Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây

Bộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
SINH VIÊN: Lê Thị Hưởng
PHÂN LẬP STREPTOMYCES có KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ CÁC MẪU ĐẤT
THUỘC TỈNH HÀ TÂY
■
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997-2002
Người hướng dẫn: Cử nhân Nguyễn Lệ Phi
Thạc sỹ Phạm Thu Nga
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh-sinh học
Thời gian thực hiện: 0210312002 - 2010512002
HÀ NỘI 06-2002
- ■ T ĩC O-'
Lời cảm ơn!
Trong quá trình học tập tại trường Đại Học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được
sự dạy dỗ chỉ bảo ân cần của các thầy, cô và sự giúp đỡ của các phòng ban chức
năng trong nhà trường. Nhờ có sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của Cử nhân
Nguyễn Lệ Phi, Tiến Sỹ Chu Thị Lộc, Thạc Sỹ Phạm Thu Nga, Kỹ Thuật
Viên Bùi Thị Xuyến, Kỹ Thuật Viên Nguyễn Thị Vân Sơn - Bộ môn Vi sinh -
Sinh học, tôi đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp trong thời gian quy định.
Tôi xin bày tỏ lòng biết 0fn sâu sắc tới tất cả các thầy, cô trong nhà trường và
đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh - Sinh học về sự giúp đỡ quý báu
này.
Hà Nội ngày 28 tháng 05 năm 2002
Sinh viên: Lê Thị Hưởng
MỤC LỤC
Trans
7
ĐẶT VẤN Đ Ề 1
PHẦN 1. TỔNG Q U A N

1.1. Đại cương về chi Streptomyces 2
1.1 .1. Đặc điểm sinh thái


2
1.1.2. Đặc tính hình thái .
.


2
1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy 3
1.1.4. Đặc tính sinh lý sinh sinh hoá
4
1.1.5. Sự tạo kháng sinh của Streptomyces

4
ì2.Ỹ\iấĩ\\oọ.ì Streptomyces 5
1.2.1. Khoá phân loại xạ khuẩn đối kháng theo Gauze 1957

6
1.2.2. Khoá phân loại Waksman 1961

6
1.2.3. Khoá phân loại Krassilnicov 1970 7
1.2.4. Khoá phân loại ISP 1972 7
PHẦN 2. THựC NGHỆM VÀ KẾT Q U Ả
8
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 8
2.1.1. Nguyên liệu

8
2.1.2. Phưcỉng pháp thực nghiệm 9
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận x ét 19
2.2.1. Phân lập Ẵíre/ítomyceí và thử hoạt tính kháng sin h

19
2.2.2. Chọn môi trường sinh tổng hợp kháng sinh thích hợp cho
các chủng nghiên cứu


.19
2.2.3. Xác định tên các chủng ức chế nấm m ạnh
21
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
: .29
TÀĨ LỆƯ THA.VI KHẢO
ĐẬT VẤN ĐỂ
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi ữong tự nhiên. Người ta
đã nghiên cứu và ứng dụng các đặc tính đáng quí của nó trong nhiều lĩnh vực
như nông nghiệp, công nghệ thực phẩm Trong ngành Y-Dược, xạ khuẩn được
biết đến chủ yếu vói vai trò là nguồn sinh tổng hợp kháng sinh tự nhiên và một
số sản phẩm chuyển hoá khác như vitamin, enzym
Streptomyces, một chi thuộc bộ Actinomycetales, là những vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp nhiều kháng sinh thuộc các nhóm khác nhau như
streptomycin, erythromycin, cloramphenicol
Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các kháng sinh mới nói chung và các
kháng sinh chống nấm nói riêng đang được thế giói quan tâm. Do đó, để góp
phần nghiên cứu xác đinh tên và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháns sinh
của các loài Streptomyces có ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tà i:
” Phân lập Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu

