Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học loài bình vôi thu hái ở sapa ( stephania brachyandra diels )

Bộ Y tế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ĐỖ PHƯƠNG LOAN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN
• • •
HOÁ HỌC LOÀI BÌNH VÔI THU HÁI Ở SA PA
(STEPHANIA BRACHYANDRA DIELS)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999 - 2004)-^
r f y <0.01%
\$4 9 t T / V j
- Người hướng dẫn : GS.TS. Phạm ThanftJCy Z s ( ử /
ThS. Nguyễn Quốc Huy
- Nơi thực hiện : BỘ MÔN DƯỢC LIỆU
TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI
- Thời gian thực hiện : 15/ 02/ 2004 - 15/ 05/ 2004
HÀ NỘI, THÁNG 05 - 2004
\ l l 8 l • \ \
f
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1- TỔNG Q U AN 2
1.1- Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour
2
1.1.1- Vị trí phân loại của chi Stephania Lour 2
1.1.2- Đặc điểm chung của chi Stephania L our 2
1.1.3- Các loài thuộc chi Stephania ở Đông Dương và Việt Nam

2
1.2- Phân bố của chi Stephania Lour 3
1.2.1- Trên thế giới 3

1.2.2-ở Việt Nam 4
1.3- Thành phần hoá học 4
1.3.1- Nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania trên thế giới

4
1.3.2- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania ở Việt Nam

5
1.4- Tác dụng dược lý và độc tính
7
1.5- Công dụng và dạng bào chế 8
PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

10
2.1- Nguyên liệu 10
2.2- Phương tiện nghiên cứu 10
2.2.1- Súc vật thí nghiệm 10
»2.2.2- Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 10
2.3- Thử độc tính cấp 11
PHẨN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
12
* 3.1- Mô tả đặc điểm thực vật 12
14
14
14
15
17
17
17
19

19
19
20
20
20
21
21
21
22
24
26
27
29
32
32
32
32
34
I
3.2- Đặc điểm vi phẫu

3.2.1- Đặc điểm vi phẫu thân
3.2.2- Đặc điểm vi phẫu cuống lá
3.2.3- Đặc điểm vi phẫu gân lá
3.3- Đặc điểm bột dược liệu

3.3.1- Đặc điểm bột củ
3.3.2- Đặc điểm bột thân
3.4- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân và củ

3.4.1- Định tính alcaloid

3.4.2- Định tính flavonoid
3.4.3- Định tính antranoid
3.4.4- Định tính coumarin
3.4.5- Định tính glycosid
3.4.6- Định tính saponin
3.4.7- Định tính tanin
3.4.8- Định tính tinh bột
3.4.9- Định tính đường khử tự do
3.5- Định tính alcaloid bằng SKLM
3.6- Định lượng alcalid toàn phần
3.7- Định lượng L-tetrahydropalmatin
3.8- Chiết xuất alcaloid toàn phần từ c ủ
3.9- Phân lập alcaloid
3.9.1- Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột
3.9.2- Phân lập alcaloid bằng phương pháp điều chỉnh pH
3.93- Phân lập alcaloid bằng SKLM điều chế
3.10- Nhận dạng alcaloid
.34
.34
.34
.35
.36
.39
.39
.40
.40
.42
.42

.43
.43
45
.45
.46
3.10.1- Kiểm tra độ tinh khiết các alcaloid

3.10.2- Nhận dạng các chất T2, Tj, RT, Pj, RLj, V|
3.10.2.1- Nhận dạng chất T2

3.10.2.2- Nhận dạng chất Tt

3.10.2.3- Nhận dạng chất RT

3.10.2.4- Nhận dạng chất Pt

3.10.2.5- Nhận dạng chất R L j

.
3.10.2.6- Nhận dạng chất V !

3.11- Thử độc tính cấp của dịch ép củ tươi

3.12- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống loài

3.12.1- Nhân giống bằng mảnh c ủ

3.12.2- Nhân giống bằng củ nguyên vẹn

3.12.3- Nhân giống bằng hạt

PHẦN 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT

4.1- Kết luận

4.2- Đề xuất
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
Alc : Alcaloid.
Dc : Dịch chiết.
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
SKLM : Sắc ký lớp mỏng.
SK : Sắc ký.
TP : Toàn phần
I
ĐẶT VẤN ĐỂ
Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và đa dạng về địa hình do đó Việt Nam có
nguồn tài nguyên cây thuốc rất phong phú.
Chi Stephania Lour, là một chi lớn và phức tạp đã được nghiên cứu nhiều trên
thế giới cũng như ở Việt Nam. Tuy nhiên cho đến nay nhiều loài trong chi này vẫn chưa
được nghiên cứu một cách đầy đủ.
Với xu thế sử dụng thuốc hiện nay, ngành Dược đang chú trọng đến các chất có
tác dụng chữa bệnh nguồn gốc thảo dược. Hơn nữa, đã có những khuyến cáo chính thức
về nhóm thuốc Diazepam do khả năng gây nghiện và một số tác dụng không mong
muốn khác nên việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng an thần càng trở nên có ý
nghĩa.
Loài bình vôi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa chưa có tài liệu nào ở
Việt Nam công bô cụ thể. Với đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần

