u v 230nm
+ Tốc độ dòng: l,5ml/phút
+ Thể tích tiêm 10|il, nồng độ định lượng 20|ig/ml
- Phương pháp 2 [12]:
+ Cột C18 (Nova - Pak, 300 X 4,6mm)
+ Pha động dung dịch đệm phosphat 0,067M pH=3,4: acetonitril
(l:l;v/v)
+ Detector u v 227 nm
- Phương pháp 3 [11]:
+ CộtCi8(250x4,6mm; 5|im)
+ Pha động Acid orthophosphoric, pH 3,0 : acetonitril (60 : 40 )
+ Tốc độ l,0ml/phút
+ Detector u v 232 nm.
1.2. TỔNG QUAN VÈ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) [3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20]
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

a. Khái niêm về sắc ký
Sắc ký là một nhóm phương pháp hoá lý dùng để tách và phân tích các
6
cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào việc sử dụng các quá trình sắc kí
khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào
sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha là pha động và pha
tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ nền chất rắn. Chất rắn được
nhồi vào trong cột hay tráng trên bản mỏng thành film. Pha động là khí hay chất
lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [3].
b. Khái niêm về sắc kí lỏng hiêu năng cao
Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một
phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha
luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được
đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp. Pha tĩnh chứa trong
cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá
học với các nhóm hữu cơ. sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học trên bề mặt [3].
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là
yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:
Nếu pha tĩnh có bản chất hấp phụ (silicagel, nhôm oxy hoặc polyme thuần
tuý) thì ta có sắc ký hấp phụ.
Nếu pha tĩnh bản chất là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc
đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ ta có sắc ký phân bố.
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion.
Nếu pha tĩnh là các gel, ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử).
Khi đặt chất phân tích lên đầu cột ta cho pha động chạy liên tục cột ta đã
thực hiện quá trình sắc ký.
Ví dụ, nếu ta nạp một hỗn hợp ba chất A, B, c vào cột tách thì khi bơm

7
pha động qua cột tách các quá trình sắc ký xảy ra. Khi đó A, B, c tách ra khỏi
nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là
tổng hợp của các tương tác:
Tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh Fi: là lực giữ chất phân tích
trên cột.
Tương tác giữa chất phân tích và pha động F2: là lực kéo chất phân tích ra
khỏi cột.
Tương tác giữa pha tĩnh và pha động F3.
Theo sơ đồ sau:
Trong đó Fi, F2 đóng vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn
[6].
1.2.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký
Quá trình phân tách trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là do
quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau. Khi pha
động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ
trong cột ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá
trình rửa giải tách đuợc các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được
phát hiện và ghi lại dưới dạng pic. Tín hiệu của quá trình sắc ký cho chúng ta
8
sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay
nhiều thành phần.
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
a. Hê thống bơm
Bom được xem là một trong các thành phần quan trọng nhất của hệ thống
sắc ký. Bơm có tác dụng đẩy dung dịch pha động qua cột với một tốc độ hằng
định.
Có hai loại bơm
- Một loại bơm đẳng dòng (Isocratic pump)
- Hai là loại bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump)

b. Bình chứa dung môi và hê thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường được làm bằng thuỷ tinh, đôi khi là thép
không gỉ. Cần lọc các hạt trong dung môi (thường dùng các màng lọc cỡ lỗ 0,45
ịim) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí).
Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương
pháp gradient có thể cần đến 2, 3, 4 bình chứa dung môi.
C. Hê tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể dùng bơm tiêm để tiêm vào đầu cột. Phương
pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích
xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác
nhau. Một số máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều
khiển thể tích tiêm (microsyringe), số lần tiêm và chu kì rửa vòng chứa mẫu.
d. Côt sẳc ký lỏng hiêu năng cao
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của
•«
hệ thống sắc ký vì ở đây xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột có ảnh hưởng
lớn tới khả năng tách các chất cần phân tách. Cột được ché tạo bằng thép đặc
biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha
9
tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều kích cỡ khác nhau, tuỳ mức độ và mục đích của
quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thường dài 10-30 cm có đường kính 4-
10 mm, hạt nhồi cột cõ 5-10 ịim. Với chất nhồi cột cỡ 3-5 |im có thể dùng các
cột ngắn (3 - 7,5 cm) và nhỏ (đường kính trong 1 - 4,6 mm), cột này có hiệu lực
rất cao.
e. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký
liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các hợp chất của chúng dựa theo một
tính chất nào đó của chất cần phân tích. Các loại detector phổ biến :
- Detector UV-VIS (Utraviolet/Visible Spectrophotometric Detertor)
- Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)