đất thuộc tỉnh Hà Tây”.
Mục tiêu của đề tài:
1. Phân lập Streptomyces từ các mẫu đất thuộc tỉnh Hà Tây và thử khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng này.
2. Sơ bộ tìm môi trưòíng nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng
hợp kháng sùứi của các chủng nghiên cứu, trong điều kiện cho phép.
3. Phân loại một số chủng có tác dụng ức chế nấm txên cơ sở các khoá
phân loại phổ biến.
PHẦN 1. TỔNG QƯAN
1.1. Đại cương về chi Streptomyces
1.1.1. Đặc điểm sinh thái [3, 4, 5,16,18]
Streptomvces là một chi thuộc họ Streptomỵcetaceae, bộ Actinomycemles,
lớp Actinomvcetes. Xạ khuẩn nói chung và Streptomyces nói riêng phàn bố rất
rộng rãi trong tự nhiên và thường có nhiều trong đất, nước, bùn ao và trong các
cơ chất hữu cơ khác, thậm chí ngay cả trên các cơ chất mà nấm mốc và vi khuẩn
không thể phát triển được. Điều đó cho thấy nhu cầu về chất dinh dưỡng cùa xạ
khuẩn là tương đối đơn giản và chúng thích nghi với nhiều điều kiện sống khác
nhau. Trong đất, xạ khuẩn chiếm tỷ lệ rất lớn, có hàng triệu xạ khuẩn trong một
gam đất. Phần lớn các xạ khuẩn sống hoại sinh và hiếu khí, một số ít kị khí hoặc
vi hiếu khí có thể gây ra các bệnh cho người, cho động vật và cho cây trồng.
1.1.2. Đặc điểm hình thái [3, 4, 5,16,18]
Đặc tính hình thái là những dấu hiệu quan trọng để xác định loài
Atinomycetes. Streptomvces là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm hình thái
khác với vi khuẩn và nấm .
Hệ sợi hay còn gọi là khuẩn ti chia thành hai loại là khuẩn ty khí sinh và
khuẩn ty cơ chất (khuẩn ty địa sinh), đưòíng kính của khuẩn ty thay đổi từ 0,2 -
1,0 |J. đến 2-3 |J. , đa số không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Hệ sợi phân
nhánh đa dạng và có mầu sắc phong phú: trắng, vàng, da cam, tím, đỏ. nâu,
xám
Cuống sinh hào tử, sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh

sẽ xuất hiện các sợi mang bào tử (cuống sinh bào tử). Hình thái cuống sinh bào
tử là dấu hiệu quan trọng để phân loại xạ khuẩn, chúng có thể có dạng thẳng
(straight), xoắn (spiral), sóng (wave) có thể mọc vòng quanh một trục theo
kiểu đơn hoặc kép.
Bào tử được hình thành bên trong một lớp màng có cấu trúc sợi, do đó một
số trường hợp vẫn quan sát được lớp màng này do nó không bị mất đi khi bào tử
hình thành.
Số lượng hào tử trong một chuỗi thường trên 50 bào tử nhưng cũng có khi
chỉ có từ 5 đến 10 bào tử tạo thành một đoạn thẳng.
Bào tử cũng có nhiều dạng như hình cầu, hình chữ nhật, hình que, hình oval,
hình ống Bể mặt bào tử có thể quan sát thấy một trong bốn dạng nhẵn
(smooth), có gai (spiny), có bướu (warty) hoặc có lông (hair-like).
Thành tế hào của chi Streptomyces thuộc kiểu I, thành phần chính gồm
acid L, L - 2, 6 diaminopimelic, giycin, acid glutamic và alanin, không có hoặc
có rất ít đường pentose, đa số Streptomyces là các tế bào Gram dương.
Khuẩn lạc của Strepromỵces rất đặc biệt, nó không trơn ướt như khuẩn lạc vi
khuẩn mà thô ráp, xù xì, có thể có dạng phấn, nhung có các nếp toả ra theo
hình phóng xạ (vì thế có tên là xạ khuẩn). Streptomyces cũng không làm vẩn đục
môi trường lỏng như vi khuẩn mà mọc thành một lớp màng trên bề mặt hoặc
lắng ở đáv bình thành đám như những sợi bông.
1.1.3. Đặc điểm nuòi cấy [5, 6,16,18]
Nhiều tác giả đã coi các đặc tính nuôi cấy như là dấu hiệu quan trọng để
xác định loài Streptomyces. Đó là các đặc điểm như màu sắc khuẩn ty khí sinh,
cơ chất và dạng khuẩn tv khí sinh (dạng nhung, dạng phấn ), sự tạo thành các
giọt nước trên bề mặt khuẩn ty khí sinh, sắc tố hoà tan trong các môi trưòíng nuôi
cấy.
Sắc tố hoà tan cũn2 có nhiều loại: nâu, vàng, tím, đỏ, xanh da tròd, xanh
lục Người ta lại chia sác tố hòa tan làm hai loại di truyền và không di truyền,
nếu là sắc tố di truyền thì không thay đổi sau 30 ngày nuôi cấy, ngược lại sắc tố
không di truyền thì thay đổi theo điều kiện và thời gian nuôi cấy: pH, nhiệt độ,

