Nghiên cứu thành phần hóa học cây lá ngón ( gelsemium elegans benth , loganiaceae )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THANH PHÚC
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY LÁ NGÓN
( Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae)
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999-2004)
Người hướng dẫn : GS.TS. Phạm Thanh Kỳ
TS. Nguyễn Tiến Vững
Nơi thực hiện : Bộ môn Dược liệu
Phòng hoá pháp -
Thời gian thực hiện : 03/2004 - 05/2004
HÀ NỘI, THÁNG 6 - 2004
ỉ i êỉ^kĩểtì'nghiê m
/w \N ' .&>•
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
CNQG
Công nghệ Quốc gia
NXB
Nhà xuất bản
ĐHD
Đại học Dược
KHTN
Khoa học Công nghệ
KHKT
Khoa học Kỹ thuật.
Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
• GS.TS. Phạm Thanh Kỳ.
• TS. Nguyễn Tiến Vững.
những người đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn:

♦ Bộ môn dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội.
♦ Phòng Hoá pháp - Viện Kiểm Nghiệm.
♦ PGS. TS. Chu Đình Kính và cán bộ Phòng nghiên cứu Cấu trúc- Viện
hoá học, Trung tâm KHTN và CNQG.
♦ Cán bộ Phòng Phân tích hoá học và Phòng FUR- Viện hoá học,
Trung tâm KHTN và CNQG.
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thòi gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với cha mẹ, anh chị em và bạn
bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, tháng 6 năm 2004
Sinh viên
Phạm Thanh Phúc
1
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ: 3
PHẦN I: TỔNG QUAN 4
1.1. Đặc điểm thực v ậ t
4
1.2. Thành phần hóa học
.

5
1.3. Độc tính và tác dụng 8
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 13
2.1. Nguyên liệu 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu 13
PHẦN III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q UẢ 15
3.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học 15
3.2. Định tính alcaloỉd bằng sác ký lớp m ỏng

22
3.3. Định lượng alcaỉoỉd toàn phần 24
3.4. Chiết xuất và phân lập aỉcaloid 26
3.5. Nhận dạng chất V3 29
PHẨN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ

31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC
2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae) được coi là một
cây rất độc, mọc phổ biến ở các vùng rừng núi nước ta, trong dân gian còn cho
rằng chỉ ăn 3 lá là đủ chết người [14]. Lá, thân, rễ đều chứa chất độc có thể
gây chết người. Lá ngón không được nhân dân ta dùng làm thuốc mà dùng với
mục đích tự tử hay đầu độc, bên cạnh đó có trường hợp nhầm lẫn đã dẫn tới
nhiều vụ tử vong rất thương tâm.
Để góp phần kiểm định dược liệu, tiến tới giám định các vụ ngộ độc do
cây lá ngón và có thể tiến hành nghiên cứu dược liệu làm thuốc, chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học cây lá ngón (Gelsemium
elegans Benth., Loganiaceae)” với các nội dung sau:
> Định tính các nhóm chất trong các bộ phận rễ, thân, lá.
> Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng.
> Định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp acid- base.
> Chiết xuất và phân lập alcaloid chính trong cây.
> Nhận dạng alcaloid phân lập được.
3
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố.

