Nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc phụ tử trồng hái ở sapa

Bộ Y tê
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
HOÀNG MINH PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA VỊ THUỐC PHỤ TỬ TRỒNG Ở SAPA
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 1999-2004)
Người hướng dẫn: Tiến sĩ. Phùng ĩ
Dược sĩ. Vũ Chí Nguyễn
Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền
Đại học Dược — Viện Dược liệu
Thời gian thực hiện: 1-3-2004 đến 28-5-2004
Hà Nội, tháng 5 - 2004
ỳrsi. u
LÒI CẢM ƠN
Với nỗ lực của bản thân và sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của các thầy
cô, gia đình, bè bạn, tôi đã hoàn thành khóa luận của mình trong thời gian
quy định.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sỹ Phùng Hòa Bình, Thạc
sỹ Bùi Hồng Cường và Dược sỹ Vũ Chí Nguyễn đã tận tình hướng dẫn tôi
hoàn thành khóa luận của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên trong
Bộ môn Dược học cổ truyền Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời
gian làm thực nghiệm.
Tôi hết sức cảm ơn Tiến sỹ Phạm Văn Thanh (Trưởng khoa) và các cô,
các chú, các chị trong Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu đã luôn luôn giúp
đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bè bạn, những
người đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài này.
Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2004
Sinh viên
Hoàng Minh Phương

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1: TổNG QUAN 2
1.1- Đặc điểm thực vật của chi Aconitum
2
1.1.1- Vị trí phân loạ i 2
1.1.2- Phân bố 2
1.1.3- Đặc điểm thực vật 2
1.1.4- Bộ phận dùng 3
1.2- Thành phần hóa học:

6
1.2.1- Thành phần hóa học 6
1.2.2- Cấu trúc hóa học 6
1.2.3- Tính chất của aconitin và sản phẩm thủy phân 9
1.2.4- Định lượng alcaloid toàn phần và aconitin
9
1.3- Tác dụng sinh học 10
1.4- Tác dụng và công dụng của phụ tử: 12
1.4.1- Phụ tử sống 12
1.4.2- Phụ tử chế: 12
1.5- Một số phương thuốc cổ truyền có v| thuốc phụ tử 13
1.5.2- Bát vị quế phụ 13
1.5.3- Một số phương thuốc cổ truyền khác: 14
1.6- Một số phương pháp chế biến 14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15
■ ■
2.1- Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu và phương pháp thực
nghiệm 15

2.1.1- Nguyên liệu: 15
2.1.2- Phương tiện nghiên cứu 16
2.1.3- Phương pháp nghiên cứu 16
2.2- Thực nghiệm và kết quả 17
2.2.1- Nghiên cứu định tính
17
2.2.2- Định lượng alcaloỉd toàn phần 27
2.3- Bàn luận:

30
2.3.1- Định tính: 30
2.3.2- Định lượng: 30
PHẦN 3: KÊT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
33
1- Kết luận 33
1.1- Thành phần hóa học: 33
1.2- Phân tích alcaloid bằng SKLM: 33
1.3- Định lượng alcaloỉd toàn phần: 33
2- Đề xuất: 34
ĐẶT VẤN ĐỀ
Phụ tử - một vị thuốc quý trong 4 đầu vị của y dược học cổ truyền
“sâm, nhung, quế, phụ”, có tác dụng cải tử hoàn sinh, từ lâu đã được các nhà
khoa học Trung Quốc nghiên cứu và sử dụng.
Vào những năm 1970-1990, Giáo sư - Tiến sỹ Phạm Thanh Kỳ và các
cộng sự đã nghiên cứu về thực vật, chế biến, hóa học và thử một số tác dụng
sinh học của cây ô đầu Việt Nam, tên khoa học là Aconitum Fortunei [9].
Sau chiến tranh biên giới (1979), cây ô đầu - phụ tử bị triệt phá và mất
giống hoàn toàn. Nhân dân Sapa phục hồi lại giống ô đầu - phụ tử không rõ
nguồn gốc. Gần đây, một số nhà khoa học của Việt Nam đã nghiên cứu về
một loài phụ tử ở Sapa có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx. Họ