thời gian nên lúc có màu lúc không màu.
1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá [5,16,18]
Nhiệt độ ứiích hợp cho sự sinh trưcmg và phát tiiển của Streptomyces là 25
- 30° c, pH trung tính, ở giá trị pH 5,0 có rất ít bào tử phát triển. Bào tử
Streptomyces bị tiêu diệt ở nhiệt độ 70° c trong 10 phút. Khả năng chịu muối,
sống trong điều kiện khô tuỳ thuộc vào từng loài.
Nhiều tác giả cho rằng các đặc tính sinh lý, sinh hoá không phải là dấu
hiệu quan trọng để phân ioại Streptomyces. Tuy nhiên khi mô tả một loài
Streptomyces cần đề cập tới vấn đề này bởi vì nó đánh giá được túứi chất sinh
học của loài đó. Hơn nữa, những đặc tính này tuy không ổn đinh nhưng không
thể không dùng tói nó khi xác định các loài có cùng các đặc túih khác (nuôi cấy,
hình thái ) giống nhau.
Tuỳ theo loài Streptomyces có các đặc tính sinh hoá như :
• Dịch hoá gelatin
• Làm đông vón và pepton hoá sữa
• Thuỷ phân tinh bột
• Đồng hoá các nguồn carbon khác nhau
• Thuỷ phân cellulose
• Khử niừat
• Sự hình thành sắc tố melanin
• Sinh HjS
1.1.5. Sự tạo thành kháng sinh của Streptomyces [2,8,9,12,17]
Chi Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất kháng sinh thuộc
các nhóm khác nhau như: các aminoglycosid, phenicol, các tetracyclin, các
macrolid, rifamycin và các kháng sinh chống nấm. Nhưng do độc tính của
chúng nên chỉ có rất ít txong số đó được sử dụng trong điều trị cho con người.
Những chủng khác nhau của một ỉoài có thể sinh tổng hợp những kháng sinh
khác nhau, chẳng hạn s. griseus có thể cho các chất streptomycin, cycloheximid,
streptocin hay s. /radiae có thể cho neomycin, íradicin.
Có những loài có thể cho vài chất kháng sinh tương tự nhau ví như các

viomycin A, B, c của loài s. vinaceus. Tuy nhiên, cùng một chủng ưong ĩihững
điều kiện sinh tổng hợp khác nhau có thể cho những chất khác nhau điển hình là
các actinomycin. Nói chung các Streptomyces đều kháng các kháng sinh do
chúng tạo ra.
Bảng 1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces.
S'1'1'
Tên kháng sinh
Nhóm
Nguồn gốc
1
Streptomycin
Aminoglycosid
s. griseus
2
Kanamycin
Aminoglycosid
s. kanamyceus
3
Tobramycin
Aminoglycosid
s. tenebrarius
4
Neomycm
Aminoglycosid
s.fradiae
5
Cloramphenicol Phenicol
s. venezuelae
6
Tetracyclin Tetracyclin s. viridifaciens

7
Oxytetracyclin Tetracyclin
s. rimosus
8
Erythromycin
Macrolid
s. erythreus và S.sp khác
9
Rifampicin Rifamicin s. mediterranei
10
Lincomycin Lincosamid s. ỉincolnensis
11
Nystatin Kháng sinh chống nấm s. noursei và s. griseus
12
Amphotericin
Kháng sinh chống nấm
s. nodosus
1.2. Phân loại Streptomyces [5,11,13,14,15,16,18,19]
Streptomyces là vi sinh vật đã được nghiên cứu rất nhiều về phân loại cũng
như khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chúng. Hàng triệu chủng đã được
phân lập ở các phòng thí nghiệm ữên khắp thế giói, và số chủng được xác định
tên đã lên tód trên 600 chủng.
Khi nghiên cứu một chủng xạ khuẩn cho kháng sinh, bên cạnh việc phân
lập chủng, giữ chủng, tìm điều kiện lên men thích hợp, chiết xuất và xác định
thành phần kháng sinh, việc xác định chủng giống là một khâu quan trọng
Việc phân loại xạ khuẩn nói chung wkStreptomyces nói riêng là một vấn đề
khá phức tạp. Ngàv nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các
phương pháp tiên tiến đã được ứng dụng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên,
không phải nơi nào cũng có điều kiện để sử dụng các phưoíng pháp hiện đại, do
đó một số phương pháp cổ điển vẫn được dùng.