hoá học một loài bình vôi thu hái ở Sa Pa (Stephania brachyandra Diels)” em hy
vọng góp một phần nhỏ nghiên cứu để có hướng sử dụng và bảo tồn tốt hơn với các nội
dung sau:
1- Về thực vật:
- Mô tả đặc điểm thực vật, kiểm định tên khoa học của loài nghiên cứu.
- Xác định đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột dược liệu loài nghiên cứu.
2- Thành phần hoá học:
- Định tính các nhóm chất trong dược liệu.
- Định lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong dược liệu.
- Chiết xuất và phân lập một số alcaloid.
- Nhận dạng các chất phân lập được.
3- Thử tác dụng sinh học:
- Thử độc tính cấp dịch ép từ củ bình vôi tươi.
4- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống của loài bình vôi nghiên cứu.
1
I
PHẦN 1- TỔNG QUAN
1.1- Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour.
1.1.1- Vị trí phân loại chi stephania Lour.
Theo tài liệu [2], [7], [12], [39], chi Stephania Lour, thuộc họ Tiết dê
(Menispermaceae), phân bộ Tiết dê (Menispermineae), bộ Hoàng liên (Ranunculales),
thuộc liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae), trong phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae),
thuộc lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), trong ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) hay còn
gọi là ngành Hạt kín (Angiospermae).
1.1.2- Đặc điểm chung của chi stephania Lour.
Theo tài liệu [2], [25], [39], [42], [43], chi Stephania Lour, được mô tả như sau:
Dây leo, hầu hết mảnh khảnh. Thân gỗ hay thân cỏ. Rễ đôi khi thành củ. Lá với
cuống thường gấp khúc ở gốc, phiến lá hình lọng, thường hình trứng hay gần hình tròn,
8-13 gân lá hình chân vịt. Cụm hoa ở kẽ lá hay mọc trên thân cây già không lá, thường
cấu tạo bởi những xim dạng tán có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm, ít nhất ở

các nhánh của tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi có các
xim tụ họp thành đầu hình đĩa. Hoa đực 6-8 lá đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng
nhau hay không bằng nhau, hoặc chỉ có 2-3 lá đài ở loài s. capitata, đài ít nhiều hình
trái xoan ngược. Cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập
vào trong. Nhị hợp thành một trụ, bao phấn 4-8 ô nứt ngang. Hoa cái đối xứng hay bất
đối xứng, 1-8 lá đài, 2-4 cánh hoa, 1 lá noãn vòi rất ngắn hoặc không có, núm nhị chia
thuỳ ngắn hoặc rách, choãi ra. Quả hạch hình trứng ngược với vết sẹo của núm gần gốc,
nhẵn; vỏ quả trong ở phía lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hay 4 dãy dọc các
bướu hay những gờ ngang. Hạt hình móng ngựa. Giá noãn có các lỗ thủng có hoặc
không. Cây mầm có lá mầm bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ.
1.1.3- Các loài thuộc chi Stephania Lour, ở Đông Dương và Việt Nam.
Trên thế giới hiện nay thống kê được tên khoảng 107 loài thuộc chi Stephania [39].
2
Thống kê ở Đông Dương và Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Tiến Bân [2] có 9
loài, Võ Văn Chi [12] có 8 loài, Phạm Hoàng Hộ [19] có 7 loài, Trần Công Khánh [6 ]
có 9 loài, Sách đỏ Việt Nam [30] có 5 loài.
Theo Nguyễn Chiều, Ngô Trại [10], Nguyễn Tiến Vững [11], [39], [40] mô tả
14 loài thuộc chi Stephania có ở Việt Nam (bảng 1).
Bảng 1. Một sô loài thuộc chi Stephania Lour, có ở Việt Nam.
STT
Loài
Tên Việt Nam
Tài liệu
1
S. brachyandra Diels.
Bình vôi
10; 39
2
s. Cambodia Gagnep.
Bình vôi 10; 39

3
s. cepharantha Hay.
Bình vôi 10; 39; 40
4
s. dielsiana Y.c.
Củ dòm
9; 10 ;
23; 36
5
s. excentrica H.S.Lo.
10; 39
6
s. hainanensis H.S.Lo.
Bình vôi
10; 39
7
S. hernandifolia (Willd.) Walp.
Dây mối
10; 39
8
S. kwangsiensis H.S.Lo.
Bình vôi Quảng Tây 10; 39
9
S. longa Lour.
Dây lõi tiền rễ dài 10; 39
10
S. pierrei Diels.
Bình vôi trắng 10; 39
11
S. sinica Diels.