Ranumculaceae [1].
Với mục tiêu xác định sự có mặt của các thành phần hóa học có trong
phụ tử Sapa cũng như sự thay đổi của hàm lượng alcaloid toàn phần trong
giai đoạn có thể thu hoạch củ qua các thời kỳ trước, trong và sau thời kỳ ra
hoa, ra quả của cây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu vị thuốc phụ tử Sapa với
các nội dung sau:
Định tính các nhóm chất hóa học trong phụ tử sống
Định lượng alcaloid toàn phần của phụ tử ở một số thời điểm
phát triển của cây.
PHẦN 1: TổNG QUAN
1.1- Đặc điểm thực vật của chi Aconitum
1.1.1- Vị trí phân loại [4]
Chi Aconitum thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên
(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsita), ngành Ngọc Lan
(Magnoliophyta).
1.1.2- Phân bô
Chi Aconitum có khoảng 300 loài [5] phân bố chủ yếu ở các vùng cận
nhiệt đới và ôn đới châu Âu, châu Á, Bắc Mỹ, có nhiều nhất ở Trung Quốc
(167 loài) [26].
Âu ô đầu (Aconitum napellus và Aconitum spp.) mọc hoang và trồng
ở châu Âu [2].
Ô đầu Trung Quốc (Aconitum carmichaeli, Aconitum chinense,
Aconitum spp.) mọc hoang và trồng ở các vùng Tứ Xuyên, Quý Châu, Vân
Nam, Thiểm Tây, Cam Túc (Trung Quốc) [2].
Ô đầu Việt Nam mọc hoang và được trồng ở các vùng núi cao như Hà
Giang, Lào Cai (Sapa) [2], [7].
1.1.3- Đặc điểm thực vật
Chi Aconitum: cây thảo, sống lâu năm, thân thẳng hoặc leo, gốc
thường nạc, hình củ, nhiều loài có củ mẹ hỗn hợp giữa rễ củ và thân [26].
Lá thùy hoặc xẻ chân vịt, ít khi nguyên.

Cụm hoa thường mọc thành chùm ở ngọn cành hoặc nách lá. Hoa
không đều, xanh nhạt hoặc vàng nhạt, có cuống, bao hoa dạng tràng, 5 cánh
đài không đều, cánh trên thường có hình mũ, cánh dưới hình trái xoan hoặc
2
mũi mác bé hơn, cánh đài bên hình trái xoan ngược không dối xứng, móng
rộng. Tuyến mật dạng cánh hoa nằm trong mũ rất phát triển, hai cánh hoa ở
trên dạng mũ, thường có móng dài mang các tuyến nằm trong mũ, nhị nhiều,
chỉ nhị có răng hoặc không, có nhiều lông hoặc nhẵn, 3-5 lá noãn, nhiều
noãn [26].
Quả phức gồm 3-5 nang nhỏ. Hạt nhiều, bề mặt sần sùi, có nếp nhăn
[26].
Ô đầu [2]:
Cây ô đầu thuộc loại cỏ, mọc hàng năm, cao chừng 0,6-lm, rễ phát
triển thành củ có hình nón, thân mọc thẳng đứng, có ít cành. Lá mọc so le,
hình dáng, kích thước lá có khác nhau chút ít tùy theo loài:
+ Aconitum napellus: lá xẻ chân vịt gần như lá ngải cứu, mặt trên màu
xanh sẫm, mặt dưới màu nhạt hơn [2], [13].
+ Aconitum carmichaeli: phiến lá rộng 5-12cm, xẻ thành 3 thùy, 2
thùy 2 bên lại xẻ làm 2, thùy giữa xẻ làm 3 thùy con, mép các thùy đều có
răng cưa thô, to [2], [13]
+ Aconitum íortunei: lá hình mắt chim [13], xẻ thùy hình chân vịt [8]
thành 3 thùy không đều, mép các thùy có khía răng cưa nhọn [2], [8], [9];
thùy hơi hình trứng dài, có răng cưa ở nửa trên [13]
Hoa lưỡng tính, không đều, có màu xanh lơ thẫm hay xanh tím mọc
thành chùm ở ngọn thân. Có 5 lá đài, trong đó có một cái khum thành hình
mũ. Quả có 5 đại mỏng. Hạt có vẩy [2].
1.1.4- Bộ phận dùng
Rễ củ: Củ cái gọi là ô đầu, chỉ được dùng ngoài, củ nhánh gọi là phụ
tử được chế biến thành phụ tử chế để dùng trong.
3