Các phương pháp phân loại cổ điển thường dựa trên đặc điểm nuôi cấy,
hình thái, sinh lý sinh hoá, khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định và điều kiện
sinh thái. Sau đây là một số khoá phân loại phổ biến :
1.2.1. Khoá phân loại xạ khuẩn đối kháng theo Gauze 1957 [5]
Khoá phân loại này chủ yếu dựa vào màu sắc của hệ khuẩn ty khí sinh và
cơ chất khi nuôi cấy trên hai môi trưcmg có ngiổn nitrat vô cơ và hữu cơ.
Theo đó, xạ khuẩn {Actinomyces) đối kháng được chia thành 15 nhóm
(seris- một vị trí trung gian giữa loài và giống).
1.2.2. Khoá phân loại Waksman 1961 [5]
Khoá này đã mô tả 252 loài Streptomyces dựa trên các tính chất:
• Kích thước, hình dạng và cấu tạo bề mặt của bào tử, hình thái cuống sinh
bào tử, màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất.
• Sự thay đổi màu sắc môi trường khi xạ khuẩn phát triển.
• Sự hình thành sắc tố đen (melanin) trên môi tatờng có protid.
• Sự hình thành sắc tố hoà tan trên môi trường tổng hợp, một số tính chất
sinh hoá, đặc biệt là khả năng ihuỷ phân tinh bột, thuỷ phân protid, khử
nitrat, sinh H2S, sử dụng carbon và sự hình thành các chất kháng sinli đặc
hiệu.
1.2.3. Khoá phàn loại xạ khuẩn của Krassilnikov 1970 [5]
Để xây dựng khoá phân loại này, tác giả đã dùng các đặc tính sau đây:
• Đặc tính hình thái: Hình dạng và kích thước của bào tử, cuống sinh bào
tử, cách hình thành bào tử và cấu tiTJC màng bào tử.
• Đặc tính nuôi cấy: Hình dạng và cấu tạo của khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty
khí sinh và môi ti-ường, các sắc tố tiết ra môi trường.
• Hoạt tính men của xạ khuẩn: Khả năng hình thành các men phân huỷ
protid, cellulose, men khử nitrat và các men khác như catalase, urease
• Khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng: Nguồn carbon (glucose,
mannitol ), nitơ từ các nguồn khác nhau (muối amon, nitrat )
• Khả năng tạo các sản phẩm trao đổi chất, chủ yếu là chất kháng sinh.
Toàn bộ lớp xạ khuẩn {Actinomycetes) được Ki-assilnikov chia ra làm hai

lớp phụ, 6 họ và 26 giống, Streptomyces thuộc giống Actinomyces. Giống
Actinomyces lại được chia làm 16 nhóm dựa trên màu sắc hệ sợi, sắc tố hoà tan
và hình thái cuống sinh bào tử.
1.2.4. Khoá phân loại - ISP 1972 [13,14,15]
Hiên nay, khoá phân loại này được dùng rất phổ biến dựa trên các đặc điểm:
• Màu sắc khuẩn ty lchí sinh, cơ chất, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, số
bào tử trên một chuỗi.
• Sắc tố hoà tan trong môi trường hữu cơ.
• Khả năng hình thành sắc tố đen (meỉanin)
• Khả năng đồng hoá các nguồn carbon khác nhau (các loại đường: glucose,
galactose, mannitol, inositol ).
Theo khoá phân ỉoại đơn giản của Eberhard Küster [13], đã có 274 loài
Streptomyces được xác định tên.
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên liệu
2.1.1.1. Các mẫu đát
Các mẫu đất dùng để phân lập Streptomyces được lấy ờ một số ruộng ttồng
lúa, hoa màu và đất vườn thuộc huyện Thưòng Tín, tỉnh Hà Tây.
2.1.1.2. Các chủng Streptomyces đặi diện để nghiên cứu.
Chúng tôi đã phân lập được 89 chủng Streptomyces khác nhau. Sau khi thử
hoạt tính kháng khuẩn của các chủng này, chúng tôi đã chọn ra 4 chủng có tác
dụng ức chế Candida albicans để nghiên cứu tiếp, nhằm xác định sơ bộ tên của
các chủng này và chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho hoạt tính kháng sinh
cao.
2.1.1.3. Chủng vi sinh vật kiểm định.
Vi khuẩn Gram (-)
Escherichia coli
Proteus imrabilis
Shigella flexneri