Tên khoa học của cây lá ngón là Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae.
Còn gọi là: cỏ ngón, Đoạn trường thảo, Hồ mạn đằng, Câu vẫn, Thuốc rút
ruột, Ngón vàng [2], [4], [5], [10], [11], [17].
Đặc điểm thực vật: [2], [4], [9], [10], [14].
* Cây lá ngón là loại cây mọc leo, thân và cành không có lông, gỗ có
màu vàng, trên thân hơi có khía dọc.
* Lá mọc đối hình trứng, thuôn dài hay hơi hình mác, mép nguyên nhẵn
dài 7-12cm, rộng 2,5 đến 5,5cm.
* Hoa mọc hình xim ở đầu cành hay kẽ lá, cánh hoa màu vàng có thể có
hoa trắng [10], đài 5 lá đài rời. Tràng gồm 5 cánh hoa nhẵn, dính thành ống
hình phễu, nhị 5 đính ở phía dưới ống tràng. Đầu nhuỵ 4 thuỳ hình sợi. Mùa
hoa vào tháng 6 - 8 - 1 0 .
* Quả nang dài màu nâu, dài lcm rộng 0,5cm. Hạt nhỏ quanh mép có rìa
mỏng, màu nâu nhạt, hình thận.
* Về mặt cấu tạo giải phẫu theo tác giả Vũ Huyền Tình [17] đã nêu: Các
bộ phận cuả cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trưng:
+ Vi phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng, xếp
đứng, kích thước lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó gỗ.
Đặc điểm bột lá: có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào
tạo thành khối giống tinh thể canxi oxalat.
+ Vi phẫu thân và rễ: Mô mềm vỏ của thân có nhiều sợi gỗ thành dầy,
khoang hẹp, còn ở rễ thì hầu như không có sợi gỗ ở mô mềm vỏ. Các tia ruột
4
màng hoá gỗ chia gỗ ra từng bó ở phía ngoài, mô gỗ ở phía trong liên tục, tinh
thể canxi oxalat hình khối phân bố nhiều ở phần tia ruột cạnh libe của thân.
+ Đặc điểm bột thân và rễ có nhiều tế bào màng hoá gỗ kích thước lớn và
các sợi gỗ.
Phân bố: [2], [4], [9], [10], [14]
+ Tại Việt Nam: Mọc hoang phổ biến ở vùng rừng núi nước ta như Hà
Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình, Quảng

Ninh, Quảng Nam, Quảng Ngãi, và các tỉnh Tây Nguyên.
+ Trên thế giới: Lá ngón có ở một số nước vùng nhiệt đới châu Á (Trung
Quốc, Thái Lan). Ở Trung Quốc người ta thấy ở Phúc Kiến, Quảng Đông,
Quảng Tây, Vân Nam, Tứ Xuyên.
+ Và ở Bắc châu Mỹ có loài Gelsemỉum sempervirens và loài Gelsemium
rankinii.[ 28]
1.2. Thành phần hóa học
Theo các tài liệu của Đỗ Tất Lợi [14], Võ Văn Chi [5], Vũ Văn Chuyên
[4], Trần Công Khánh [11], [12] và các tài liệu [1], [8 ], [16] thì cây lá ngón
chứa nhiều alcaloid khác nhau :
- Từ loài Gelsemium sempervirens mọc ở Bắc Châu Mỹ [2] nhiều tác giả
đã chiết được các alcaloid: gelsemin( có tinh thể hình khối, nhiệt
độ nóng chảy là 178°, gelmicin (C1 9 H2 4 0 3 N2 ), sempervirin (C1 9 H1 6 N2), kumin
(C20H 22O N 2). ■ ■
- Năm 1931, Triệu Thừa Cố và các tác giả Trung Quốc [2], [14] chiết từ
rễ cây lá ngón các alcaloid:
Kumin C2 0 H2 2 ON2 độ nóng chảy 170°, D=-265°, dễ tan trong cồn, khó
tan trong ether, không tan trong ether dầu hoả và nước, tan trong acid sulfuric
5
cho dung dịch không màu, nếu thêm Mnơ2 sẽ chuyển màu tím nhạt nhưng
nếu thêm kalibicromat sẽ cho màu xanh vàng. Đây là thành phần chính của
cây lá ngón, chất này không độc lắm.
Kuminin vô định hình, không màu, dễ tan trong ether và trong nhiều
dung môi hữu cơ khác, khó tan trong nước, từ dung dịch ether để bốc hơi sẽ
cho chất có độ nóng chảy thay đổi nhưng trên 115°.
Kuminixin vô định hình, muối clohydrat tan trong nước có năng suất
quay cực trái. Kuminixin là chất có tác dụng chủ yếu và rất độc.
Kuminidin có tinh thể hình trụ không màu độ chảy 200° có thể tan
nhiều trong dung môi hữu cơ và nước. Chất này rất độc.
Hàm lượng của bốn alcaloid trên trong nguyên liệu là 0,3%-

