Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn cố định nitơ tự do clotridium trong đất trồng lạc xã Nghi Liên huyện Nghi Lộc tỉnh Nghệ An

Phần I: Đặt vấn đề
Nitơ hay còn gọi là đạm là một trong những nguyên tố đợc ngời ta quan tâm
nhiều nhất từ trớc tới nay. Nitơ chiếm khoảng 16%trong prôtêin. Nitơ còn là một thành
phần quan trọng của axit Nuclêic. Không có nitơ thì không có sự sống. Nitơ có mặt
trong chất diệp lục, trong nhiều loại vitamin, nhiều loại kích tố và rất nhiều hoạt chất
quan trọng khác.
Ngời ta nhËn thÊy r»ng muèn cã thu ho¹ch 12 t¹ hạt trên mỗi hecta,cây trồng
cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ. Số lợng nitơ này nằm trong hạt và trong rơm rạ
hoặc trong thân lá. Hiệu suất sử dụng phân hóa học là vào khoảng 75%. Nh vậy có
nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thì muốn có 5 tấn hạt chúng ta
phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng đơng với 833kg amôn sunphát) Số lợng nitơ này thật khó có thể thỏa mÃn ngay cả ở nớc có công nghiệp phân nitơ hóa học
phát triển
Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, trong không khí có đến 78,16% là nitơ. Ngời ta
tính rằng bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x10 15tấn nitơ, khoảng không khí bên
trên mỗi km2 đất đai có khoảng 80.000 tấn nitơ. Số lợng nitơ này để thoả mÃn nhu cầu
về nitơ của cây trồng sống trên mảnh đất đó(với thu hoạch 20 tạ/ha)trong khoảng 80
triệu năm.
Trong thực tế cây trồng( cũng nh ngời và động vật) không có khả năng đồng hoá
trực tiếp nguồn nitơ lớn lao này. Sở dĩ nh vậy bởi vì trong không khí, phân tử nitơ tồn


tại ở trạng thái liên kết 2 nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ 3 dây nối rất bền vững(N=N).
[3]
Trên toàn trái đất hằng năm cây trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu tấn nitơ,
trong khi đó phân đạm hoá học của tất cả các nớc trên thế giới chỉ bổ sung đợc khoảng
30% số lợng nitơ bị lấy đi.
Trong khi con ngời muốn phá vỡ 3 liên kết trong phân tử nitơ (N=N)để dễ tạo ra
các loại phân hoá học, cần phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất phức tạp: nhiệt
độ cao(6000 C ), áp suất cao(1000atm), chất xúc tác đắt tiền(Os,Ru) thì có một số vi
sinh vật có khả năng đồng hoá dễ dàng và thờng xuyên nitơ của không khí ở điêù kiện
bình thờng , ngời ta gọi chúng là các vi sinh vật cố định nitơ.[2]

Vi sinh vật cố định nitơ gồm có nhiều loài vi sinh vật sống tự do trong đất và
trong nớc. Các loài thuộc các giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas ,Bacillus,
Azotobacter,vi khuẩn dinh dỡng quang năng, vi khuẩn sinh mêtan....Trong số những vi
sinh vật sống t do ở đất thì Azotobacter ,Clostridium là những vi khuẩn có khả năng cố
định nitơ cao nhất.Khả năng cố đinh nitơ tự do còn có ở vi khuẩn nốt sần(Rhizobium)
sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu. Tuy nhiên ở loài sống cộng sinh thì chúng có
tính chọn lọc mỗi loại vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm lên một loài cây nhất định và
chúng chỉ cố định đợc nitơ khi ở trong nốt sần. đối với vi sinh vật sống tự do ngoài khả
năng cố định nitơ tự do trong không khí cho đất cho cây còn có ứng dụng lớn lao
trong sản xuất ph©n bãn vi sinh.


Ngời ta đà dành những cố gắng rất lớn một mặt đi sâu nghiên cứu về đặc điểm
sinh học của các nhóm vi sinh vật cố định nitơ và tìm cách phát huy cao nhất tác dụng
lớn lao này của chúng, mặt khác tìm cách khám phá ra các bí mật của cơ chế cố định
nitơ sinh học với hy vọng sẽ từng bớc dẫn đến những cải tiến quan trọng trong ngành
công nghiệp sản xuất các loại phân nitơ hoá học.[3]
Trong điều kiện nớc ta hiện nay, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi
khuẩn cố định nitơ tự do có ý nghĩa rất lớn nhằm để phát huy hết khả năng cố định nitơ
của chúng, từ đó ứng dụng trong công nghiệp sản xuất trong phân bón vi sinh.
Trong chiến lợc phát triển kinh tế những năm gần đây, nhà nớc đà chú trọng phát
triển những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao trong đó có cây lạc.ở
Nghệ An, cây lạc là một trong những cây có giá trị kinh tế đà đợc tỉnh quan tâm đầu t
và phát triển.
Từ những lý do trên và với khuôn khổ của một đề tài tốt nghiệp cử nhân sinh học
mà chúng tôi đi vào tìm hiểu khả năng cố định nitơ tự do của vi khuẩn kị khí
Clostridium trong đất trồng lạc xà Nghi Liên- Nghi Lộc-Nghệ An.
Mục tiêu đề tài
1.Tìm ra các chủng Clostridium có khả năng cố định nitơ tự do
2.Chọn một chủng có khả năng cố định nitơ tự do lớn nhất để nghiên cứu đặc

điểm hình thái và các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH, tìm ra các trị
số tối u để chủng đó sinh trởng và phát triển tốt .