Salmonella typhi
Pseudomonas aeruginosa
Vi khuẩn Gram (+)
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
Sarcina lutea
Vi nấm: Candida albicans
ATCC 25922
BV108
DT112
DT220
VM201
ATCC 12228
ATCC9946
NTCC 8241
ATCC6633
ATCC9341
ATCC 10231
Các vi sinh vật kiểm định là những chủng quốc tế hoặc được phân lập ở các
viện nghiên cứu hoặc bệnh viện của Việt Nam.
2.I.I.3. Môi trường: 19 mội trường đã sử dụng trong quá trình nghiên cứu
là các môi trường của ISP và từ những tài liệu nghiên cứu về Actinomycetes của
thế giới. Những môi trường này được nêu cụ thể trong các thí nghiệm.
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm
2.1.2.1. Phương pháp lây mẫu đất
Để phân lập các chủng Streptomyces chúng tôi đã tiến hành lấy các mẫu đất
ruộng và đất vưcm ở độ sâu 10-20 cm, tại 10 địa điểm khác nhau với khoảng
cách từ 5 km đến 10 km, sau đó trộn đều để phân lập chủng.

2.1.2.2. Phương pháp phân XỈỊụStreptomyces
Mỏi trường MTl: Gauze I
Tinh bột khoai tây 20, 0 g
KọHPƠ4 . v ạ o

0, 5 g
N aC l 0, 5 g
MgSƠ4. 7HọO
0, 5 g
FeSƠ4. 7HọO

0, 001 g
KNO3

l,Og
Thạch

18, Og
Nước cất 1000 ml
pH 7,0 - 7,2
Nshiền nhỏ mẫu đất chứa xạ khuẩn cần phân lập trong một cối sứ nhỏ vô
trùng, sau đó lấv 1 gam từ cối cho vào lOOml dung dịch KCuOj 0,4% mới pha
rồi lắc đều trong 2 giờ (bằng máy lắc hoặc bằng tav) ta được hỗn dịch đất có
nồng độ lO'". Sau đó pha loãng để có các hỗn dịch đất ở nồng độ 10'\ 10"^, 10'^,
10-"
Q
Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml hỗn dịch của các nồng độ lên txên bề mặt
thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều khắp bề mặt đĩa, nuôi cấy ở 28-30° c ữong
5 - 7 ngày.
Sau thời gian nuôi cấy các khuẩn lạc Streptomyces sạch, mọc riêng rẽ được

cấy chuyển sang ống thạch nghiêng Gauze I.
2.I.2.3. Phưoìig pháp thử hoạt tính kháng sinh.
• Các môi trường thử hoạt tính kháng sinh:
Mối trường MT 1: Gauze I
Mối trường MT2: pH 7,0 - 7,2
Bột đậu tương
15, Og
Bột khoai tây 20, 0 g
Cao m en 10, 0 g
K2HPO4.7H2O
0, 5 g
MgS04.7H2Ơ

0, 5 g
KN O 3 l,Og
N a Q 0, 5 g
Thạch 18, Og
Nước c ấ t 1000 ml
Môi trường MT 3:
Pepton
3, Og
G lucose 20, 0 g
K2HPO4.7H2O l,Og
MgSƠ4 JH .O
0,5g
NH4NO3 l,Og
T hạch