- Detector khối phổ (Mass spectrometric Detector)
- Detector điện hoá (Electrochemical Detector)
- Detector tán xạ bay hơi (Evapotive Light Scattering Detector)
- Detector đo độ dẫn điện (Electrical Conductivity Detector)
- Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector)
- Detector chuỗi Diod (Diod Array Detector) ■
£ Bô phân ghi tín hiêư: Recorder
g. Bô điều khiển: Computer
1.2.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng
a. Thời gian lưu tp và thể tích lưu Vr
Thời gian lưu tR (phút) là thòi gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc
xuất hiện pic).
Nếu tR là thời gian lưu giữ của một chất thì
Ír ~Ír~ 10
10
Trong đó:
- tR’ là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực)
- to là thời gian chết (thời gian chất không bị lưu giữ nghĩa là tốc độ di
chuyển của chất bằng tốc độ di chuyển của dung môi).
Khi pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ không đổi thì thời gian
lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu, Vr là thể tích dung môi đi qua cột cần để di
chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
K =tRXFc
Trong đó:
- Vr phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất của pha động, Fc là thể
tích pha động trong một đơn vị thời gian.
- tR và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai
đại lượng phụ thuộc tốc độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ
b. Hê số phân bổ K

Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha động
và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân
bố tính theo công thức:
Trong đó, c s và c m là nồng độ chất tan phân bố ở pha tĩnh và pha động
tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình
của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển nó qua cột. K chỉ phụ thuộc vào:
bản chất của chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
- Nếu K lớn thì tR lớn (pic ra muộn)
- Nếu K nhỏ thì tR nhỏ (pic ra sớm)
C. Thừa số dung lương K’
K’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng
11
với sức chứa của cột, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng
chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng
Trong đó
- tR là thời gian lưu, to là thời gian chết.
- K’ phụ thuộc bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm
cột, thể tích pha động và pha tĩnh.
- K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao
cho: 1 < K ’ < 8
- NếuK’ < 1 thời gian phân tích ngắn pic ra sớm dễ lẫn với tạp
- Nếu K’ > 8 thì thì gian phân tích sẽ quá dài, tốn dung môi
d. Tốc đô di chuvến tỷ đối của hai chất
Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor)
f y = ^Ề- = ỈM.
KÃ tZ
Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0. Nếu a càng lớn thì hai
chất tách nhau càng tốt, a nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời
gian phân tích sẽ quá dài.

e. Đô phân giải
Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
~Ír,À) _ ~ Ír,a )
WA+ WB~ WmB+ WV2A
Như vậy Rs phụ thuộc vào:
- Hiệu lực cột
- Thừa số chọn lọc a
12
- Thừa số dung lượng K’b
- Rstối ưu >1,5
Có thể làm tăng Rs bằng cách:
- Tăng N: Tăng chiều dài cột giảm tốc độ dòng.
- Tăng K’b: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn
- Tăng a: Thay đổi pha động hay pha tĩnh làm Rs thay đổi lớn.
£ Hê số bất đối AF
w
AF = ỵiML
2d
Trong đó:
- W0.05 là độ rộng đáy píc đo ở 1/20 chiều cao của pic
- d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu AF = 0,9 -2,0.
Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên
kết quả tính theo diện tích pic sẽ càng chính xác hơn.
Các yếu tố ảnh hưởng:
- pH quyết định dạng tồn tại của chất tan nên từ đó ảnh hưởng đến AF
- Cột tốt thì AF sẽ tốt
- Thể tích tiêm
Cải thiện AF