Từ lá ngón Triệu Thừa Cố cũng lấy ra 4 alcaloid là gelsemin (chất này
rất độc, tác dụng vào tim), kumin, kuminin và một alcaloid mới đặt tên là
kaunide độ chảy là 315°. Muối clohydrat có độ chảy 318°, chất
alcaloid này có tác dụng làm yếu cơ và ức chế hô hấp. Ở cành và lá có
kuminin, gelsemin và chất tan trong nước là kumidin (C2 1 H2 4 0 5 N), ngoài ra
còn có sempervirin.
- Năm 1936 F. Guichard [2] nghiên cứu cây lá ngón mọc ở Việt Nam. Tác
giả đã chiết được kumin từ lá, vỏ thân, rễ cây và thấy kumin có cả trong quả
và hạt. Ngoài ra còn thấy một chất có huỳnh quang dưới đèn tử ngoại không
tan trong acid và ghi là chất thuộc nhóm esculetin (gelsemic hay acid
gelseminic).
Dù đã có những nghiên cứu về alcaloid nhưng việc phát hiện chất độc
trong lá ngón khi bị ngộ độc còn khó khăn, vì phản ứng đặc hiệu tiến hành
trên những chất lấy được ở cơ thể người bị ngộ độc, nhất là khi chỉ ăn có 3 lá
là một việc không dễ dàng.
6
- Năm 1953, M.M Janot [2] xác định lá ngón Việt Nam có chứa gelsemin
ở lá, kumin ở thân, rễ và sempervirin ở các bộ phận của cây.
- Năm 1971, Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi, và Lương Văn Thịnh [2],
chiết được một alcaloid từ rễ cây lá ngón mọc ở Hòa Bình. Đã đo quang phổ
tử ngoại, hồng ngoại và dự kiến alcaloid đó là kumin.
- Năm 1974, [6 ], trong công trình “ Nghiên cứu về mặt Hoá thực vật,
Dược lý và Độc học của loài Gelsemium elegans mọc ở miền Bắc Việt Nam”
của Hoàng Như Tố không thấy có sự song song tồn tại của 2 alcaloid gelsemin
và kumin trong lá hoặc trong rễ, và qua công trình nghiên cứu đã kết luận là
gelsemin chỉ có ở lá, kumin chỉ có ở rễ, nghiên cứu công thức hoá học của
gelsemin và kumin tác giả cho rằng kumin là một alcaloid có nhân indol được
tạo nên ở rễ, khi chuyển lên lá qua quá trình quang hợp đã chuyển thành
gelsemin. Theo tác giả, loài Gelsemium elegans cho gelsemin ở lá, có thể
dùng alcaloid rất ít độc để làm thuốc giảm đau đặc biệt khi kết hợp với các

thuốc giảm đau không gây nghiện (aspirin, antipirin).
- Năm 1977, Hoàng Như Tố và cộng sự [2] đã phân tích bằng sắc ký lớp
mỏng thấy có 15 vết alcaloid ở lá ngón, trong đó đã tách được gelsemin và
kumin.
- Còn theo M. Chon [18] lá ngón có 4 alcaloid độc là Kumin, Kuminidin,
Kuminin và Kuminixin, các chất này rất độc, tác dụng dược lý chưa được
nghiên cứu kỹ, chỉ biết rằng uống 2-3 lá tươi cũng đủ gây ngộ độc.
Cấu trúc phân tử của một số alcaloid tách được trong cây ngón[27], [28]:
7
OH
Gelsemoxữnin
Ộ -" V
m m
è m m ' " ^
ti4feơì{^M9(^ii$!CKygei$ẽỉỆgí?i Konnin
ii-MetmxyieisefnaintQ
Gelsenicin
3. Độc tính và tác dụng.
- Ở Việt Nam: Các alcaloid của cây lá ngón có độc tính rất mạnh. Nhân
dân ta không dùng cây này làm thuốc mà chỉ dùng để đầu độc hay tự tử,
nhưng cần biết để tránh lấy lẫn vào những cây thuốc khác, gây độc chết
người.[2], [14]
8
- Ở Trung Quốc, người ta dùng để chữa mụn nhọn độc, chữa hủi, hay chữa
nấm tóc và chữa vết thương do ngã hay bị đánh đòn. Cách dùng: giã nhỏ đắp
ngoài hay sắc lấy nước rửa chỗ đau [2 ].
- Ngoài ra ở Trung Quốc và Bắc Mỹ người ta dùng rễ chữa bệnh động kinh
và giảm đau nhưng cũng rất ít dùng.[2 0 ]
- Theo tài liệu trên mạng internet: Lá ngón ở châu Á, được thử test trên
động vật thấy alcaloid có tác dụng giảm đau và chống viêm, nhưng ở liều chết