18, Og
Nước c ấ t 1000 ml

pH 7,0-7,2
Môi trường MT 4:
Glucose
20,0 g
Cao n g ô
5,0g
K2HPO4.7 H2O 0, 5 g
MgS04.7H20 0, 5 g
CaCOj 4, 0 g
NH4NO3 2, 0 g
Thạch

18, Og
Nước c ấ t
1000 ml
pH 7,0 - 7,2
Mối trường MT 5:
Bột gạo

20,0 g
Bột đậu tương 10,0 g
N aC l
0,5 g
CaCOs 4,0 g
NH4NO3

2,0g
T hạch
18,0 g
Nước c ấ t

1000 ml
pH 7,0-7,2
• Môi ừiròfng nuôi cấy vi khuẩn
Mối trưòĩig MT 6 :
Pepton

10, 0 g
Cao t h ịt

2, 0 g
Cao nán m e n
3, 0 g
G lucose

l,Og
Thạch 15, 0 g
Nước c ấ t 1000 ml
pH 7,0-7,2
• Môi trưòtig nuôi cấy vi nấm:
Mỏi trường MT7 : Sabouraud
Pepton
10,0 g
Glucose

20,0 g
Thạch

18,0 g
Nước c ấ t

1000 ml
pH 5,8 - 6,0
Nguyên tắc: Sự khuếch tán của chất kháng sinh vào môi trường sẽ tạo
vòng ức chế vi sinh vật kiểm định có đường kmh tỷ lệ thuận với logarit nồng độ
kháng sinh.
Các chủng Streptomyces được cấy ria trên các đĩa petri với những môi trường
khác nhau. Sau 5 - 7 ngàv nuôi cấy ở 28 - 3QP c, lấy ra thử tác dụng kháng
khuẩn bằng phương pháp khối thạch (Ezopob 1969). Vi sinh vật kiểm định được
nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó được làm thành nhũ dịch
có khoảng 10'-10^ tế bào trong Iml với NaCl 0,9%.
Chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của 89 chủng phân lập được
trên môi trưòmg MTl, sau đó bốn chủng được chọn nghiên cứu sẽ được thử tiếp
trên các môi trường MTl, MT2, MT3, MT4 và MT5 để so sánh chọn môi trưÒTig
thích hợp cho mỗi chủng sinh tổng hợp kháng sinh.
2.I.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cày và đặc điểm hình thái
Các chủng được nuôi cấy trong 7 ngày, sau đó xác định màu sắc khuẩn ty,
sắc tố hoà tan của các chúng. Hình dạng cuống sinh bào tử được quan sát trên
kính hiển vi quans học bằng phương pháp microfilm.
Bề mặt, kích thước, hình dạng bào tử được quan sát trên kính hiển vi điện tử
JEOL 1010- TEM, Viện vệ sinh dịch tễ trung ương.
Các ĩĩiôi trường nuôi cấy;
Mối trường MTl: Gauze I
Mỏi trường MT 8 : glucose - asparagin
L- asparagin

0,5 g
G lucose

10,0 g
K2HPO4.7H2O

0,5 g
Thạch

18,0 g
Nước cất
1000 ml
pH 6 ,8 -7,0
Môi trường MT 9: môi trường tổng họrp
Cao th ịt
5, 0 g
Pepton

5,0g
N a Q
5, 0 g
Glucose l,Og
Thạch 18, 0 g
Nước c ất

1000 ml
pH 6 ,8 - 7,0
Mối trưòng MTIO:
Khoai tây gọt v ỏ


200, 0 g
G lucose
20,0 g
CaCOa

0, 2 g
MgS04.7H2Ơ : 0 , 2 g
Thạch



5,0 g
Nước cất 1000 ml
pH 7,0- 7,2
Mỏi trưởng MTl 1: Môi trưcmg men tinh bột
Tinh bột tan

20, 0 g
Cao men 10, 0 g
Thạch
18, 0 g
Nước c ấ t 1000 ml
pH 7,0-7,2
2.I.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hoá
Thử khả năng dich hoá gelatin
Môi trường MT12:
G elatin
100, 0 g
Pepton




5, 0 g
Glucose 20,0 g

Thạch


18, 0 g
Nước cất
.