5
1.2- Thành phần hóa học:
Trong số khoảng 100 loài mọc ở vùng ôn đới, 35 loài đã được nghiên
cứu về thành phần hóa học [17].
1.2.1- Thành phần hóa học
- Hoạt chất trong rễ củ của Aconitum chủ yếu là các alcaloid [2], [17].
Hàm lượng alcaloid thay đổi tùy theo loài và thời kỳ thu hái [2], [10].
+ Aconitum napellus chứa 0,2-3% alcaloid toàn phần. Trong đó,
aconitin chiếm tới 85-90% [2]. Ngoài ra còn có benzoylaconin, aconin,
napellin, neopellin, magnoflorin, hypaconitin, và có vết spartein, ephedrin
[2].
+ Aconitum carmichaeli chứa 0,32-0,77% alcaloid toàn phần, trong đó
có hypaconitin, aconitin, mesaconitin, jesaconitin, atisin, kobusin, ignavin,
songorin, hygenamin, corynein, yokonosid [2]; karakolin [19], uracil, neolin,
fuzitin, neojiangyouaconitin [25]; benzoyl mesaconitin [24]; chuan-wu base
A, chuan-wu base B [11].
+ Aconitum fortunei đối với cây trồng ở Sapa (Lào Cai) alcaloid toàn
phần ở cụ mẹ: 0,36-0,80%, củ con: 0,78-1,17% [2], [10]. Cây trồng ở Hà
Giang có alcaloid toàn phần ở củ con: 0,63%. Trong ô đầu Việt Nam có
aconitin, hypaconitin và còn ít nhất 8 vết hiện màu với thuôcs thử
dragendorff trên sắc ký lớp mỏng nhưng chưa phân lập được để xác định cấu
trúc hóa học [2].
Ngoài alcaloid, trong ô đầu phụ tử còn có acid hữu cơ (acid aconitic,
acid citric, acid maltic ), tinh bột, đường, muối vô cơ [2].
1.2.2- Cấu trúc hóa học
6
- Các aconit alcaloid có tác dụng sinh học đặc trưng hầu hết là các
alcaloid có khung diterpen được phân thành 3 nhóm [18]:
+ Nhóm 1: các alcaloid có 2 nhóm chức esther gắn vào khung diterpen

+ Nhóm 2: các alcaloid có 1 nhóm chức esther gắn vào khung diterpen
+ Nhóm 3: các alcaloid không có nhóm chức esther gắn vào khung
diterpen
Công thức cấu tạo của một số alcaloid:
ACONITIN NAPELLIN
N-DESACETYLLAPPACONITIN
7
DELSOLÈN
LYCACONITIN PERCHLORAĨ
o
SONGORÍN
ATISIN ỉ GNAVIN ỈGNÂVIN
8
1.2.3- Tính chất của aconitỉn và sản phẩm thủy phân:
Aconitin trong môi trường nước dễ bị thủy phân thành benzoylaconin
và acid actic. Benzoylaconin chỉ bằng 1/400-1/500 aconitin; độ độc của
aconin bằng khoảng 1/10 benzoyl aconin [2].
Aconitin (Acetylbenzoylaconin C34H47NOu) là alcaloid có trong
tất cả các loài thuộc chi Aconitum: M = 645,75 đvC; t°nc = 204°C; [a] D =
+17,3° (cloroform); lg tan trong 2ml cloroform, 7ml benzen, 28ml cồn tuyệt
đối, 50ml ether, 3.300ml nước, ít tan trong ether dầu hỏa [23].
Aconin (C25H41N 0 9) dạng bột vô định hình, vị cay tê. M = 449
vđC; t°nc = 132°C; [a] D = +23°. Tan tốt trong nước và cồn, tan vừa trong
cloroform, ít tan trong benzen, rất ít tan trong ether và ether dầu hỏa [23].
1.2.4- Định lượng alcaloỉd toàn phần và aconitin:
1.2.4.1- Định lượng alcaloid toàn phần
- Theo phương pháp của Dược điển Việt Nam in [5]:
Kiềm hóa mẫu, chiết alcaloid dạng base bằng dung môi hữu cơ có độ
phân cực thấp như chloroform, ether. Chuẩn độ bằng dung dịch HC1 0,1N.
Chỉ thị là hỗn hợp đỏ methyl và xanh methylen.