Bình vôi tán ngắn 10; 39
12
Stephania glabra (Roxb.) Miers.
Bình vôi (Ninh Bình) 10; 39
13
Stephania kuinanennis H.S.Lo et
M.Yang.
%
Bình vôi (Lạng Sơn)
43; 44
14
Stephania viridiflavens H.S.Lo et
M.Yang.
Bình vôi (Sơn La)
11; 20
3
I
1.2- Phân bố của chi stephania Lour.
1.2.1- Trên thê giới.
Theo tài liệu [39], [42], [43] chi Stephania phân bố ở vùng nhiệt đới, Á nhiệt
đới, có ở các nước: Indonexia, Myanma, Malayxia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt
Nam, Philippin, Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New
Guinea, Nhật Bản, Australia, Nigeria, Ethiopi. về số lượng loài thuộc chi Stephania
Lour, trên thế giới các tài liệu không thống nhất.
1.2.2- Ở Việt Nam.
Theo tài liệu [5], [10], [21], [39], các loài bình vôi thường mọc hoang ở một số
vùng núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên
bãi cát hoặc gò cát hoang vùng ven biển.
Các loài bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung,
Nam.

+ Miền Bắc: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây,
Hoà Bình, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La,
Nam Định, Ninh Bình.
+ Miền Trung: Thanh Hoá, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng
Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên.
+ Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu.
1.3- Thành phần hoá học.
1.3.1- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi stephania trên thế giới.
Song song việc nghiên cứu về thực vật của chi Stephania, nhiều nhà khoa học đã
đi sâu nghiên cứu thành phần hoá học của các loài trong chi này. Thành phần hoá học
của chi Stephania gồm có alcaloid, tinh bột, đường khử, acid malic, men oxydase
Trong đó alcaloid là thành phần chính và được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.
Theo tài liệu [39], alcaloid có trong chi Stephania Lour, chia làm 8 nhóm chính
(bảng 2 ).
4
+■
Bảng 2. Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour.
STT
Nhóm chất
Số lượng alcaloid
1
Benzyl isoquinolin
Gồm 3 chất, trong đó có chất Papaverin C20H2| N04
2
Bis benzyl isoquinolin
Gồm 40 chất, trong đó có chất Tetrandrin C38H42N204
3
Protoberberin
Gồm 22 chất, trong đó có L-tetrahydropalmatin
C21H25 N04 và Palmatin C21H25 N(+)0 4

4
Aporphin
Gồm 54 chất, trong đó có Roemerin C18H17N 02
5
Proaporphin
Gồm 3 chất, trong đó có Stepharin C18H19N 03
6
Hasubanan
Gồm 29 chất, trong đó có Cepharamin C19H23N0 4
7
Morphinan
Gồm 11 chất, trong đó có Sinoacutin C14H2|N04
8
Dibenzazonin
Gồm 1 chất là Protostephanin C21H27N0 4 có trong
loài Stephania japonica (Thunb). Miers.
1.3.2- Những nghiên cứu về alcaloid trong chi stephania ở Việt Nam.
Theo Đỗ Tất Lợi [25] có trích dẫn các tài liệu khác, năm 1940 Bùi Đình Sang
xác định củ bình vôi mọc ở Việt Nam có tinh bột, đường khử, men oxydase, nhiều
alcaloid với tỉ lệ 0,12-0,15% (tính trên củ tươi), trong đó chiết được một alcaloid, Bùi
Đình Sang đặt tên là Rotundin.
Năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn bang Xô Viết
(Vilar) đã xác định Rotundin của Bùi Đình Sang chiết được từ củ bình vôi ở Việt Nam
chính là L-tetrahydropalmatin.
Năm 1964, Ngô Vân Thu [33] chiết được một alcaloid ở loài bình vôi khác với
tỷ lệ 0,1% và đã xác định đó là Roemetin năm 1971.
Bùi Thị Bằng và cộng sự [36] đã khảo sát hàm lượng
L-tetrahydropalmatin trên một số mẫu bình vôi mọc hoang ở các bộ phận thân, rễ, củ đi
đến kết luận:
5