1000 ml
pH 7,4-7,6
Nuôi cấy các chủng Streptomyces trên môi trường MT12 ở 25 - 28°c, sau 7
ngày khả năng dịch hoá gelatin bằng cách nhỏ dung dịch acid acetic đặc lên
khuẩn lạc và lên khắp bề mặt thạch, nếu xuất hiện vòng ữong xung quanh khuẩn
lạc thì kết luận chủng Streptomyces này có khả năng dịch hoá gelatin.
Thử khả năng thuv phán tinh bỏt
Mối trường MT13: (ũH 7,0-7,2)
Pepton



5, 0 g
Cao th ịt



5, 0 g
N a Q


5, 0 g
Tinh b ột

.

10, 0 g
Thạch 18, 0 g
Nước c ấ t
1000 ml
Sau 7 ngày nuôi cấy các chủng trên mồi trường MT13, dùng dung dịch
lugol nhỏ lên khuẩn lạc và trên khắp bề mặt môi trường, nếu tinh bột bị thuỷ
phân sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trường vẫn còn tinh
bột thì có màu tím.
Khả năng làm đông vón và pẹpton hoá sữa
Mối trưòng MT 14:
Sữa tưoi loại b ơ 1000 ml
CaCOs

0, 02 g
pH 7,0- 7,2
Nuôi cấy Streptomyces ở nhiệt độ 28°c trên môi trường MT14, sau bảy
ngày quan sát sự đông vón và pepton hoá của sữa bằng cách quan sát sự biến đổi
màu trên môi trường trên ( từ màu sữa sang màu vàng ).
Khả năng thuv phân casein
Môi trường MT15: Casein hydrolysis
Sữa gầy
100, 0 g
T hạch 18, Og
Nước c ất
1000 ml
pH 7,0 - 7,2
Tiệt trùng ở 110°c trong 20 phút
Nuôi cấy Streptomyces trên môi trường 15 sau 1-2 tuần đánh giá khả năng

thuỷ phân casein qua độ trong của phần môi txưòfng xung quanh khuẩn lạc.
Thử khả năng đóng hoá các nguồn carbon khác nhau
Mối trường MT16 (ISP 9)
I. Dung dịch vết muối (Pridham and Gottlieb)
CUSO4. 5 H3O 0,64 g
FeS0 4 . 7 H, 0 0,11 g
Mncụ. 4 H .0 0,79 g
ZnSO 7HọO 0,15 g
Nước cất 100,0 ml
pH 6,8 - 7,0
II. Môi trưòíng cơ bản
(NH4),S04
2, 64 g
KH.PO4
2, 38 g
K2HPO4.3 H .O


5, 65 g
M g S 04 .7 H 2 Ơ
l,00g
Thạch 15, 0 g
Dung dịch vết muối (I) 1, 00 ml
Nước cấ t 1000 ml
pH 6,8 - 7,0
III. Nguồn carbon bao gồm các loại đưcmg sau đây:
D - glucose D - fructose
L - arabinose D - lactose
I - inositol D - galactose
D - mannitol

Tiệt trùng môi trường cơ bản (II), để nguội đến 60 °c và bổ sung đường đã
được lọc qua màng lọc vi khuẩn sao cho nồng độ đường trong môi trường cuối
cùng là
1
%.
Đọc kết quả sau khi nuôi cấy 10-20 ne;ày. Chứng dưomg tứủi là môi trưòfng
có D- glucose, chứng âm tính là môi trường không có nguồn carbon.
Thử khả năng thuỶ phán cellulose
Môi trường MT17:
Cao men 5,0g
CaCOs 1, 0 g
Thạch 18, 0 g
Bột cellulose

5,0 g
Nước cất
1000 ml
pH 7,0 - 7,2
Sau khi nuôi cấy trên đĩa petri một đến hai tuần, chủng Streptomyces nào tạo
thành vòng txong suốt xung quanh các khuẩn lạc thì chủng đó có khả năng phân
giải cellulose.
Thử khả nàng hình thành sác tố đen ( melanin)
Mỏi trưcmg MT18: (ISP 6 )
Pepton
20, 0 g
Sắt amonicitrat
0, 5 g
K2HPO4 1, 0 g
Na2S2Ơ3
0,08g