lml dung dịch HC1 0,1N tương ứng với 64,6mg alcaloid toàn phần tính
theo aconitin.
9
Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo công thức:
x% = 0.0646.Ĩ1.100
p
p: khối lượng dược liệu khô kiệt tương ứng đem định lượng (khoảng
4g)
n: số ml HC1 0,1N đã dùng
Định lượng theo phương pháp của Dược điển Trung Quốc [22]:
Khi kiềm hóa 1 lượng bột đã cân chính xác bằng amoniac đặc, sau đó
chiết kiệt bằng dung môi EteOH:CHC13 (3:1). Định lượng bằng H2S04
0,01M. Chỉ thị là đỏ methyl.
Iml dung dịch H2S04 0,01M tương đương với 12,9mg aconitin.
Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo công thức:
x%= n.12.9
p.10
p: khối lượng dược liệu khô kiệt tương ứng đem định lượng (khoảng
10g)
n: số ml H2S04 0,0IM
1.2.4.2- Định lượng aconitin:
Phương pháp SKLM [10] định lượng aconitin: Dùng SKLM tách
aconitin ra khỏi hỗn hợp ancaloid, sau đó đem đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước
sóng 273nm. Căn cứ vào đường chuẩn của aconitin mẫu suy ra hàm lượng
aconitin có trong các mẫu đó.
1.3- Tác dụng sinh học
Các alcaloid trong phụ tử đóng vai trò rất quan trọng trong tác dụng
sinh học của phụ tử.
- Tác dụng trên hệ tim mạch:
10

+ Tác dụng trợ tim, cường tim [10], [11], [13].
+ Tác dụng hạ huyết áp [16].
+ Tác dụng chống loạn nhịp tim [18].
- Tác dụng giảm đau [16], [20], [21]
- Tác dụng chống viêm [2], [9], [16], [17]
- Các tác dụng khác: phụ tử còn được dùng với mục đích kháng
khuẩn, hạ sốt, chữa viêm, đau dây thần kinh ngoai biên [17], tăng miễn dịch
cơ thể [11]
- Độc tính của phụ tử và aconitin
+ Độc tính:
a. Aconitin rất độc. Liều gây chết đối với người lớn là 2-3mg [12]; 1-
5mg [2]; 3-6mg [17]; 0,02-0,05mg/kg thể trọng [13].
b. Khi thủy phân aconitin thành benzoylaconin hoặc aconin có độc
tính thấp, aconitin độc gấp 400-500 lần so với benzoyl aconin, 4000-5000
lần so với aconin [2]. Trên chuột nhắt trắng, LD50 của benzoyl aconin cao
gấp 191 lần aconitin và của aconin gấp 1000 lần [27].
c. Phụ tử sống (ô đầu) rất độc. Độc tính của phần tan trong cồn rất cao
so với phần tan trong nước [11]. LD50 của củ con ô đầu Sapa trên chuột nhắt
trắng là 2g/kg thể trọng [10]; LD50 của củ Aconitum bracchypodum là 1,02±
0,18g/kg thể trọng [20]
Phụ tử chế Sapa (Aconitum fortunei) LD50 = 78,75g/kg thể trọng; bạch
phụ Trung Quốc LD50 = 45,00g/kg thể trọng [10]; phụ tử chế Trung Quốc
LD50 = 17,42g/kg thể trọng (đường uống) và 3,5g/kg thể trọng (đường tiêm)
[20].
+ Ngộ độc phụ tử: độc tính của phụ tử chủ yếu là do aconitin, các biểu
hiện ngộ độc như ngộ độc aconitin:
11
a. Ngộ độc nhẹ: ngứa, nóng ở miệng, lưỡi, dạ dày (là đặc trưng quan
trọng nhất) kéo theo tê liệt và mất cảm giác. Một số triêu chứng khác là rối
loạn đường ruột, rối loạn mạch, khó thở, lạnh, da tím tái, nhược cơ, chóng