3.Rèn luyện cho bản thân một số kĩ năng thực hành, thí nghiệm, phơng pháp
nghiên cứu khoa học.

Phần II: Tổng luận
I. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất:

Khu hệ vi sinh vật đất rất phức tạp, có những đặc điểm sinh lý và sinh thái rất
khác nhau. Riêng vi khn ®· rÊt phong phó. Chóng bao gåm vi khuẩn háo khí, vi
khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dỡng, vi khuẩn dinh dỡng cacbon, vi khuẩn cố định đạm...Vi
sinh vật sống thành quần thể, giữa loài này và loài khác có tác động qua lại lẫn nhau,
chúng là tác nhân chủ yếu của quá trình chuyển hoá vật chất trong đất.
Vi sinh vật có mặt trong tất cả các loài vật nhng ở chân đất có đầy đủ chất dinh
dỡng, kết cấu và thành phần cơ giới tốt, có độ ẩm và phản ứng môi trờng thích hợp thì ở
đấy vi sinh vật phát triển nhiều và phong phú về thành phần. Trên những chân đất khô
hạn, lầy thụt thì sự phát triển vi sinh vật bị hạn chế rõ rệt và tạo thành một khu hệ vi
sinh vật đặc biệt: khu hệ vi sinh vật chịu chua, khu hệ vi sinh vật kị khí và vi hiếu khí,
khu hệ vi sinh vật phát triển trong môi trờng nhiều H2, CH4...
Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u thế. Các loài vi khuẩn sống tự do, có
khả năng cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum có nhiều trong đất
lúa. Hai loại này có đặc điểm khác nhau :Azotobacter đòi hỏi có ô xi phân tử, có phản
ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca, Mg và chất hữu cơ. Vì vậy trong đất
lúa có nhiều vùng không tìm thấy Azotobacter còn vi khuÈn kÞ khÝ Clostridium


pasteurianum phân bố nhiều trong đất lúa, số lợng của chúng có nhiều trong mỗi gam
đất, Chúng đà góp phần tích cực làm giàu đạm cho đất lúa.

ở đất chuyên trồng màu hoặc luân canh 1 vụ lúa, 1 vụ màu có điều kiện thông
khí tốt, vi sinh vật háo khí phát triển mạnh.
Quần thể vi sinh vật đất thờng tập trung nhiều ở đất canh tác, nơi tập trung nhiều
rễ cây đợc bố sung nhờ chất dinh dỡng và có chế độ nhiệt , chế độ không khí thích hợp
cho vi sinh vật phát triển. Các loài vi sinh vật háo khí giảm xuống theo chiều sâu tầng
đất, còn vi khuẩn kị khí phát triển mạnh ở tầng đất sâu 40-60cm và trong điều kiện đất
thoát nớc mạnh, giàu chÊt dinh dìng.
Thêi tiÕt khÝ hËu cịng chi phèi m¹nh mẽ đến quần thể vi sinh vật đất. Những
tháng nóng ẩm có ma rào, ma phùn, cây cối phát triển tốt chính là thời gian vi sinh vật
phát triển mạnh mẽ.
Vi sinh vật đất đặc biệt là vi sinh vật vïng rƠ cã mèi quan hƯ mËt thiÕt víi c©y
trång. Thời kì cây ra hoa, bộ rễ hoạt động mạnh tiÕt ra nhiỊu chÊt dinh dìng cã t¸c
dơng kÝch thÝch vi sinh vật phát triển. Vi khuẩn kị khí có khuynh hớng phân bố xa vùng
rễ.
Điều kiện địa hình , khu vực địa lý cũng ảnh hởng không nhỏ đối với vi sinh vật
đất. Khi điều kiện sinh thái thích hợp với cây trồng thì cũng thích hợp với sự phát triển
vi sinh vật đất. Sự tác động của con ngời thông qua việc khai phá đất đai, thâm canh
tăng năng suất cây trồng làm chi phối rất mạnh mẽ tới khu hệ vi sinh vật đất. Việc cày
bừa, xới xáo đất, bón phân làm ải, tới tiêu hợp lý đà xúc tiến mạnh mẽ sự phát triển của
vi sinh vật đất, làm tăng độ phì nhiêu của đất và tăng năng suất cây trồng.[2]