alcaloid gây co giật, dẫn đến suy hô hấp và chết. Còn lá ngón ở Bắc Mỹ
(Gelsemium sempervirens) được sử dụng làm thuốc (trên thị trường Mỹ có
một số biệt dược như: Gelsem semp. 6 X, Gelsemium - 30 X 84 pill ) chữa
bệnh đau đầu, rối loạn thần kinh, tê liệt, cảm sốt, đau mình mẩy
Ngộ độc: nạn nhân thấy khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa,
hôn mê, giãn đồng tử, ngạt hô hấp các cơ mềm nhũn, đau bụng dữ dội, chảy
máu dạ dày, một, sùi bọt mép, hạ thân nhiệt, hạ huyết áp, hô hấp chậm rồi
chết.[8 ], [12], [14]
Xét nghiệm độc chất', acid sulfuric và kali bicromat cho màu ve sẫm với
gelsemin và mầu tím với kumin [8 ].
Cấp cứu: phải lập tức sử dụng phương pháp tổng hợp, để cấp tốc loại chất
độc ra khỏi cơ thể, lúc đầu rửa dạ dày, duy trì nhiệt độ, hô hấp nhân tạo, dùng
thuốc kích thích, đồng thời tùy từng hiện tượng mà xử lý cho phù hợp.
Một số kinh nghiệm cứu chữa trong dân gian:
+ Theo kinh nghiệm cổ truyền [14] thì cho uống thật nhiều nước sắc cam
thảo. Tiêm truyền huyết thanh mặn hay ngọt, giữ cơ thể ấm. Hạ huyết áp thì
tiêm ephedrin. Khó thở thì tiêm niketamid, cho thở oxy hoặc làm hô hấp nhân
tạo. Đau bụng thì dùng thuốc giảm đau.
9
+ Theo Võ Văn Chi [4]: dùng mỡ lợn hoặc dầu lạc để uống hoặc dịch chiết
rau má và rau muống để làm hồi tỉnh lại.
+ Theo tài liệu của Phạm Thiệp [16]: Trong điều kiện cấp bách có thể cho
nôn mửa, cho uống dung dịch tanin 3-5% hay dung dịch kali permanganat
1/2000.
+ Cho uống máu dê tươi 200-300 ml (cơ chế giải độc chưa rõ nhưng người
ta nghĩ rằng con dê ăn nhiều lá ngón không chết thì trong máu nó có chất
chống độc lá ngón).
+ Cũng có thể cho uống nước sắc lá và hoa kim ngân
+ Theo tài liệu Lê Trần Đức[9]: Cho uống nước đái (đái thẳng vào miệng
bệnh nhân).