mặt và không làm chủ [21].
b. Ngộ độc nặng: co giật ở mặt, chảy đờm rãi, nôn mửa mệt mỏi, khó
thở, giãn đồng tử, mạch đập yếu và không đều, sắc mặt trắng bệch [2], thân
nhiệt hạ thấp [6], [13], liệt chân tay, chóng mặt, ù tai [12]. Chết do ngạt thở
và ngừng tim [2], do loạn nhịp nhanh thất và rung tim, chết trong phạm vi 6
giờ, thậm chí ngay tức khắc [21].
c. Điều trị ngộ độc: rửa dạ dày bằng tanin, hô hấp nhân tạo lâu [6].
1.4- Tác dụng và công dụng của phụ tử:
1.4.1- Phụ tử sống
- Phụ tử sống thường chỉ được dùng ngoài [5], [7], [13], được bào chế
dưới dạng cồn ô đầu, dùng để chữa đau dây thần kinh ngoại biên, đau dây
thần kinh tọa, tật máy giật, viêm phế quản cấp, viêm thanh quản, viêm họng,
cảm cúm, ho, thấp khớp [6], [7], [14], chấn thương phần mềm gây tụ huyết
[20].
- Trường hợp đặc biệt dùng uống để chữa bán thân bất toại, chân tay
co quắp, mụn nhọt lâu ngày không liền miệng [12]. Người Mèo ở đỉnh núi
cao gió lạnh còn dùng để ngâm rượu uống [7].
1.4.2- Phụ tử chế:
- Tính vị, quy kinh: vị cay, ngọt, tính rất nóng, rất độc, quy kinh vào
cả 12 kinh [6].
- Công năng, chủ trị:
+ Hồi dương cứu nghịch: dùngtrong trường hợp tâm thận dương hư,
mồ hôi tự vã ra, nôn nhiều, người lạnh toát, chân tay co quắp, mạch nhỏ
12
muốn tuyệt, dùng phối hợp với can khương, cam thảo (bài tứ nghịch thang)
[3]
+ Khứ hàn, giảm đau: dùng trong các chứng phong hàn, thấp tỳ, đau
nhức xương khớp, chân tay lạnh, thường phối hợp với quế chi, can khương
[3]; chữa đau dây thần kinh ngoại biên, viêm khớp [21].
+ Ấm thận hành thủy: dùng trong trường hợp viêm cầu thận mạn tính,

hoặc chức năng thận kém, dương khí không đủ, lưng gối đau lạnh, nhất là
những người già, chức năng thận suy yếu, chân tay phù nề (phương thức: bát
vị quế phụ) [3].
+ Kiện tỳ vị: dùng trong trường hợp tỳ vị hư hàn, đau bụng tiêu chảy
do hàn tà nhập lý [3]; đau bụng, đau vùng thượng vị kèm vói cảm giác lanh
chữa chứng đồng thời nôn và tiêu chảy hoặc phù kèm cảm giác lạnh hoặc
lạnh chân tay [22].
Liều dùng: thường dùng cho thuốc thang là 4-12g [3]; 3-15g
[11], [22]; có thể tới lOOg hay cao hơn [11].
Kiêng kỵ: những người âm hư, dương thịnh; trẻ em; phụ nữ có
thai, đang cho con bú không dùng [3]. Không dùng chung với bán hạ, bạch
cập, bối mẫu, qua lâu nhân [5], [22].
1.5- Một số phương thuốc cổ truyền có vị thuốc phụ tử
1.5.1- Tứ nghịch thang [3]:
Phụ tử chế: 20g
Cam thảo: 6g
Can khương: 12g
Công năng chủ trị: hồi dương cứu nghịch, trị chứng vong dương, thoát
dương, chân tay giá lạnh (trụy tim mạch).
1.5.2- Bát yị quế phụ [3]:
13
Phụ tử chế:
4g
Thục địa: 32g
Sơn thù:
16g
Phục linh:
12g
Quế phụ:
4g

Hoài sơn:
16g
Đơn bì:
12g
Trạch tả:
12g
Công năng chủ trị: bổ dương, bổ hỏa, trị hỏa hư, gày mệt mỏi, sợ lạnh,
tiểu nhiều, âm thịnh cách dương.
1.5.3- Một số phương thuốc cổ truyền khác:
- Hồi dương cấp cứu thang [6]
- Đại hoàng phụ tử tế tan thang [3]
- Hữu quy ẩm [3]
1.6- Một số phương pháp chế biến
- Chế biến diêm phụ (phụ tử muối) [3].
- Chế biến hắc phụ phiến [3].
- Chế biến bạch phụ phiến [3].
- Chế đạm phụ phiến [3].
- Phụ phiến sao [5].
- Một số phương pháp khác:
+ Theo Hải Thượng Lãn Ông [3], [15]
+ Chế với đồng tiện [3]
+ Chế theo kinh nghiệm của nhân dân Sapa.
14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1- Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu và phương pháp thực
nghiệm
2.1.1- Nguyên liệu:
• Rễ củ nhánh của cây ô đầu - phụ tử do Công ty Dược phẩm
Traphaco cung cấp.
Cây ô đầu, phụ tử này được trồng ở Sapa (Lào Cai), có tên khoa