II. Sơ lợc về vi khuẩn Clostridium

Năm 1893 lần đầu tiên X.N.Vinogradxki phát hiện đợc một loại vi khuẩn kị khí
sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử, đó là Clostridium pasteurianum.
Tế

bào

của

Clostridium à pasteurianum có kích thớc khoảng 2,5-

7,5x0,7-1,3 có thể đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn. Khi còn non
có tế bào chất đồng đều, có khả năng di động. Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt, tế
bào mất khả năng di động. Bào tử thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm ở giữa
hay gần một đầu của tế bào. Bào tử có kích thớc lớn hơn bề rộng của tế bào dinh dỡng,
do đó khi mang bào tử tế bào thờng có hình con thoi. Kích thớc của bào tử khoảng
1,3à.x1,6.à.
Hiên nay ngoài loài Clostridium pasteurianum ngời ta còn nhận thấynhiều loài
Clostridium khác cũng có khả năng cố định nitơ phân tử. đó là các loài: C.butyricum, C.
butylicum, C. beijerinckia, C ..aceticum, C .multifermentans, C. Acetobutylicum, C.
felsineum, C. kluyveri, C. lactoacetafilum, C.madisonii. Sù kh¸c nhau vỊ các đặc điểm
hình thái và sinh lý giữa các loài này có thể đợc thấy rõ trong khoá phân loại của
Bergey(1965).
Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố định cao
hơn các loài Clostridium khác. Khi đồng hoá hết 1g thức ăn các bon, chúng thờng tích
luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ. Khả năng cố định nitơ của các loài trong chi Clostridium
còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Clostridium có khả năng đồng hoá các
monosaccarit, disaccarit vµ mét sè polisaccarit(nh tinh bét, dextrin). Chóng cã thĨ ®ång


hoá cả nhiều rợu bậc cao và một số hợp chất chứa các bon khác nữa. Khi lên men
hidratcacbon, Clostridium thờng làm tích luỹ axit hữu cơ butanol, etanol, axeton, CO 2,
H2......Thành phần và tỷ lệ của các sản phẩm lên men phụ thuộc vào từng loại vi khuẩn
cũng nh phụ thuộc vào hai pha khác nhau của quá trình lên men. Chẳng hạn
Clostridium axetobutylicum thờng làm tích luỹ trong pha đầu axit axetic, axitbutiric và
trong pha sau butanol, axeton và etanol.
Clostridium pasteurianum cũng nh nhiều loài Clostridium có khả năng cố đinh

nitơ khác có thể phát triển đợc trong phạm vi pH khá rộng (pH =4,7-8,5). Tuỳ từng
nghiên cứu mà pH thích hợp nhất đối với sự phát triển của Clostridium là 5,9-8,3,hay
6,9-7,3. Các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết ngay cả những vùng đất chua, khi không
tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt với số lợng đáng kể.
Nói chung trên mỗi gam đất trồng lúa, trên miền bắc nớc ta, số lợng vi khuẩn nhóm
này có từ hàng vạn đến từ hàng triệu tế bào. Số lợng của chúng trong vùng rễ cây trồng
bao giờ cũng nhiều hơn ngoài vùng rễ. Clostridium thờng tập trung nhiều trong lớp đất
cày nhng ngay ở độ sâu 75cm vẫn có thể thấy có hàng ngàn tế bào trong mỗi gam đất
(Nguyễn Lân Dũng, 1960, 1969).
Bào tử của Clostridium có sức đề kháng rất cao đối với nhiệt độ cao và sự khô
hạn. Một số nghiên cøu cho biÕt bµo tư cđa loµi vi khn nµy có thể sống đợc đến 5 giờ
ở nhiệt độ 750C và một giờ ở nhiệt độ 80 0C .Bao tử của một số chủng Clostridium chịu
nhiệt ngay ở nhiệt độ 1000 C vẫn có thể sống đợc 30phút.


Các loài Clostridium hiện diện trong đất ,một số loài trong nhóm này còn gây
bệnh cho ngời và động vật, một số loại khác gây h hỏng thực phẩm khử sunphur tạo
nên màu đen và gây mùi khó chịu Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.
botulinum và C. perfringens.[14]
III. Vòng tuần hoàn Nitơ trong tự nhiên