Cao men l,Og
Thạch
18, 0 g
Nước cất 1000 ml
pH 7,0 - 7,2
f
17
Nuôi cấy Streptomyces, sau một tuần quan sát đánh giá sự hình thành sắc tố
này qua sự tíiay đổi màu sắc của môi trường. Nếu môi trường chuyển sang màu
nâu đen hoặc đen thì kết luận chủng có khả năng hình thành melanin (dương
tính), nếu không xuất hiện các mầu trên thì âm tính
Thử khả nàng khử nitrat
Mỏi trường MT19:
Pepton
5,0 g
Cao thịt

3,0 g
KNO3 l,Og
Nước cất

lOOOml
pH 7,0-7,2
Sau 5 - 7 ngày nuôi cấy, sự khử niữat được phát hiện bằng cách thêm 1 ml
thuốc thử acid sulfanilic (8 g acid sulfanilic ữong 1 lít acid acetic 5 N) và 1 ml
thuốc thử dimethyl - a- naphthylamin (6 ml dimethyl - a- naphthylamin ữong 1
lít acid acetic 5 N) vào ống đã nuôi cấy;
- Nếu có màu đỏ xuất hiện thì phản ứng là dương túứi.
- Nếu không có màu đỏ cần thêm một ít bột kẽm vào ống thử, nếu có màu
đỏ chứng tỏ niữat còn trong ống nuôi cấy bị bột kẽm khử thành nitrit phản

ứng âm tính.
Trường hợp không có màu đỏ xuất hiện sau khi thêm bột kẽm thể hiện sự
khử nitrat của các chủng nghiên cứu đến NH3 hoặc N2.
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1. Phân lập Streptomyces và thử hoạt tính kháng sinh.
Qiúng tôi đã tiến hành phân lập được 89 chủng Streptomyces từ các mẫu
đất trên, ký hiệu các chủng từ SI đến S89. Phần lớn các chủng có kliuẩn ty khí
sinh màu xám, một số có màu hồng, màu trắng.
Tất cả các chủng này đều được thử hoạt tính kháng sinh, thể hiện qua khả
năng ức chế vi sinh vật kiểm đinh được tình bày b bảng 2.
Qua các số liệu trong bảng 2 ta thấy trong số 89 chủng Streptomyces phân
lập được có 52 chủng có ức chế ít nhất một vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ),
chiếm 58,42% tổng số chủng phân lập được. Trong đó có:
• 7 chủng chỉ ức chế vi khuẩn Gram âm, chiếm 13,46%
• 41 chủng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dưofng chiếm 78r85%
• 11 chủng ức chế 7 vi sinh vật kiểm định trở lên, chiếm 21,15%
• 17 chủng ức chế nấm, chiếm 23,69%
Từ kết quả trên chúng tôi đã chọn ra bốn chủng khả năng ức chế Candida
albicans mạnh để nghiên cứu chọn môi trường tối ưu cho kháng súứi và xác định
tên của các chủng này. Đó là các chủng có kí hiệu Sl, S31, S32 và S34
2.2.2. Chọn môi trưòng sinh tổng hợp kháng sinh thích hợp cho các
chủng nghiên cứu.
Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của bốn chủng Sl, S31,
S32 và S34 trên các môi trường MTl, MT2, MT3, MT4, MT5 được aình bày ở
bảng 3. Từ bảng 3 chúng tôi nhận thấy môi ứường MTl thích hợp với chủng Sl,
S31, S32 và môi trường MT5 thích hợp cho chủng S34 phát ttiển và sinh tổng
hợp kháng sinh. Đây là hai môi trường có nguồn đường và đạm đơn giản, dễ
kiếm: tinh bột khoai tây, kali niữat (MTl), bột gạo, bột đậu tương, amoni nitrat
(MT5).

Bảng 3.
Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Sl, S31, S32, S34
(Biểu thị bằng đường kính vòng ức chế vi sinh vật kiểm định c. albicans)
Đường kính vòng ức chế vsvkđ (mm)
Môi trường
SI
S31 S32 S34
MTl 2 L2
23,5 22,5
2 0 ,0
MT2 14,2
18,5 20,3 2 0 ,6
MT3
17,2
17,2
14,0
21,3
MT4 13,7 14,0 15,6 26,3
MT5
19,4
16,0 16,0 28,8
Ảnhl. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S34 trên các môi tìxròíng
(Chủng chỉ thị Candida albicans ATCC10231)