"P
I
- Hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong củ bình vôi không phụ thuộc vào màu
sắc, khối lượng và hình dáng của củ. Để bảo đảm chất lượng của dược liệu, kết hợp bảo
vệ tái sinh cây, chỉ nên thu những củ có khối lượng từ 800g đến lOOOg trở lên.
Năm 1981, Văn Thị Sáu [30] phát hiện L-tetrahydropalmatin ở loài Stephania
piereỉ Diels thu được ở Nghĩa Bình.
Năm 1992, Ngô Thị Tâm [31] công bố phát hiện có chất Cepharanthin trong củ
bình vôi Stephania pierrei Dỉels thu hái ở Nghĩa Bình.
Năm 1999, Nguyễn Tiến Vững [39] đã phân lập và xác định cấu trúc 5 alcaloid:
- L-tetrahydropalmatin từ củ cả 3 loài Stephania glabra (Roxb.) Miers.,
Stephanỉa kuinanensis H.S.Lo et M.Yang., Stephania sp3.
- Roemetin từ quả xanh loài Stephania glabra (Roxb.) Miers
- Palmatin từ củ loài Stephania sp3 thu hái từ Quảng Ninh.
- Cycleanin từ củ loài Stephania sp3 thu được từ Quảng Ninh.
- Stepharin từ củ loài Stephania kuinanensis H.S.Lo et M.Yang
« Năm 1999, Nguyễn Thị Hoài Anh [1] đã phân lập được 3 alcaloid từ củ bình vôi
mọc ở Mộc Châu - Sơn La, không rõ loài gì nhưng đã xác định được cấu trúc hoá học.
- 9,10 Dihydroxy - 2,3 - dimethoxy tetrahydroprotoberberin.
- 2,10 Dihydro - 3,9 - dimethoxy tetrahydroprotoberberin (Stepholidin).
- 2 Hydroxy - 3,9,10 - trimethoxy tetrahydroprotoberberin (Iso corypalmin
tetrahydrocolumbamin)
Năm 2001 Nguyễn Quốc Huy [23] đã xác định hàm lượng
L-tetrahydropalmatin trong củ Dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) thu hái ở Hà Tây là
0,41%. Đã chiết xuất và phân lập được một chất khác, dự kiến công thức là CiyH130 3N,
có cấu trúc khung Aporphin.
ở Việt Nam chưa tìm được tài liệu nào nghiên cún cụ thể về thành phần hoá
học của loài bình vôi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sa Pa.
6
I

1.4- Tác dụng dược lý và độc tính.
Rotundin (L-tetrahydropalmatin)
Theo tài liệu [35] L-tetrahydropalmatin thử trên chuột cống trắng đã chứng
minh có tác dụng an thần, gây ngủ, với liều 25-30 mg/kg làm giảm hoạt động tự nhiên
của chuột thí nghiệm. Dùng với liều cao xuất hiện loạn vận động và triệu chứng giữ
nguyên thể (catalepsy) với liều 2,5 mg/kg L-tetrahydropalmatin đối kháng tác dụng
kích thích làm tăng hoạt động của chuột do Phenamin gây nên. Trên chuột nhắt trắng
bằng đường uống với liều 30mg/kg L-tetrahydropalmatin có tác dụng kéo dài giấc ngủ
của Thiopentan gấp 1,5 lần. Đối với hoạt động của hệ thần kinh trung ương, quan sát
trên điện não đồ của thỏ có cắm điện cực ở các vùng cảm giác, vận động trước sau phải
trái và vùng thị giác của hai bán cầu não thấy L-tetrahydropalmatin với liều 20mg/kg
làm xuất hiện các cụm sóng chậm có biên độ cao. Ngoài ra, thành phần các sóng delta ở
các vùng vận động tăng và thành phần các sóng nhanh beta giảm.
Trên mô hình gây co giật bằng Conazol hoặc bằng Strychnin hoặc bằng shock
điện Rotundin với liều cao ( > 100 mg/kg) có tác dụng kháng co giật và bảo vệ được
một phần súc vật khỏi bị tử vong. Trên mèo gây mê dùng Rotundin bang đường tiêm
tĩnh mạch với liều 5-20 mg/kg có tác dụng làm hạ huyết áp [35].
Thí nghiệm trên ruột thỏ tại chỗ (insitu) với liều 0,5-1,0 mg/kg làm giảm trương
lực cơ trơn trên ruột. Bằng đường uống trên thỏ thí nghiệm với liều 15mg/kg
L-tetrahydropalmatin có tác dụng giảm đau [35].
Trên chuột cống trắng bình thường và chuột bị cắt tuyến giáp trạng,
L-tetrahydropalmatin đều có tác dụng hạ nhiệt độ và giảm chuyển hoá cơ bản. Tác
dụng hạ nhiệt có thể là do ức chế trung khu điều nhiệt và làm giãn các mạch máu
ngoại vi [35].
Về độc tính cấp, trên chuột nhắt trắng bằng đường uống, Rotundin chlohydrat có
LD50 = 1000 mg/kg. Trên thỏ, tiêm tĩnh mạch với liều 30mg/kg, súc vật tỏ ra mệt mỏi
trong 1-2 ngày sau đó phục hồi bình thường [35].
7
I
về độc tính mạn, trên chuột cống trắng cho cùng với liều 10-30mg/kg trong 60