Cây không đồng hoá trực tiếp nitơ hữu cơ. Trong thực tế cây trồng có thể nhận đợc
một nguồn nitơ lớn nhờ quá trình phân giải của vi sinh vật đối với các chất hữu cơ có mặt
trong đất hoặc đa vào đất (phân rác, phân xanh, phân chuồng). Quá trình này gọi là quá
trình a môn hoá hoặc quá trình thối rữa.
Nếu đất bị ngập nớc và không đủ ôxi thì muối amôn đợc tạo thành sẽ tích luỹ lại
trong đất, nhng nếu trong đất có đầy đủ ôxi thì NH 3 sẽ đợc oxi hoá thành nitrit rồi tiếp
đó sẽ ôxi hoá thành nitrat (Quá trình nitrat hoá) Nitrat là một trong những dạng hợp
chất nitơ đợc cây trồng hấp thụ một cách dễ dàng.
Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phản nitrat hoá, tức là quá trình khử

nitrat thành nitơ phân tử. Bên cạnh quá trình phản nitrat hoá do vi sinh vật còn có một
quá trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng giữa HNO 2với axit amin hoặc
amit). Sau quá trình phản nitrat hoá, nitrat sẽ chuyển thành nitơ phân tử bay vào không
khí.
Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờ
một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ, tức là quá trình chuyển hoá
nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá


trình này đợc gọi là các vi sinh vật ccố định nitơ, chúng có tác dụng làm giàu thêm
nguồn dự trữ thức ăn nitơ trong đất.

_

_
n_ n

n2

Tự do trong không khí

Sự phân giải

Động vật và
thực vật

Protein của xác hữu cơ

Thực vật

n2 o

Nấm và vi khuẩn phân
giải xác hữu cơ

Cây họ
đậu

Amon

nh3
Đồng hoá
amon hoá
Nitrit

2

no
Khử nitrat

Nitri

-

Nitrat

3

no

no2
Nitrat hoá

Hình 1: Chu trình nitơ trong tự nhiên
IV. Cơ chế của quá trình cố định Nitơ phân tử

Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N 2 thành các dạng
hợp chất của nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều năng lợng. Số năng lợng
để tổng hợp một tấn NH3 tơng đơng với số năng lợng sinh ra khi đốt cháy 5 tấn than
đá. Trong khi đó các vi sinh vật cố định nitơ bằng một cơ chế nào đó đà thờng xuyên
chuyển hoá đợc N2 thành các hợp chất chứa nitơ ngay trong điều kiện bình thờng về
áp suất và nhiệt độ. Nếu khám phá ra đợc cơ chế quá trình cố định nitơ ở vi sinh vật


thì rõ ràng sẽ mở ra một triển vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ quá
trình sản xuất phân nitơ hoá học.
Đa số nghiên cứu đều cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học là một quá
trình khử N2 thành NH3 dới tác dụng cña men nitrogenaza sinh ra bëi vi sinh vËt.
Nitrogenaza cã thể thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào của các vi sinh
vật cố định nitơ .
Nitrogenaza là một hệ phức enzim. Chúng cấu tạo bởi 2 thành phần đó là
prôtêin có phân tử nhỏ.
Một thành phần gọi là prôtêin sắt còn gọi là nitrogenaza khử hay thành phần
II. Một thành phần khác gọi là prôtêin sắt-Molipden hay còn gọi là thành phần I.
Thành phần II đợc nghiên cứu ở Clostridium pasteurianum gồm 2 tiểu phần
đồng nhất, mỗi tiểu phần có khối lơng 29.000, ở giữa có một trung tâm chứa 4
nguyên tử Fe và 4 nguyên tử S không ổn định với axit. Thành phần I(Mo-Fe prôtêin )
ở Clostridium pasteurianum phức tạp hơn có khối lợng phân tử chung là 220.000
gồm 2 nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe và nhiều nguyên tử S không ổn định
với axit. Chúng có cấu tạo bởi 4 tiểu phần gồm 2 loại, mỗi loại có khối l ợng phân tử

là 50 và một loại có khối lợng phân tử là 60.000 Dalton. Mỗi loại gồm hai tiểu phần.
Nitrogenaza không chỉ xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà còn có thể xúc tác
việc khử CH3 CN, HCN, NH3,N2 O, C2H2...thành các sản phẩm tơng ứng.
Phản ứng khử N2 dới sự xúc tác của nitrogenaza có thể biểu thị v¾n t¾t nh sau:


Nitrogenaza
N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O

2NH4++ 12ADP + 12Pi + 4H+

Ngời ta cho rằng quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng kế tiếp nhau và sử
dụng năng lợng của ATP.

2H+. ATP
N2

2H+.ATP
[NH = NH]

+2H. ATP
[NH2 -NH2]

2NH3

Sơ đồ giả thuyết về trung tâm hoạt động của nitrogenaza đợc trình bày nh sau:
Electron của các chất khử (feredoxin, ditionit)đi vào trung tâm có chứa Fe của
thành phần en zim II(prôtêin -Fe)và tiếp tục chuyển cho thành phần en zim I(prôtêin
-Fe-Mo).Electron đà hoạt hoásẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo ở bên trong
"hạt. Tại đây Mo sẽ bị khử và nhờ đó có khả năng phẳn ứng nhanh chóng với N2.