học là Aconitum carmichaeli PX
Các mẫu nghiên cứu được thu hái tại các thời kỳ phát triển khác
nhau của cây gồm:
+ Ml: lấy của gia đình ông Nguyễn Hữu Cư ở Khu lâm trường, Tổ 11,
Thị trấn Sapa (Lào Cai).
+ M2: lấy của gia đình bà Vũ Thị Miên (hay ông Trần Văn Tâm), tổ
11, Khu lâm trường, thị trấn Sapa.
+ M3: trồng tại Công ty TNHH Traphaco Sapa tại thị trấn Sapa.
Các mẫu được thu hái vào các tháng:
+ 14-7-2003: cây chưa ra hoa
+ 18-8-2003: cây bắt đầu ra nụ
+ 17- 9-2003: cây đang nở hoa rộ
+ 18- 10-2003: cây ra quả
+ 6-12-2003: cây lụi
• Các mẫu của bộ phận dưới mặt đất:
Rễ của cây ô đầu — phụ tử: 6-12-2003.
Ô đầu củ cái của cây ô đầu - phụ tử: 6-12-2003.
• Các mẫu mua trên thị trường:
15
Xuyên ô Trung Quốc mua tại Tứ Xuyên (Trung Quốc) 1-10-
2003
Thảo ô Trung Quốc mua tại Tứ Xuyên (Trung Quốc) 1-10-2003
Một số mẫu chế:
+ Hắc phụ Trung Quốc, bạch phụ Trung Quốc mua tại Tứ Xuyên
(Trung Quốc) 1-10-2003
+ Hắc phụ Trung Quốc, bạch phụ Trung Quốc mua tại phố Lãn Ông -
Hà Nội 17-3-2004.
+ Phụ tử chế Sapa do dân Sapa chế theo kinh nghiệm mua ngày 17-3-
2004.
• Mẫu chê do Công ty Traphaco cung cấp: gồm các mẫu phụ tử chê

CT1-4, CT2-4 ,CT3-4,CT4-4.
2.1.2- Phương tiện nghiên cứu
Thiết bị: máy cân đo độ ẩm Prerisa (Thụy Sỹ), Buret định lượng
chính xác
Hóa chất, thuốc thử:
+ Dung dịch chuẩn H2S04 0,1N; NaOH 0,1N; HC1 0,1N do Công ty
Hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật TPHCM cung cấp.
+ Cồn tuyệt đối C2H5OH do Công ty cổ phần hóa chất tinh khiết Hà
Nội cung cấp
+ Aconitin chuẩn do hãng Latoxan (Pháp) cung cấp
+ Các hóa chất và thuốc thử khác đạt tiêu chuẩn phân tích
+ Bản mỏng silicagel 60F254 (Merk)
2.1.3- Phương pháp nghiên cứu
a. Định tính
16
Định tính các nhóm chứa hóa học bằng các thuốc thử đặc hiệu
và các phản ứng đặc trưng
Định tính bằng SKLM
b- Định lượng: định lượng bằng phương pháp acid base theo Dược
điển Trung Quốc [24]:
Khi kiềm hóa 1 lượng bột đã cân chính xác bằng amoniac đặc, sau đó
chiết kiệt bằng dung môi EteOH:CHC13 (3:1). Định lượng bằng H2S04
0,01M.
lml dung dịch H2S04 0,0IM tương đương với 12,9mg aconitin.
Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo công thức:
p: khối lượng dược liệu khô kiệt tương ứng đem định lượng (khoảng
10g)
n: số ml H2S04 0,01M
2.2- Thực nghiệm và kết quả
2.2.1- Nghiên cứu định tính: lấy mẫu MI tháng 9 để tiến hành