ngày liên tiếp không thấy xuất hiện các triệu chứng nhiễm độc trên các lô thí nghiệm
[35],
Thí nghiệm trên chuột cống trắng đực, dùng với liều 8mg trên mỗi con chuột,
không gây đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và tế bào tinh hoàn [35].
Cepharanthin
Cepharanthin được phân lập từ Stephania cepharantha và Stephania pỉerrei theo
tài liệu [32] thử trên súc vật chiếu xạ tia X, Cepharanthin với liều lmg/kg làm giảm nhẹ
hiện tượng giảm bạch cầu do sử dụng các thuốc chống ung thư gây nên, còn có tác dụng
ức chế kết tập tiểu cầu máu do collagen gây nên và có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển
của bệnh bụi phổi thí nghiệm. Cepharanthin được coi là một chất có tác dụng kích thích
miễn dịch và làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống
ung thư. Cepharanthin ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao. Thí nghiệm trên ống
kính (invitro) ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư Hela và Hela S3. Cepharanthin
đã được chứng minh có tác dụng ức chế mạnh quá trình sao chép (replication) của
HIV I [35].
1.5- Công dụng và dạng bào chế.
Theo các tài liệu [4], [5], [8 ], [9], [25], [35], [38] đã ghi loài bình vôi Việt
Nam có:
Tính vị, quy kinh: Vị đắng hơi ngọt, tính mát, quy vào hai kinh can và tỳ.
Công năng, chủ trị: An thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, tán ứ, hành
huyết, hoá đàm, tán kết, khu phong, hoạt lạc. Chủ trị mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau
dạ dày, hen suyễn, khó thở, phối hợp với các thuốc khác để trị ho, sốt rét, kiết lỵ, ngoài
da lở ngứa, mụn nhọt.
Ngày 3-6g dược liệu dạng thuốc sắc, thuốc bột hay rượu thuốc.
Ngày dùng 0,05g - 0,1 Og Rotundin dưới dạng thuốc bột, thuốc viên. Có thể chế
thành dạng tiêm 0,05g Rotundin hydroclorid hay Rotundin sulfat trong ống 5ml. Trẻ
em từ 1-5 tuổi uống với liều từ 0,020g - 0,025g; trẻ em 5-10 tuổi uống từ 0,030g-
0,050g.
8
Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế:

- Viên Rotunda 30mg, viên Sen vông, viên Tepar, siro Rotunda (Xí nghiệp Dược
phẩm TWII)
- Viên Rotunda 30mg (Xí nghiệp Dược phẩm TWI).
- Viên Rosen30 (30mg/viên), chè an thần (Xí nghiệp Dược phẩm Hà Nội).
- Viên StiluxóO (60mg/viên) (Công ty cổ phần Traphaco).
- Rotundin sulphat tiêm (60mg/2ml) (Học viện Quân Y).
9
PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1- Nguyên liệu.
Chúng tôi thu hái mẫu tại Sa Pa (Lào Cai) từ tháng 07 năm 2002 đến nay, lấy
mẫu trồng ở Hà Nội, theo dõi sự phát triển của cây, thu mẫu có hoa, quả, hạt để định
tên khoa học và lấy củ, thân cây làm nguyên liệu nghiên cứu.
2.2- Phương tiện nghiên cứu.
2.2.1- Súc vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng (chủng Swiss do viện vệ sinh dịch tễ cung cấp) cả hai giống
khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 20 ±2 (g).
2.2.2- Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.
- Vi phẫu được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi tại bộ môn Thực vật Trường
Đại học Dược Hà Nội.
- Phân tích hoa bằng kính núp nổi Nikon của Nhật tại bộ môn Thực vật Trường
Đại học Dược Hà Nội.
- Đo độ ẩm xác định trên máy Precisa tại Bộ môn Dược liệu Trường Đại học
Dược Hà Nội.
- Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary IF-Varian
(Australia) tại phòng thí nghiệm trung tâm Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Đo phổ hồng ngoại (IR) trên máy FT-IR- Spectrophotometer 1650 Elmer
(USA) tại phòng thí nghiệm trung tâm Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phổ khối (MS) đo trên máy: 5989B-MS, tại phòng cấu trúc, Viện hóa học,
Trung tâm Khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy NMR-BRUKER-