Phân tử N2 đi qua một khe có kích thớc khoảng 4-5 Ao tức là tơng ứng với chiều dài
của phân tử N2 vào bên trong men và đợc hoạt hoá ở đấy.
Kết quả của quá trình Nitrogen hoạt hoá và hấp phụ hoá học Nitơ sẽ làm dứt 2
dây nối trong số dây của phân tử N2. Năng lợng tiêu phí là 7,8x105J/mol. Dây nối thứ
3 sẽ cắt đứt khi tiếp xúc với hidro đà đợc hoạt hoá nhờ các men đehirogenaza và hệ
thống hidrogenaza.


Sau đó NH3 hoặc các sản phẩm khử khác đợc sinh ra sẽ liên kết với các
ketoaxit để tạo thành axitamin [2].
Hiệu suất của quá trình cố định đạm ở loại kị khí cao hơn so với loại hiếu khí.
Khi sử dụng hết 1g thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum thờng chuyển hoá đợc
một lợng N2 ít hơn Azotobacter khoảng 4- 7 lần . Trong khi đó khi phân giải thức ăn
cacbon Clostridium pasteurianum nhận đợc số năng lợng ít hơn Azotobacter đến 45
lần. Nh vậy nếu tính theo một đơn vị năng lợng đà nhân đợc thì loại kị khí cố định
đạm đợc nhiều hơn loại hiếu khí tới 6-10 lần. [6]
V. Sử dụng các vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ trong nông nghiệp.
Vi sinh vật cố định nitơ đóng vai trò rất quan trọng trong việc thực hiện vòng
tuần hoàn nitơ trong nông nghiệp.
Các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do(háo khí và kị khí) có khả năng làm giàu
thêm hàng năm khoảng 15-16kg nitơ cho mỗi ha đất đai(tơng đơng với 75-300kg
đạm sun phát). Các loại tảo lam sống trong ruộng lúa cũng có khả năng đem lại cho
mỗi ha đất mỗi năm khoảng 15-80 kg nitơ. Một hecta trồng cây bộ đạu mỗi năm có
thể cố định từ 50-600kg nitơ. Để tăng khả năng cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần ngời ta đà tiến hành nuôi cấy vi khuẩn nốt sần tạo ra chế phẩm Nitragin để bón vào đất
hay tẩm hạt giống các cây thuộc bộ đậu tơng ứng trớc khi gieo trồng, Nitragin có khả
năng làm nâng cao năng suất cây bộ đậu khoảng 10-15%. [2]
Chế phẩm Azotobacter còn gọi làAzotobacterin. Đối với các loại đất có chứa
nhiều chất hữu cơ, dễ hấp thụ Azotobacterin có thể làm tăng năng suất khoảng 610% sản lợng cây trồng.Là loại phân cã chøa vi sinh vËt trùc tiÕp hót nit¬ cđa kh«ng

khí chuyển hóa vào đất thông qua vi sinh vật tự dỡng háo khí ,nghĩa là làm thức ăn
cho chính vi sinh vật đó sau khi chết để lại chất dinh dỡng hữu cơ ,đạm dễ tiêu cho
đất . Vì vậy điều kiện để vi sinh vật này hoat động là khá nghiêm ngặt :đất phải chua,
lợng lân dễ tiêu,chất hữu cơ ,một số nguyên tố vi lợng phải khá dồi dào. Kĩ thuật
phổ biến vẫn thờng ngâm với hạt giống trớc khi gieo .Tại Việt Nam cũng đà áp dụng
thử phân Azotobacterin nhng cha có hiệu quả rõ rệt.
ĐÃ cã rÊt nhiỊu thÝ nghiƯm sư dơng chÕ phÈm Clostridium pasteurianum (dịch
nuôi cấy hoặc dịch nuôi cấy trộn với đất ®· khư trïng) ®Ĩ bãn cho c©y trång. Trong
mét sè trờng hợp đà thu đợc những hiệu quả dơng tính khá rõ rệt(nhất là khi phối hợp
với Azotobacterin ). Tuy nhiên hiệu quả nay thờng không ổn định và cho đến nay ngời ta vẫn cha giải thích đợc một cách dứt khoát là trong trờng hợp có tác động dơng
tính thì chủ yếu là do sự cố định nitơ hoặc là do tích luỹ những chất có hoạt tính sinh
học cao.[3]

Phần III: Địa điểm, thời gian và phơng pháp nghiên
cứu
I. Địa điểm nghiên cứu:

Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trờng Đại học Vinh
II. Thời gian nghiên cứu:

Từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 4 năm 2007


III. Phơng pháp nghiên cứu

3.1 Phơng pháp điều tra
Dùng phiếu điều tra để tra khảo tình hình sản xuất kết hợp vói phỏng vấn các hộ
đển hình về chế độ đầu t ,phân bón những nhận xét về đất trồng ,kỹ thuật canh tác
3.2. Thu mẫu vi sinh vật
Khi phân lập vi sinh vật từ đất hay tính số lợng vi sinh vật của đất thì việc lấy

mẫu đợc tiến hành nh sau:
Dùng dao vô trùng lấy 1 kg đất ở độ sâu 0-30cm thuộc 5 chỗ khác nhau theo
phơng pháp đờng chéo rồi trộn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đà khử trùng để đựng
đất, loại bỏ rễ cây và vật lạ. Ghi nhÃn, bảo quản và phân tích tại phòng thí nghiệm.
[10]
3.3. Phơng pháp phân lập vi sinh vật
Cân 1 kg đất đà đồng đều +10ml nư
ớc cất (vô trùng)
Lắc 10-15 phút
Để lắng
Lấy 1ml+ 9ml nước cất (Pha
loÃng thập phân đến 10-4-10-5)
Lấy 0,1 ml ở các nồng độ pha
loÃng khác nhau cấy vào môi trư
ờng
Vi sinh vật đợc nuôi trong môi trờng Vinograxki gồm:
(NH4)2SO4

2g


NaCl

2g

K2HPO4

1g

FeSO4

0,1g

MgSO4

0,5g

CaCO3(MgCo3) 1g
Nớc :1l
Cân chính xác các thành phần
của môi trường
Hoà tan đun sôi
điều chỉnh pH
Cho vào bình tam giác
ống nghiệm, petri

Khử trùng ở 1atm
thời gian 30 phút
Bảo quản tủ lạnh


Dùng trang thuỷ tinh phân phối đều huyền phù vi sinh vật lên trên bề mặt
thạch. Sau đó đặt vào tủ ấm nuôi 30oC trong 3- 5 ngày. Khuẩn lạc xuất hiện, theo dõi
thờng xuyên. Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác nhau đứng riêng rẽ.
Dùng que cÊy lÊy mét Ýt vi sinh vËt ë khuÈn l¹c vi sinh vật đó cấy lên ống thạch
nghiêng, đem nuôi ở nhiệt độ 30-350C
Sau thời gian nuôi cấy cần kiểm tra lại độ thuần chủng của giống vi sinh vật ®·
mäc trong tõng èng nghiÖm ,nÕu trong tõng èng nghiÖm mọc chủ yếu là giống vi
sinh vật cần tìm nhng có lẫn chút ít loại vi sinh vật khác thì có thể dùng phơng pháp
cấy rải nh sau :

Để thu đợc các khuẩn lạc riêng biệt đem que cấy vô trùng chạm nhẹ lên môi
trờng thạch nghiêng hoăc môi trờng lỏng ,cấy ríc rắc vuông góc lên mặt thạch
của hộp petri.Sau đó chọn khuẩn lạc mọc tốt của vi sinh vật cần tìm đem cấy vào ống
nghiệm chứa môi trờng lỏng .[7]
3.4. Phơng pháp theo dõi (theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát triển)
3.4.1.Thời gian mọc của vi khuẩn
Sau khi cấy dịch huyền phù vào môi trờng thạch, theo dõi thờng xuyên sự xuất
hiện của khuẩn lạc cho đến khi không xuất hiện các khuẩn lạc mới. Vì mỗi loài có có
một tốc độ sinh trởng và phát triển không giống nhau.
3.4.2.Theo dõi sự sinh trởng:
Nuôi trong đĩa petri, đo kích thớc (() của khuẩn lạc bằng thớc ®o palmer trong
thêi gian 24 giê hc 48 giê hc 72 giê.
Tõ ®ã tèc ®é sinh trëng theo Blachman(1981)


Wt-Wo
P=

x100%
Wo

Trong đó:

Wo là số đo lần đầu
Wt là số đo lần sau tại thời điểm t

3.4.3.Tìm hiểu các đặc điểm của các khuẩn lạc
Vi sinh vật phát triển trên môi trờng đặc sẽ hình thành các khẩn lạc đặc trng cho
loài đó. Vì vậy việc miêu tả các khuẩn lạc là một trong các công việc rất cần thiết đối
với công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu.

Tìm hiểu các đặc điểm của khuẩn lạc: Màu sắc, hình dáng, bề mặt, cấu trúc, bờ
khuẩn lạc.
3.4.4. Thử hoạt tính cố định nitơ của các chủng
+Thử định tính
Từ các chủng đà phân lập đợc, dùng que cấy lấy một ít chđng cho vµo èng
nghiƯm chøa 2 ml níc cÊt. Sau đó cho thuốc thử Nessle vào:
Xuất hiện màu vàng cam(dơng tính :+)
Không xuất hiện màu vàng cam(âm tính:-)
+Thử định lợng(amôn)
Từ các chủng có kết quả (+) ở trên. Dùng que cấy lấy một ít chủng đem nuôi trong
ống nghiệm chứa 5ml môi trờng Vinograxki lỏng. Sau khoảng 3-5 ngày đem đo trên
máy quang phổ CELCIN của Mỹ:


Tìm ra đợc chủng có có hàm lợng NH+4 lớn nhất
-Pha dung dịch chuẩn NH4Cl 0,001 mg/ml
Cân 0,3820g NH4Cl pha trong 1l ta đợc 0,1mgN/ml
Lấy 50 ml dung dịch này pha trong 500ml ta đợc dung dịch 0,01mgN/ml
3.5. Xác định số lợng vi sinh vật theo phơng pháp CFU(colony-forming
unit)
- Từ mẫu ban đầu sau đó pha loÃng theo dÃy thập phân
- Cấy vào môi trờng thạch đà vô trùng
- Nuôi ở 30Otrong 3- 5 ngày
- Xác định số lợng khuẩn lạc trên đĩa petri
- Tính số lợng tế bào theo công thức

N
A(CFU/g hay CFU/ml) =
n1Vf1+....+niVfi

Trong đó:

A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1

ml mẫu.

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên các ®Üa ®· chän
(25-250 khuÈn l¹c) theo FDA(Food and Drug Asministration )
ni: Số đĩa cấy tại độ pha loÃng thứ i


V: Thể tích dịch mẫu (ml)cấy vào trong mỗi đĩa
fi: Độ pha loÃng tơng ứng.[14]
3.6. Các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng
3.6.1. ảnh hởng của độ ẩm
Đất mới lấy về làm sạch bằng cách sấy khô.Dùng nớc cất vô đạm cho vào, điều
chỉnh độ ẩm
Xác định độ ẩm của đất bằng máy Humiditi/Thermometer.HANA. Hig 161C
của Anh
Xác định hàm lợng NH+4 ở độ ẩm khác nhau trong các ngày khác nhau.
- Phơng pháp xác định NH+4theo Kjendahl Nessler và Sapiro-1972.[12]
Cân 10 g đất tơi +100ml KCl 0,1N cho voà bình tam giác 250ml dịch lọc vào bình
định 25 ml, thêm 1ml dung dÞch Seignetle (Tactrat kÐp K-Na)50% +1ml dung dÞch
Nessle định lợng trên vạch rồi so màu trên máy. Xác định nồng độ C bằng cách so
sánh với đồ thị nồng độ chuẩn.
- Tính kết quả:
CxVxV2 x K
NH4+ (mg/100gđất) =

x 100%

WxV1

Trong đó:
V: Số ml dung dịch chiết rút(100ml)


V1: Thể tích đem so màu(5ml)
V2: Thể tích hiện màu(25ml)
W: Khối lợng đất cân:10g
C:Nồng độ so màu(mg/ml)
K: Hệ số khô kiệt
- Thang tiêu chuẩn:
Lấy 10 bình định mức 25 ml lần lợt cho vào các thể tích khác nhau dung dịch
NH4Cl 0,01mg/ml tiêu chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16,ml.
Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch Seignetle +1ml Nessle định mức đến vạch so
màu.
Tiến hành so màu nh mẫu nghiên cứu.
3.6.2. ảnh hởng pH
Cho mỗi công thøc thÝ nghiÖm mét Ýt vi sinh vËt nh nhau cùng một môi trờng đÃ
vô trùng, điều chỉnh pH ở các công thức khác nhau (pH=5, pH=6, pH=7, pH=8, pH=9).
Sau đó nuôi cùng một nhiệt độ là 300C.
Từ đó xác định hàm lợng NH+4 ở các công thức bằng phơng pháp so màu với
thuốc thử Nessle.
3.6.3. ảnh hởng nhiệt độ.
Để theo dõi ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng đồng hoá của nitơ ta cho mỗi
công thức thí nghiệm một ít vi sinh vật vào cùng một môi trờng. Sau đó đem nuôi các
điều kiện nhiệt độ khác nhau 200C, 300C, 400C, 500C.


Xác định NH+4 ở các công thức bằng phơng pháp so màu với thuốc thử Nessle.

3.6.4. ảnh hởng thời gian đến khả năng đồng hoá Nitơ
Qua theo dõi pH,nhiệt độ ,độ ẩm ở các thời gian khác nhau .Từ đó rút ra thời
gian tốt nhất cho sự cố định nitơ
3.7. Phơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đợc xử theo phơng pháp toán học thống kê
-Xác định trung bình cộng:
1 n
X = Xi
n i=1
Trong đó: X: Trị số trung bình cộng
Xi: Giá trị thứ i của dÃy biến số
n: Số lần xuất hiện dÃy biến số
- Xác định độ lệch chuẩn
n

Trong đó:

X : Giá trị trung

=

bình
Xi : Giá trị tõng phÇn
n

: Sè lÇn thùc hiƯn

∑ ( Xi − X )
i =1

n

2


Phần IV: Kết quả nghiên cứu
Chơng I: Đặc điểm của vi khuẩn clostridium
I. Tình hình sản xuất ở địa phơng