nghiên cứu các phần:
2.2.1.1- Nghiên cứu định tính các nhóm chức bằng thuốc thử đặc
hiệu và bằng các phản ứng đặc trưng.
• Định tính chất béo, carotenoid, sterol, phytosterol. Cho vào bình
cầu 5g bột phụ tử, thêm 20ml ether dầu hỏa, đun hồi lưu cách thủy trong 30
phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, bay hơi dung môi.
- Định tính chất béo: trong quá trình bay hơi dung môi trên đến khi
đặc, lấy dịch nhỏ 1-2 giọt lên tờ giấy lọc, sấy khô thấy để lại vết dầu mỡ
(phản ứng dương tính).
x%= n.12.9
p.10
17
- Định tính caroten, sterol, phytosterol: dung môi còn lại được chia
vào 3 ống nghiệm và đem bay hơi dung môi. cắn thu được làm các phản ứng
sau:
+ Định tính caroten: lấy một ống nghiệm chứa cắn ở trên cho vào 2
giọt H2S04 đặc, thấy có màu xanh nâu (phản ứng dương tính).
+ Định tính sterol: hòa tan cắn trong 3ml dd choloroform, phản ứng
liebermann- bourchard. Chuẩn bị hỗn hợp gồm lml anhydrid acetic và lml
chloroform đã để lạnh ở 0°c, sau đó thêm một giọt H2S04 đặc. Cho hỗn hợp
này tác dụng với dung dịch chloroform ở trên (cho đồng lượng), thấy dung
dịch xuất hiện màu xanh bền vững (phản ứng dương tính).
+ Định tính phytosterol: hòa tan cắn trong 2ml chloroform, thêm 10
giọt anhydrit acetic. Thêm từ từ theo thành ống 2ml H2S04đặc, chỗ giáp giới
xuất hiện màu vàng lục. Lắc nhẹ, màu xanh khuếch tán lên trên (phản ứng
dương tính).
■=> Nhận xét: qua kết quả định tính trên, sơ bộ nhận định trong phụ
tử có chất béo, carotenoid, sterol, phytosterol.
• Định tính flavonoid: lấy 5g bột phụ tử cho vào bình nón dung tích
150ml, thêm 50ml cồn 90°, đun sôi cách thủy 15 phút, lọc, dịch lọc này dùng

để thử các phản ứng định tính sau:
- Phản ứng cyanidin (phản ứng shinoda): cho 2ml dịch chiết vào ống
nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho 5 giọt HC1 đặc. Đun sôi
cách thủy trong vài phút. Quan sát thấy màu của dung dịch không thay đổi
(phản ứng âm tính)
- Phản ứng với FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết, thêm 1-
2 giọt dung dịch FeCl3 5% thấy dung dịch có màu xanh thẫm (phản ứng
dương tính)
18
- Phản ứng với kiềm: nhỏ một giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc rồi hơ
qua cho khô. Quan sát dưới ánh sáng thường không thấy có màu, sau đó hơ
nhẹ lên miệng lọ NH4OH đặc cũng không thấy có màu gì ( phản ứng âm
tính).
- Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm mỗi ống 2ml dịch chiết:
+ ống 1: ống chứng để nguyên
+ ống 2: thêm vào đó vài giọt thuốc thử diazo mới pha. Quan sát thấy
ống 2 xuất hiện màu vàng cam rõ ràng, trong khi ống 1 màu vàng nhạt (phản
ứng dương tính).
■=> Nhận xét: từ kết quả định tính trên, sơ bộ nhận định, trong phụ
tử không có flavonoid.
• Định tính coumarin: cho 5g bột phụ tử vào cốc, thêm 50ml cồn 90°,
đung sôi cách thủy 5 phút, lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc dùng để thử
phản ứng sau đây:
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton: cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống lml
dịch chiết. Ống 1 thêm lml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Đun
cách thủy cả 2 ống đến sôi, để nguội. Quan sát thấy ống 1 có màu vàng, ống
2 không thay đổi. Thêm vào mỗi ống 2ml nước cất, thấy ống 1 vẫn có màu
vàng nhưng nhạt hơn, còn ống 2 trở nên đục trắng. Sau đó cho vào 2 ống một
vài giọt HCL đặc. Thấy ống 1 mất màu vàng và trở nên đục trắng giống ống
2. (Phản ứng dương tính).