+ Cho uống tiết vịt trắng, tiết ngan (cắt tiết dốc vào miệng bệnh nhân).
Theo tài liệu của Đỗ Tất Lợi[14], trong cây lá ngón ở Bắc Mỹ, thành phần
chủ yếu là gelsimin có độc tính rất mạnh, với liều thấp trên động vật có vú,
trước khi thấy hiện tượng ức chế hô hấp thường thấy một thời kỳ hưng phấn
ngắn.
Trong cây lá ngón của ta và Trung Quốc có thành phần khác với lá ngón ở
Bắc Mỹ nhưng tác dụng của những alcaloid này có nhiều phần giống nhau.
Chất kumin và kuminin ít độc hơn, gần giống tác dụng của gelsemin, chất
kuminixin rất độc nhưng chất gelsemixin độc hơn Nhỏ dung dịch gelsemin
và gelsemixin lên mắt thì thấy hiện tượng giãn đồng tử còn kumin và kuminin
không làm giãn đồng tử .
Hoàng Như Tố còn kiểm tra truyền thuyết của dân gian nói: “chỉ cần ăn 3
lá ngón là đủ chết" đồng thời tìm cơ chế tác dụng của lá ngón để tìm cách
chống độc có hiệu quả đã đi tới kết luận sau:
1 0
- Liều độc: Liều độc LD5 0 đối với chuột nhắt trắng của rễ là 102mg/kg thể
trọng (rễ chiết bằng cồn 90°), của lá là 600mg/kg (lá tươi chiết bằng nước),
200mg/kg (lá khô chiết bằng nước),150mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 70°),
89mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 90°), của alcaloid toàn phần chiết từ lá khô là
200mg/kg trong khi đó của gelsemin là 140mg/kg và kumin thì không độc.
Như vậy lá ngón có độc nhưng không đến mức 3 lá đủ chết người như dân
gian thường nói.
- Tác dụng độc của lá ngón không đặc hiệu trên hệ thống thần kinh, gây
nên co giật và chết do ngừng hô hấp trong một trạng thái thiếu oxy rõ rệt.
- Nghiên cứu về mặt chống độc cho phép kết luận cơ chế tác dụng của các
hoạt chất của cây lá ngón chủ yếu vào các men hô hấp gây sự rối loạn trong tế
bào dẫn tới sự thiếu oxy nghiêm trọng gây nên các hiện tượng co giật cơ và
liệt cơ. Phương hướng dùng các thuốc ngăn cản sự ức chế men và bảo trợ men
đã dẫn tác giả tìm ra được tính chống độc của ATP. Khi dùng ATP để ngăn
ngừa cũng như điều trị ngộ độc bằng lá ngón đã giảm tỷ lệ chết của chuột nhắt

xuống từ 58% còn 25% đã cứu được tất cả các thỏ làm thí nghiệm khi đã bị
ngộ độc bằng liều chết của lá ngón.
11
M
Q .
e
V
Ml
i
-f
l i j
j -
o
Hình 1: Lọ thuốc được sản xuất từ Gelsemium sempervừens
1 2
PHẦN n . NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
- Nguyên liệu là rễ, thân và lá của cây lá ngón có hoa, thu hái tại tỉnh Sơn
La vào tháng 8/2003 .[Hình 2,3]- GS. Vũ Văn Chuyên đã xác định tên khoa
học của mẫu nghiên cứu là: Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae.
- Nguyên liệu sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi khô, sau đó sấy khô ở
nhiệt độ 50° - 60° và được bảo quản trong túi polyetylen kín.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
* Định tính các nhóm chất trong rễ, thân, lá theo các tài liệu: Bài giảng
dược liệu[2], Thực tập dược liệu[3], Phương pháp nghiên cứu hoá học cây
thuốc [7].
* Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng bằng bản mỏng silicagen 60
F2 5 4 (Merck)
* Định lượng alcaloid toàn phần trong cây theo phương pháp acid - base.

* Xác định độ ẩm trên máy Sartorius (Germany) tại Bộ môn dược liệu.
* Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột.
* Đo phổ u v trên máy GBC Instrument - 2855 phòng Phân tích Viện hoá
học, trung tâm KHTN và CNQG.
* Đo IR dưới dạng viên nén KBr trên máy Impact 410 (FTIR)( hãng
Nicolet) tại Viện hoá học, trung tâm KHTN và CNQG.
* Đo phổ khối trên máy 5989B- MS tại phòng Cấu trúc Viện hoá học,
Trung tâm KHTN và CNQG.
13
Hình 2: Mẫu hoa tươi của cây lá ngón.
Hình 3: Cành mang hoa và rễ khô của cây lá ngón
PHẦN III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT TRONG RỄ, THÂN, LÁ CỦA
CÂY LÁ NGÓN.
3.1.1. Định tính alcaloỉd
Cân khoảng lOg bột dược liệu đã được sấy khô cho vào bình nón dung tích
250ml. Thấm ẩm đều bằng dung dịch NH4 OH 10%. Để yên 60 phút. Thêm
vào 50ml CHCI3 , lắc 5-> 10 phút rồi để yên qua đêm, lọc. Lấy dịch lọc cho vào
bình gạn, thêm 10ml HC1 5%, lắc 2 -^3 phút, gạn lấy phần acid để làm phản
ứng. Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết.
■ Ống 1 : Thêm 2-3 giọt TT Mayer -* Có tủa trắng
■ Ống 2: Thêm 2-3 giọt TT Dragendroff -*■ Có tủa đỏ gạch.
■ Ống 3: Thêm 2-3 giọt TT Bouchardat -► Có tủa đỏ nâu
-*• Phản ứng dương tính.
Nhận Xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón đều có alcaloid
3.1.2 Định tính f ĩavonoid:
Lấy khoảng lOg dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml thêm 50ml
ethanol 90° đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc nóng. Dịch lọc dùng vào các
phản ứng sau:
- Phản ứng Cyanidin