- Chọn cột phù hợp
- Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở dạng thích hợp.
- Thể tích tiêm thích hợp.
g. Số đĩa lý thuyết N
số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột.
Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và w (độ rộng pic)
Nếu tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài.
w (độ rộng pic ở đáy) hay W1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng nhỏ
thì N càng lớn nhưng w và W1/2 sẽ nhỏ hơn khi tR nhỏ.
Khi tR cố định thì bản chất của cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định
trong đó cột đóng vai trò quan trọng.
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị độ
dài cột:
Khi các điều kiện khác cố định thì cột nào có số đĩa lý thuyết cao hơn cột
đó sẽ có hiệu lực cao hon.
h. Xác đinh tỷ số giữa tín hiêu và nhiễu
T ỷ số tín hiêu = —
K
Trong đó
- H là chiều cao pic thành phần cần quan tâm trong sắc ký đồ từ dung
dịch đối chiếu quy định (pic C).
- hn là giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi đường nền
trong khoảng sắc đồ thu được sau khi tiêm dung dịch mẫu trắng.
Khoảng sắc đồ cần quan sát có độ dài bằng 20 lần độ rộng đáy ở chiều
cao của pic c và ở điểm giữa của nó là vị trí tương đương với vị trí của pic c (vị
trí của pic thành phần cần quan tâm).
1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
a. Lưa chon côt (pha tĩnh)
Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn
14

hợp chất phân tích. Đó là các chất rắn, xốp kích thước hạt rất nhỏ đường kính
hạt từ 3-10 Jj.m, diện tích bề mặt thường từ 50-500 m2/g. Trong phương pháp
định lượng cetirizin sử dụng sắc ký phân bố nên dưới đây chỉ tập trung vào lựa
chọn pha tĩnh cho sắc ký phân bố. Theo tài liệu mới sắc ký phân bố được chia
làm ba loại sau [16, 21]:
- Sắc ký phân bố pha thuận (Normal phase -HPLC)
- Sắc lý phân bố pha đảo (Reverse phase -HPLC)
- Sắc ký pha thuận có sử dụng nước (Aqueous Normal phase)
Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ
lẽn bề măt của pha tĩnh. °
Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực hơn (ví dụ silicagel) còn
pha động không phân cực hexan, heptan, tetrafuran có thể trộn lẫn một lượng
nhỏ các dung môi hữu cơ phân cực như isopropanol, ethylacetat, hoặc
chloroform. Thời gian lưu của chất phân tích tăng khi độ không phân cực của
pha động tăng, chất phân tích là các chất phân cực.
Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực (hydrophobic) còn pha
động phân cực như H20 hoặc là sự pha trộn của H2O, methanol hoặc acetonitrile
Trong sắc ký pha thuận có sử dụng nước đó có thể nói đó là phương pháp
có sự kết hợp của cả pha thuận và pha đảo. Cột sử dụng trong loại sắc ký này là
cột pha thuận trên bề mặt Si -H, pha động thường sử dụng là acetonitril hoặc
methanol và một lượng nhỏ H2O, pha động này có sự hiện diện cả H2O và yếu tố
“normal” ít phân cực hơn pha tĩnh. Thời gian lưu sẽ giảm khi hàm lượng H2O
trong pha động tăng. Loại sắc ký này thường áp dụng cho các chất có nhóm
cacboxylic, dạng racemic, các chất khá phân cực mà sắc ký pha đảo không đảm
nhận được [16,21].
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:
- Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký
15
- Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký
- Tính chất bề mặt ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất,
b. Lưa chon pha đông
Pha động là dung môi dung để rửa giải chất tan (chất cần phân tích ) ra
khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết
định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn họp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách.
Pha động trong HPLC có thể là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3
dung môi theo tỷ lệ nhất định, cũng có thể là các dung dịch các muối có chứa
chất đệm, chất tạo phức. Mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải tách tốt
nhất.
Pha động có thể ảnh hưởng tới:
- Độ chọn lọc
- Thời gian lưu giữ của chất tan
- Hiệu lực tách của cột
- Độ phân giải của chất tan
- Độ rộng của pic sắc ký
- Hĩnh dáng píc sắc ký
Vì những lý do trên nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc lựa
chọn pha động phù hợp là điều rất quan trọng.
Những yếu tố chính cần chú ý trong khi lựa chọn pha động:
- Bản chất dung môi được lựa chọn
- Thành phần các chất trong pha động
- Tốc độ dòng của pha động
- pH của pha động (đặc biệt với sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)
16
Những yêu cầu của một pha động:
- Phải hoàn toàn trơ với pha tĩnh
- Phải hòa tan được chất mẫu
- Phải bền vững theo thời gian
- Các thành phần phải hoàn toàn tinh khiết