- Phản ứng diazo hóa:
+ Chuẩn bị thuốc thử: hòa tan 0,9g acid sulfanilic trong 3ml HC1 đậm
đặc, pha loãng với nước đến 100ml. Lấy 10ml dung dịch ngâm trong nước đá
rồi cho thêm 10ml dung dịch NaN02 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước
19
đá. Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0°c trong 15 phút. Dung dịch chỉ pha để dùng
ngay.
+ Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết phụ tử, kiềm hóa
bằng dung dịch NaC03 2%, đun cách thủy, để nguội, thêm vào đó vài giọt
thuốc thử diazo mới pha, dung dịch trong ống có màu vàng cam ( phản ứng
dương tính).
Quan sát huỳnh quang: nhỏ lên giấy lọc 2 giọt dịch chiết phụ tử
trong cồn, nhỏ thêm 1 giọt NajCC^. Hơ nhẹ cho khô. Lấy 1 miếng kim loại
che đi một nửa vết, sau đó soi đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm, thấy phát
huỳnh quang xanh. Bỏ miếng kim loại ra, thấy nửa còn lại sáng dần lên cho
đến khi bằng bên không che (phản ứng dương tính).
■=> Nhận xét: Qua các phản ứng định tính trên sơ bộ nhận định,
trong phụ tử có coumarin.
• Định tính tanin: lấy 5g bột phụ tử cho vào cốc, thêm 30ml nước cất,
đun sôi vài phút rồi lọc, dịch lọc có màu vàng tối. Làm các phản ứng sau:
- Phản ứng với FeCl3: cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm 1-2
giọt FeCl3 5% thấy dịch trong ống nghiệm có màu xanh thẫm (phản ứng
dương tính).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho vào ống nghiệm lml dịch
chiết, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không thấy có tủa bông xuất hiện
(phản ứng âm tính).
■=> Nhận xét: dịch chiết cho phản ứng âm tính với dung dịch
gelatin 1% nhưng cho phản ứng dương tính với dung dịch FeCl3 5% (đây có
thể là phản ứng của coumarin với FeCl3 5%). Như vậy, có thể sơ bộ kết luận,
phụ tử không có tanin.

20
• Định tính acid hữu cơ: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước
phụ tử và vài tinh thể Na2C0 3 khan, thấy có bọt khí nổi lên rất nhẹ.
-> Như vậy trong phụ tử có acid hữu cơ.
• Định tính glycosid tim:
+ Cho khoảng lOg bộ phụ tử vào một bình nón dung tích 250ml, thêm
100ml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Gạn dịch lọc vào cốc
có mỏ, dung tích 100ml, thêm vào dịch lọc dung dịch chì acetat 30% khuấy
đều, để lắng tủa, lọc qua giấy lọc. Kiểm tra cho tới khi dung dịch không còn
tủa với chì acetat. Loại chì acetat thừa trong dịch lọc trên bằng Na2S04, sau
đó lọc qua giấy lọc. Chuyển dịch lọc trên vào bình gạn dung tích 250ml.
Chiết hỗn hợp glycosid bằng 25ml chloroform (chia làm 3 lần: 10ml, 10ml,
5ml). Lắc đều, gạn láy lớp chloroform. Gộp dịch chiết vào trong cốc có mỏ,
lắc đều. Sau đó chia dịch chiết vào các ống nghiệm đã sấy khô, bốc hơi trên
nôi cách thủy đến khô. cắn còn lại được tiến hành làm các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann- Bourchardt (thuốc thử phản ứng lên
nhân steroid của glycosid): cho vào một ống nghiệm có chứa cắn ở trên
0,5ml anhydric acetic, lắc đều để thuốc thử hòa tan hết cắn. Đặt nghiêng ống
nghiệm 45° và cho thêm đồng lượng H2S04 đặc (0,5ml) theo thành ống
nghiệm. Dịch lọc trong ống nghiệm được chia thành 2 lớp (lớp anhydric
acetic ở trên), ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ.
Lắc nhẹ ống nghiệm, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá cây (phản ứng
dương tính).
Phản ứng Keller- Kiliani (phản ứng phát hiện phần đường): cho
vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90, lắc đều cho cắn được hòa tan
hết. Thêm vài giọt dung dịch sắt m chlorid 5% pha trong acid acetic, lắc
đều. Nghiêng ống 45°. thêm đồng lượng H2S04 đặc theo thành ông nghiệm.
21