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm thêm một ít bột Mg kim loại sau đó
cho từng giọt HC1 đặc (3-5 giọt), để yên một vài phút không thấy dung dịch
chuyển màu.(Phản ứng âm tính).
15
- Phản ứng với kiềm:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ dung dịch
amoniac đặc đã mở nút, màu vàng của dịch chiết không tăng lên. (Phản ứng
âm tính).
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5% có
hiện tượng tạo tủa xanh đen.(Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Trong rễ, thân và lá cây lá ngón không có flavonoid.
3.1.3. Định tính coumarin:
Cho 5g bột dược liệu vào cốc, thêm 50ml cồn 90°, đun cách thuỷ cho sôi
vài phút, lọc qua giấy lọc. Dịch chiết thu được tiến hành làm các phản ứng
sau:
• Phản ứng mở - đóng vòng lacton:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ống lml dịch chiết ở trên,
ống 1: Thêm lml dung dịch NaOH 10%
ống 2: Để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi rồi để nguội. Quan sát:
ống 1: Có màu vàng
ống 2 : Vẫn trong
Thêm vào cả hai ống mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều. Quan sát:
ống 1: Đục hơn ống 2
ống 2 : Vẫn trong suốt
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HC1 đặc thì thấy ống 1 vẫn đục như ban đầu.
(Phản ứng âm tính).
16
• Phản ứng diazo hoá:

Cho vào Ống nghiệm nhỏ lml dịch chiết, kiềm hoá bằng NaOH 10%,
đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt TT Diazo mới pha. Dung
dịch trong ống nghiệm không chuyển sang màu hồng hay tím đỏ. (Phản ứng
âm tính).
t
• Vi thăng hoa:
Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng kim loại, đậy lên trên một
phiến kính nhỏ có bông tẩm nước lạnh ở trên. Đốt nóng bằng đèn cồn trong 15
- * 2 0 phút. Lấy phiến kính ra để nguội, nhỏ \-*2 giọt dung dịch KI. Soi trên
kính hiển vi không thấy tinh thể nâu sẫm hay tím. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có coumarin.
3.1.4. Định tính tanin:
Lấy 3 gam bột dược liệu, cho vào cốc. Thêm 20ml nước cất, đun sôi vài
phút rồi lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
• Phản ứng với FeCl3 5%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm H 2 giọt FeCl3 5%, thấy xuất
hiện tủa xanh đen.(Phản ứng dương tính).
• Phản ứng với dung dịch gelatin 1%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vào vài giọt dung dịch gelatin
1% thấy xuất hiện tủa bông.(Phản ứng dương tính).
f W k 1 0 - ^ '
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón có tanin. fịf/ A'
3.1.5. Định tính acid hữu cơ: V Y-U *
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết nước vài tinh thể Na2 C 03, ừĩắyxƠDỌt
khí nổi lên rất rõ. (Phản ứng dương tính).
3.1.6. Định tính antranoỉd:
Phản ứng Bomtraeger:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 15ml H2 S04
10%. Đun cách thuỷ trong 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với
ether ethylic trong H 2 phút, để yên cho tách thành 2 lớp. Loại phần nước,