500MHZ tại phòng NMR, Viện hoá học, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ
Quốc gia.
- Định lượng Rotundin trong dược liệu trên máy HPLC 1100 với detector uv
tại Viện kiểm nghiệm.
10
- Thử độc tính cấp tại phòng Dược lý Viện kiểm nghiệm Trung Ương.
2.3- Phương pháp nghiên cứu.
- Vi phẫu được cắt và nhuộm kép theo phương pháp ghi trong tài liệu “Thực
tập hình thái và giải phẫu thực vật” [24].
- Vi phẫu sau khi nhuộm kép được chụp qua kính hiển vi.
- Định tính các nhóm chất trong dược liệu theo tài liệu “Bài giảng dược liệu”
[5] và “Thực tập dược liệu” [6 ].
- Chiết xuất và phân lập các alcaloid trong dược liệu theo tài liệu “Bài giảng
dược liệu” [5],
- Định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp acid - base.
- Định lượng L-tetrahydropalmatin theo phương pháp HPLC [16].
- Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên điểm chảy, SKLM so với chất
chuẩn và số liệu các phổ u v , IR, MS và phổ mô phỏng.
- Thử độc tính cấp theo hướng dãn kèm theo quyết định số 371/BYT-QĐ
ngày 12/3/1996 về xác định độ an toàn cho thuốc cổ truyền của Bộ Y Tế và tài liệu
[19], [46],
11
PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ.
3.1- Mô tả đặc điểm thực vật.
Quan sát tại thực địa và tiêu bản lấy được cho thấy cây bình vôi chúng tôi
nghiên cứu có thân leo nhỏ, yếu. Cành non màu nhạt, khi già chuyển sang màu nâu
xám. Toàn cây không lông, có nhựa trong suốt không màu. Củ dạng thay đổi, vỏ xù xì,
màu nâu xám, nâu nhạt hay màu đất, khối lượng 3-5kg, đường kính củ 15-30cm, ruột
củ màu vàng, lát cắt có nhiều xơ. Lá đơn màu xanh, mép nguyên, mọc so le. Cuống lá
dài. Phiến lá hình trứng nhọn hoặc hình tim. Chóp lá nhọn sắc, gốc lá bằng hoặc hơi

lõm. Gân 10 chiếc, toả đều, xuất phát từ đỉnh của cuống lá. Hoa đơn tính khác gốc.
Cụm hoa cái tán kép, cuống cụm hoa dài 5-10cm, do 17-18 tán kép có cuống dài 0,5-
l,0cm tạo thành, ở gốc tán có lá bắc nhỏ, mỗi tán lại gồm 3 tán nhỏ, cuống tán rất ngắn
l-2mm, mỗi tán nhỏ gồm 3 hoa đính sát gốc. Hoa cái nhỏ có một đài màu lục nhạt,
nhỏ, hình mác rộng nhọn đầu, 2 cánh hoa rời, xếp lệch về hai phía, màu vàng cam, hình
trứng ngược, dày, nạc, dài 0,5-0,7mm. Bầu hình trứng ngược, cuống ngắn, núm nhuỵ 4-
5 thuỳ. Cụm hoa đực tán kép gồm 6 tán, cuống cụm hoa dài 10-15cm, cuống tán dài 2-
3cm, mỗi tán gồm 5-6 hoa, cuống hoa dài 4-5mm, ở gốc có lá bắc nhỏ. Hoa đực nhỏ
gồm 6 lá đài rời, xếp trên một vòng, kích thước đều nhau, dài l,8 -2 ,0 mm, đầu hơi tròn,
3 cánh hoa rời, kích thước gần đều nhau, hình trứng ngược, dài 0 ,8-l,0 mm, bộ nhị hàn
liền thành một trụ cao khoảng 0,5-l,0cm, với 6 bao phấn xếp thành vòng tròn. Quả hình
trứng ngược, dài 0,7-0,8cm, hơi dẹt, khi chín có màu đỏ, Hạt hình móng ngựa có 4 hàng
gai gờ lên phía mép hạt, mỗi hàng gai gồm 12-14 gai nhỏ. Giá noãn có lỗ hình trứng
đảo ở giữa.
Sau khi quan sát và phân tích nhiều lần các đặc điểm mẫu cây nghiên cứu ở Sa
Pa (Lào Cai), đối chiếu với các tài liệu phân loại và cử nhân Nguyễn Chiều đã định tên
loài Stephania chúng tôi nghiên cứu là Stephania brachyandra Diels, họ Tiết dê:
Menỉspermaceae. Tên Việt Nam: Bình vôi núi cao, bình vôi nhị ngắn.
12
I
* * • V •
% « I > t
yy^ r p

r-T TT-fP p P F BW F
^ 10 »1 « '* 14 15 18 17 ’• 19
Hình i . Loài Stephania brachyandra Diels
a. Đoạn thân.
b. Tliâiì mang quả.
c. Quả, hạt.