1. Địa điểm:
Đất trồng lạc - xóm 17 - Nghi Liên - Nghi Lộc - Nghệ An
2. Loại đất:
Là đất trồng lạc truyền thống , kết hợp với luân canh lạc -ngô -vừng ,vụ chính từ
tháng 12- tháng 4 âm lịch .
Địa hình bằng phẳng ,đất cát pha giữ ẩm kém ,pH trung tÝnh
3. DiÖn tÝch: 500m2
4. Kü thuËt:


- Kỹ thuật làm đất: Làm 3 lần : Cày vỡ, cày trở, cày vọc, sau đó chia luống, mỗi
luống 1-1,5m
Bón phân:

Phân chuồng 3 -4tạ phân/sào
Phân NPK 15-20kg/sào. Tỷ lệ N:P:K là 10:8:5
Bón vôi: 20 - 30kg/sào

Rắc tung phân sau đó tiến hành xới xáo để trộn đều phân vào ®Êt
- Kü thuËt trØa l¹c: Gièng l¹c L14, l¹c Trung Quốc. Với kỹ thuật trồng lạc phủ ni
lông ,phun thuốc trừ cỏ

Mỗi mét chia 5 hàng, mỗi hàng cách 20 - 25cm, mỗi khóm(cây)cách 10 - 15cm.
- Kỹ thuật chăm sóc: Lạc khoảng 3 lá bón thêm đạm: 2kg/sào
Khi lạc 4-5 lá thì làm cỏ.
Khi lạc ra hoa bón thêm 4-5kg kali/sào, 2kg đạm/sào, làm sơ cỏ vun gốc
Khi lạc ra hoa nhiỊu phun chÊt kÝch thÝch vµ bãn 10kg vôi/sào
5. Năng suất: Bình quân 1,5tạ/sào
II. Phân lập vi khuẩn Clostridium

1.Đặc điểm Clostridium.
Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dơng, hình que, kị khí, sinh bào tử phần
lớn di động, có thể thuỷ giải sacchoride và prôtêin. Trong các hoạt động thu nhận năng
lợng, những loài thuỷ giải sacchoride có thể lên men loại đờng polisacchoride tạo thành
axetic acid, butiric và rợu. Nhiều loài có thể thuỷ giải prôtêin và chuyển hoá không
hoàn toàn các axit amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết giống


Clostridium thc nhãm a nhiƯt võa, tuy nhiªn cã mét số loài thuộc nhóm a nhiệt và
một số loài khác thuộc nhóm a lạnh. [12].Có nhiều loài Clostridium đà đợc chứng minh
là có khả năng cố định nitơ phân tử. Trong đó loài có hoạt tính cố định nitơ cao nhÊt lµ
Clostridium pasteurianum. TÕ bµo Clostridium pasteurianum cã kÝch thíc khoảng 0,71,3x2,5-7,5à. Chúng có thể đứng riêng, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn. Khi còn non
chúng có chu mao và có khả năng di động, tế bào có cấu tạo đồng nhất. Khi già tế bào
có cấu tạo lổn nhổn(chứa các hạt dữ trữ loại tinh bột) . Tế bào mất khả năng di động.
Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6à, thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm ở giữa
hoặc một đầu của tế bào. Bào tử có kích thớc lớn và rộng hơn tế bào dinh dỡng, do đó
khi mang bào tử tế bào có hình con thoi. Khuẩn lạc trắng, phẳng và sáng.[10].

H.2- vi sinh vât cố định ni tơ tự do thuộc giống

clostridium

Clostridium có thể đồng hoá các nguồn thức ăn nitơ vô cơ và hữu cơ. về thức ăn
cacbon, chúng có thể sử dụng nhiều loại hợp chất khác nhau. So với Azotobacter chúng


ít mẫn cảm hơn đối với K, P, Ca và có tính ổn định cao hơn đối với pH thấp hoặc cao
của môi trờng.
Clostridium phát triển thích hợp trong những đất có độ ẩm vào khoảng 60-80%
so với độ ẩm tuyệt đối. Chúng phát triển tốt trong các lớp đất cày vì ở trong đó có các
chất hữu cơ phong phú.
Chỉ có loại Clostridium a ẩm mới có khả năng đồng cố định nitơ phân tử, chúng
tốt nhất ở nhiệt độ 25-300C.
2. Quy trình phân lập.
Để có các chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập theo quy trình sau:

Cân chính xác các thành phần của môi trờng

Đun sôi, điều chỉnh pH=7
Cho vào 1/3 bình tam giác
Cho vào petri
Cấy dịch đà pha loÃng ở các nồng độ khác nhau
Dùng trang thuỷ tinh trang đều
Nuôi ở tủ ấm 300C trong 5-7 ngày
(Khi có các khuẩn lạc)
Quan sát và chụp ảnh