cho vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10%. Lắc thấy lớp ether có màu
vàng nhạt. Thêm vào đó dung dịch H2 0. Lắc đều, đun cách thủy vài phút dung
dịch trở nên không màu.(Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có antranoid.
3.1.7. Định tính Saponin:
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho 5 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh trong 5
phút. Không thấy có nhiều bọt xuất hiện và bền vững sau 15 phút. (Phản ứng
âm tính)
Nhận xét: Trong rễ thân lá của cây lá ngón không có saponin.
3.1.8. Định tính đường khử:
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml cồn, đun cách
thuỷ 10 phút, lọc, cho lml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 3 giọt thuốc
thử Feling A và 3 giọt thuốc thử Feling B. Đun cách thuỷ 10 phút thấy có tủa
đỏ gạch. (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón có đường khử.
3.1.9. Định tính chất béo:
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón có acid hữu cơ.
18
Nhỏ dịch chiết chloroform lên giấy lọc, hơ khô. Không để lại vết mờ trên
giấy lọc. (Phản ứng âm tính).
Nhận xétĩ Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có chất béo.
3.1.10. Định tính Sterol:
Lấy khoảng 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm
40ml cồn 25°. Ngâm 24 giờ, gạn dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% đến
dư, lọc bỏ tủa, lắc dịch lọc với chloroform 2 lần (mỗi lần 1 0 ml trong một bình
gạn). Gạn lớp chloroform làm phản ứng:
+ Phản ứng Salkopskị: Trong ống nghiệm nhỏ cho khoảng 2ml
chloroform. Thêm từ từ lml H2 S04 đặc (nghiêng ống nghiệm 45°) cho chảy từ
từ dọc theo thành ống nghiệm để có phân lớp. Thấy có xuất hiện vòng đỏ thắm

trên bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng (Phản ứng dương tính)
+ Phản ứng Liebermann: Trong ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết
chloroform. Bốc hơi cách thuỷ đến khô. Hoà tan cắn bằng 2ml anhydrid
acetic, lắc đều, đặt ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ lml H2 S04 theo thành
ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp, ở mặt tiếp xúc
giữa hai lớp chất lỏng có xuất hiện vòng tím đỏ. (Phản ứng dương tính).
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá cây lá ngón có sterol.
3.1.11. Định tính glycosỉd tim:
Cho lOg dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 80ml cồn 25° ngâm
24 giờ, gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% dư, lọc bỏ
tủa, dịch lọc cho vào bình gạn và lắc kỹ 2 lần với chloroform (mỗi lần 2 0 ml),
gạn dịch chloroform vào cốc thuỷ tinh khô bốc hơi cách thuỷ đến khô. cắn
được hoà tan trong cồn 90°, dịch chiết cồn để làm các phản ứng định tính
glycosid tim.
19
+ Phản ứng Legal: Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung
dịch Natri Nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, không thấy xuất
hiện mầu hồng.(Phản ứng âm tính)
+ Phản ứng Baljet:
. Chuẩn bị thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to lml acid picric 1%
và 9 ml dung dịch NaOH 10% lắc đều.
. Làm phản ứng: Cho lml dịch chiết trong cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ,
nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet vừa mới pha vào ống nghiệm. Không thấy xuất
hiện màu.(Phản ứng âm tính).
+ Phản ứng Liebermann: Trong ống nghiệm nhỏ, cho 2ml dịch chiết trong
cồn. Cô cạn cồn, rồi hoà tan cắn bằng 2ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt ống
nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ H2 S04 theo thành ống nghiệm để dịch lỏng
trong ống nghiệm chia thành 2 lớp, ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng có
xuất hiện vòng tím đỏ.(Phản ứng dương tính)
+ Phản ứng Keller - Kiliani: Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, cho vào

đó lml FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều, nghiêng ống nghiệm, cho đồng
lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm. Không thấy xuất hiện vòng
tím đỏ giữa 2 lớp phân cách.(Phản ứng âm tính.)
Nhận xét: Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có glucosid.
3.1.12. Định tính acid attiỉn:
Trong một ống nghiệm nhỏ cho 2ml dịch chiết nước, thêm vào 3 giọt
thuốc thử Ninhydrin 3% trong ethanol. Đun cách thuỷ 5-10 phút, không thấy
xuất hiện màu xanh tím.(Phản ứng âm tính).
Nhận xét:Trong rễ, thân, lá của cây lá ngón không có acid amin.
Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ, thân, lá được tóm tắt ở bảng 3.1.
2 0
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây lá ngón.
TT
Nhóm chất
Phản ứng định tính
Kết quả
Kết luận
Rễ
Thân Lá
1
Alcaloid
Thuốc thử Dragendorff
+++ ++ ++
Có
Thuốc thử Mayer
+++ ++ ++
Thuốc thử Bouchardat
+++ ++ ++
2
Flavonoid