đ. Hạt.
e. Hoa đực (ed) - Quả (eM) - Hoa cái (ec).
f. Củ.
i
I
3.2- Đặc điểm vi phẫu.
3.2.1- Đặc điểm vi phẫu thân: Sử dụng đoạn thân bánh tẻ làm mẫu nghiên cứu.
Lấy lát cắt ngang phần thân cây: Tẩy, nhuộm kép, loại nước, cố định tiêu bằn
để khô tự nhiên, soi dưới kính hiển vi, quan sát thấy các đặc điểm sau (hình 2 ):
- Biểu bì (1): Cấu tạo bởi một hàng tế bào hình chữ nhật đều, phía ngoài phủ cutin.
- Mô mềm vỏ (2): Mô mềm vỏ thân được phân thành 2 phần bởi cung mô cứng uốn
lượn hình cánh hoa “ 12 cánh”.
+ Mô mềm phía ngoài cung mô cứng: Gồm khoảng 10-15 hàng tế bào hình
trứng, màng mỏng bằng cellulose, kích thước nhỏ hơn nhiều so với các tế bào mô mềm
vỏ phía ngoài.
+ Mô mềm phía trong cung mô cứng: Gồm các tế bào màng mỏng bằng
cellulose, hình đa giác không đều nhau, kích thước lớn hơn so với các tế bào mô mềm
vỏ phía ngoài.
- Cung mô cứng (3): Cấu tạo bởi các tế bào hình nhiều cạnh, màng dầy hoá gỗ, kích
thước không đều nhau. Mỗi cung mô cứng tương ứng với một bó libe - gỗ. Các mô cứng
*
xếp liền nhau tạo thành vòng gồm 12 cung.
- Bó libe - gỗ cấp II (4): Libe ở ngoài, gỗ ở trong, giữa bó libe - gỗ là hàng tế bào tượng
tầng (tầng phát sinh libe - gỗ).
- Mô mềm ruột (5): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình cầu, kích thước
không đều nhau.
- Tia ruột (6 ): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, nằm xen kẽ các bó libe -
gỗ.
3.2.2- Đặc điểm vi phẫu cuống lá.
Cắt ngang cuống, tẩy và nhuộm kép, soi kính hiển vi thấy có đặc điểm sau:

Mặt cắt cuống lá có tiết diện tròn, từ ngoài vào trong có (hình 3):
- Biểu bì (1): Gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật đều đặn, phía ngoài phủ một lớp cutin
* mỏng.
- Mô dày (2): Gồm 2-3 hàng tế bào mô dày góc xếp xen kẽ với hàng tế bào biểu bì.
14
- Mô mềm vỏ (3): Gồm 4-5 hàng tế bào hình trứng kích thước không đều nhau, xếp khá
xít vào nhau.
- Cung mô cứng (4): Gồm 2-3 hàng tế bào hình nhiều cạnh, có màng hoá gỗ, xếp uốn
lượn theo các bó libe - gỗ.
- Bó libe - gỗ (5): Gồm 8 bó libe - gỗ kích thước khá đều nhau.
+ Bó libe: Phía ngoài, gồm nhiều tế bào màng mỏng bằng cellulose.
+ Bó gỗ: Phía trong, gồm nhiều bó gỗ kích thước không đều nhau.
- Mô mềm ruột (6 ): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình tròn, kích
thước không đều nhau.
3.2.3- Đặc điểm vi phẫu phần gân lá.
Lát cắt ngang gân lá và một phần phiến lá được tẩy và nhuộm kép, soi kính hiển
vi thấy (hình 6 ):
* Gân lá.
- Biểu bì trên và dưới (1): Gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, phía ngoài phủ
* một lớp cutin không đều nhau.
- Mô dày (2):
+ Mô dày trên: Một hàng tế bào mô dày ngay dưới lớp biểu bì hình dạng các tế
bào không đều nhau.
+ Mô dày dưói: Gồm 1-2 hàng tế bào mô dày có kích thước lớn hơn mô dày phía trên.
- Mô mềm (3): Các tế bào màng mỏng bằng cellulose hình trứng kích thước không đều
nhau, xếp xít vào nhau.
- Bó libe - gỗ (4): Libe - gỗ tạo thành một bó lớn ở giữa gân lá. Libe ở phía dưới, gỗ ở
phía trên.
* Phiến lá.
- Biểu bì trên và dưới: tương tự phần gân lá.