- Nhanh đạt được trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp với detector được sử dụng
- Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường
Trong sắc ký pha thuận pha động thường là các dung môi ít phân cực như
n- hexan hoặc n-heptan và thường trộn lẫn một lượng nhỏ các chất phân cực như
isopropanol, ethylacetat, cloroform,
Trong sắc ký pha đảo thường hệ dung môi là sự pha trộn của nước và các
chất phân cực như methanol, acetonitril, THF, .Các hệ dung môi nay có thể hòa
tan một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Trong sắc ký pha thuận có sử dụng H2O pha động thường dùng là
acetonitril, methanol và một lượng nhỏ H20, có thể sử thêm một lượng nhỏ acid
để tạo pH thấp,
c. Chon pH
Cơ sở của việc chọn pH phù hợp được trình bày như dưới đây.
íTrong dung dịch ta có cân bằng sau: /p f P "9 \
[AB] = [A+] + [B-] í
Theo cân băng trên khoảng 50% phân tử sẽ bị ion hóa, Quá trĩnh săc ký
có sự phân tách không giống nhau giữa ion và các phân tử trung tính.
Các ion sẽ được rửa giải nhanh hon các phân tử, khi đó trong dung dịch
cân bằng mất đi và các phân tử trung tính sẽ tiếp tục phân chia kết quả pic thu
được sẽ bị doãng.
Chính vì vậy trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thư"
phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. pH thường
phải ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp
phụ mà chất tan có tính acid hay base. Do pH ảnh hưởng đến quá trình phân ly
như vậy nên pH sẽ góp phần làm hiệu quả tách được tốt hon.
Thông thường các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid, tuy
nhiên cũng có trường hợp ngoại lệ. Và pH trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy
từng trường họp.
d. Tốc đô dòng

Sau khi chọn được pha tĩnh, pha động, pH, ta tiến hành chạy và lựa
chọn tốc độ dòng. Tốc độ dòng ảnh hưởng tới thòi gian lưu, thừa số dung lượng,
số đĩa lý thuyết của cột.
1.2.7. ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính:
a. Đinh tính
Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ tương ứng với thời gian lưu của
chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. Tuy nhiên việc định tính đơn thuần bằng
HPLC không đảm bảo tính chắc chắn.
b. Sắc ký điều chế
Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và hứng lấy dung dịch rửa
giải cho bốc hơi dung môi thu lấy chất.
C. Đinh lương vả xác áỉnh giới han tap chất
Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất
trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Trong sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và
được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất
chuẩn. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kĩ thuật HPLC:
- Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và mẫu chuẩn đều được tiến
18
hành trong cùng một điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được
so sánh với mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính theo cách chuẩn hóa một điểm hoặc
chuẩn hóa từ một điểm trên đường tuyến tính.
- Phương pháp chuẩn nội: Là phương pháp cho thêm những lượng giống
nhau của chất chuẩn thứ hai đáp ứng gần giống chất phân tích vào cả hai mẫu
chuẩn và thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội.
Yêu cầu của pic của chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn ra khỏi pic của chất cần
phân tích. Kết quả được tính dựa vào tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic đáp ứng
của chất phân tích và chất chuẩn nội.
- Phương pháp thêm chuẩn: Phương pháp này dùng trong HPLC khi có

ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mầu thử được thêm
một lượng chính xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa
trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện
tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic:
+ Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp
nhiều cấu tử được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so
với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần.
Yêu cầu:
+ Tất cả các thành phần phải được phát hiện và rửa giải hoàn toàn
+ Tất cả các chất có đáp ứng như nhau với detector.
Khi đó hàm lượng các chất thành phần được tính theo công thức sau:
s .ìo o ^ 0
s, + sy+s, ỵ ; s ,
Tuy vậy sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng
như nhau với detector là rất khó. Khắc phục nhược điểm này của sắc ký lỏng
người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp
19
ứng người ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1. Các hệ
số đáp ứng của các chất tính theo công thức sau:
Trong đó :
+ sc và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chất chuẩn gốc và
thành phần cần tính hệ số đáp ứng.
+ Cc và cx là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần
tính hệ số đáp ứng.
+ fc là hệ số hiệu chỉnh.
Khi đó hàm lượng thành phần X tính theo công thức:
S. .F .100
% x =
SX.FX +Sy.Fy+Sz.Fz

Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng và thử giới hạn tạp chất
trong thuốc.
20