Phản ứng Cyanidin
- - -
Không có
Phản ứng với kiềm
- -
-
Thuốc thử FeCln 3% / cồn
+
+ +
3
Glycosid
tim
Phản ứng Liebermann
+
+
Không có
Phản ứng Baljet
-
- -
Phản ứng Legal
_
- -
Phản ứng Keller - Kiliani
-
- -
4
Đường khử
Thuốc thử Fehling A+ B
+ + + Có
5

Coumarin
Thuốc thử Diazo
- _
_
Không có
Phản ứng mở đóng vòng lacton
_
- -
Vi thăng hoa
-
-
-
6
Tanin
Thuốc thử gelatin 1%
+ + + Có
Thuốc thử F ed , 5%
+ + +
7
Saponin
Hiện tượng tạo bọt
- - -
Không có
8
Acid hữu cơ
Bột Na,CO.(
+ +
+
Có
9

Anthranoid
Phản ứng Bomtraeger
-
-
-
Khôngcó
1 0
Sterol
Phản ứng Liebermann
+ + + Có
Phản ứng Salkopski
+ +
+
1 1
Chất béo
Vết mờ trên giấy lọc
- - -
Không có
1 2
Acid amin
Thuốc thử Ninhydrin 3%
-
-
-
Không có
2 1
Kết luận: Qua các phản ứng định tính ở trên ta thấy trong rễ, thân và lá
của cây lá ngón đều có các nhóm chất: Alcaloid, đường khử, tanin, acid hữu
cơ, sterol.
3.2. ĐỊNH TÍNH ALCALOID BANG SẮC KÝ LỚP MỎNG.

Làm định tính alcaloid trên 3 bộ phận: rễ, thân, lá của cây lá ngón bằng
sắc ký lớp mỏng.
* Chuẩn bị bản mỏng
Dùng bản mỏng Silicagen 60 F2 5 4 (Merck) đã tráng sẵn, hoạt hoá trong tủ
sấy ở 105° trong 1 giờ.
* Chuẩn bị dịch chấm sắc ký
Cân lOg bột dược liệu làm ẩm bằng NH4OH 10% trong lh cho vào bình
nón dung tích 250ml, cho 50ml CHC13, ngâm qua đêm, lọc, lấy dịch lọc cô
còn khoảng 5ml đem chấm sắc ký.
* Tiến hành:
Chấm cùng lượng dịch chiết lên các bản mỏng đã chuẩn bị rồi khai triển
bằng 2 hệ dung môi sau:
Hệ I : Chloroform : methanol: amoniac đặc [ 50 : 9 : 1 ]
Hệ I I : Toluen : aceton: ethanol: amoniac đặc [45:45:7:3]
Sau đó phun hiện mầu bằng thuốc thử Dragendorff. Sấy khô. Trên bản
sắc ký xuất hiện các vết có màu từ vàng nhạt đến vàng đậm. So sánh thấy hệ II
tách tốt vì số lượng các vết xuất hiện nhiều và khoảng cách các vết ở xa
nhau,[Hình 4].
2 2
lị ’< tr írt I
t
# *
# 6
V # 5
*
I
I
ị
! A
Hình 4: sắc ký đồ của rễ, thân, lá.

Bảng 3.2: Kết quả định tính alcaloid bằng SKLM.
TT
Rễ Thân
Lá
Rf
Độ đậm vết Rf
Độ đậm vết
Rf
Độ đậm vết
VI
0,044
+ 0,044
+
0,044
+
V2
0,083
+
0,083
+
0,083
+
V3 0,389
++
0,389
++
0,389
++
V4 0,522
++ 0,522

++
0,522
++
V5 0,583
+++
0,583
+++ 0,583 +++
V6
0,628
+++ 0,628
+++
0,628
+++
V7
0,706
++++
0,706
++++ 0,706
++++
V8
0,822
+
Chú giải: + : vàng nhạt +++: vàng đậm
++ : vàng ++++: vàng rất đậm
23