- Mô giậu (5): gồm vài hàng tế bào mô giậu hình chữ nhật đều đặn xếp vuông góc với
hàng tế bào biểu bì trên.
15
Hình 2. Vi phẫu thân.
Hình 3. Vi phẫu cuống lá.
16
3.3- Đặc điểm bột dược liệu.
3.3.1- Đặc điểm bột củ.
Bột màu vàng, vị đắng, sau hơi ngọt.
Soi kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: Tinh bột (1); tinh thể calcioxalat (2), thể
cứng (3) (hình 4).
3.3.2- Đặc điểm bột thân.
Bột màu hơi xanh, vị đắng, sau hơi ngọt.
Soi kính hiển vi có các đặc điểm sau: Mảnh mạch điểm (1); tinh bột (2); thể cứng
(3); tinh thể calcioxalat (4), mô mềm (5), mảnh bần (6 ) (hình 5).
17
Hình 4. Đặc điểm bột củ.
Hình 5. Đặc điểm bột thân.
Ĩ 5
út
Hình 6. Vi phẫu lá.
18
3.4- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân và củ.
3.4.1- Định tính alcaloid.
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 200-250ml thấm ẩm dược
liệu bằng dung dịch amoniac 6N, trộn cho thấm đều, để yên 30 phút, cho vào bình nón
50ml cloroform. Lắc 5-10 phút, rồi để yên 1 giờ. Dịch chiết cloroform lọc qua giấy lọc
không gấp nếp. Lấy 30ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 5ml H2S04 10% lắc 2-3 phút,
gạn lấy phần acid để làm phản ứng. Cho vào bốn ống nghiệm, mỗi ống lml dịch chiết,
rồi thêm vào từng ống một loại thuốc thử và thấy kết quả như sau:

- Ống 1: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer : có tủa trắng.
- Ống 2: nhỏ 2 -3 giọt thuốc thử Dragendorff : có tủa da cam.
- Ống 3: nhỏ 2 -3 giọt thuốc thử Bouchardat : có tủa nâu.
- Ống 4: nhỏ 2 - 3 giọt acid picric : có tủa màu vàng.
Nhận xét: Dược liệu có alcaloid.
3.4.2- Định tính Flavonoid.
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml cồn 90°c.
Lắc đều rồi để qua đêm. Lọc và cô cách thuỷ dung dịch lọc còn lại khoảng 10ml. Dịch
này để thử các phản ứng định tính sau:
- Phản ứng Cyanidin: Cho 2ml dịch chiết vào 1 ống nghiệm, thêm một ít bột
Magie kim loại. Sau đó cho thêm vài giọt HC1 đặc. Để yên một vài phút quan sát không
thấy dung dịch chuyển màu từ vàng sang đỏ (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô rồi để yên trên
miệng lọ có chứa amoniac đặc không thấy màu vàng của dịch chiết được tăng lên (phản
ứng âm tính).
- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết dược liệu, thêm vài giọt NaOH 10%,
không thấy xuất hiện tủa màu vàng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với FeCL,: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung
dịch FeCl3 5% không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có flavonoid.
19
3.4.3- Định tính antranoid.
- Định tính antranoid: Cho 2g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 15ml
dung dịch acid H2S04 10%. Đun cách thuỷ 15 phút. Lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn,
lắc với 5-7ml ether ethylic trong 1-2 phút. Để yên cho tách thành hai lớp, loại bỏ phần
nước. Cho vào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10%. Lắc lên thấy xuất hiện màu đỏ
sim trong dung dịch kiềm (phản ứng dương tính).
- Vi thăng hoa: Cho vào ống trong nút chai bằng nhôm 1 ít bột dược liệu. Đậy
nút bằng một phiến kính, trên đó có một ít bông thấm nước. Đun dưới nút chai bằng đèn
cồn qua lưới amiăng, lấy ra để nguội quan sát dưới kính hiển vi có tinh thể hình kim

(phản ứng dương tính).
Nhận xét: Dược liệu có antranoid.
3.4.4- Định tính coumarin.
Lấy 5g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 50ml cồn 90°, đun cách thuỷ trong
khoảng 3-5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng sau:
- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào ống nghiệm nhỏ mỗi ống nghiệm lml
dịch chiết. Ông 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun cả
hai ống nghiệm đến sôi và để nguội quan sát. Không thấy hiện tượng gì xảy ra. Sau khi
để nguội cho thêm vào mỗi ống 2ml nước cất quan sát và không thấy hiện tượng gì xảy
ra (phản ứng âm tính).
- Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vào đó 2ml
dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ đến sôi và để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử
diazo (mới pha) không thấy xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng âm tính).
- Vi thăng hoa: Làm tương tự như phản ứng vi thăng hoa ở phần định tính
antranoiđ (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Dược liệu không chứa coumarin.
3.4.5- Định tính glycosid tim.
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10ml cồn 90°. Đun cách thuỷ
sôi trong vài phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính.
20
I