Sử dụng lectin chiết tách từ mít dại ( artocarpus masticata moraceae ) để tinh chế và xác định hàm lượng iga trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung

Bộ Y TẾ
TRƯỜNÍ Ỉ ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
- -
HÀ THỊ MINH CHÂƯ
s ủ DỤNG LFXTIN CHIẾT TÁCH TỪ MÍT DẠI
(ARTO CA R P Ư S M A ST IC A T A M O R A C E A E ) ĐỂ TINH CHẾ
VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNí; IgA TRONG DỊCH TÍÊT CỦA
BÊNH NHÂN VIÊM cố TỬ CUNG.
Giáo viên hướng dẫn : PGS. TS ĐÀO KIM CHI
ThS, N(;UYỄN VÃN LỢI
Sinh viên thực hiện : HÀ THỊ MĨNH CHÂU
Nơi thực hiện : lìộ MỎN HOÁ SINH
Thời gian thực hiện : 03/2002 - 05/2002
HÀ NỘI 05 - 2002
jQỜ9^@cẨM(fn
aùti hàij, lú Lồttg. hiỀÍ o'tt iãtL ằắe. têưJ)^Ẵ. ^ àũ C K im . & ti im
OTírĩ. QtgMitỊhí <ĩ)ăn Mọi, nhữtiạ. tiqưĩỉi ¿tã tậtt Íìttíi itướttg, dẫtt, kíuiỊỊỀii
idtíeii ĩtônợ, íùỀti ettt Irtìttợ. ằtiối quả Ịrìtilt ihư& itÀỀtt đễ. tà i nàtj^,
<5/11 ae/it ehâtt títàttii eâtn o'fi CTtỹ ^ 0 Qlạạe MÌỀỉt. trưỜỊtạ. ^ ạ ỉ họe
3Cỉttía hoa ÍT h’ ttiùỀti Ịhuôe ^rùòttiỊ ^ ạ i “700e, Q « tfé giíi '3C>à Qỉộl, nạưò'í đã
quan tồtn ohỉ ĩmo oà cỉto ettt tthiềtt tị kiỂMi qutị htỉti.
ò m eiittíỊ x itt ehíìĩì ỉh à ttỉt etittt o'tt íTrV Q ígttụễư (Xjuătt ^hắng.
eùttạ Ufàtt iitỉ eáe. thầíị eô giát), eô ^Ịtạtn ^ítattit ^Mtùơttq oà ũáe. eâ kụ
ỉhuật ơiỀtt trong, hô tttôtt '3ỗtìá sinỉt ^rưỉutíị ^ a i íw e ^u'tì'e 3iCrt Qĩ.ôíf íỹ cí.
QtạuụễMt '3õạnh - ^riiònq Ịỉỉiồiĩq, £a'Tio Sin ít itơd - <Ĩ)ÌỀMI <ĩ)ị sinit íỉịeh
íễ, CKhtìíỉL ^ Itụ Sảtt - ^ ệttií oJệjt ^pitụ Sàti Qlội đă tận ỉínii ạiáụ đ è tạú
đỉềií kiện thuận lợi eito £ỉti trtìitạ iuối litòt gỉm t húũ iập, oă kỡàti Ihàttít
kltoả luậtt íốt ttạiùỀp,.
'Tôà Qtồif iháttạ. 5 năttt. 2002
Sinh oiỂit
7ôà ^ h ị Mình. & tân

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ƠÍI
Các chữ viết tất trong khoá luận
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1 : TỔNG Q U A N 3
1.1 Sơ lược về lecitin 3
1.1.1 Lịch sử của lectin 3
1.1.2 Các tính chất của lectin 6
1
1.1.3 Các phưtĩng pháp tinh chế ỉectin
10
1.1.4 ứ ig dụng của lectin 11
1.2 Cấu trúc, chức năng và vai trò của các globulin miễn địch trong hệ
thống miễn dịch của cơ thể 12
1.2.1 Một số khái niệm chung 12
1.2.2 Chức năng của các globulin miễn dịch trong hệ thống miễn
dịch của cơ thể 13
1.2.3 IgA- Đặc điểm, cấu trúc và mối liên quan với các bệnh lý 14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ kẾT QUẢ 17
2.1 Nguyên ỉiệu và phưcíng pháp thực nghiệm

17
2.1.1 Nguyên liệu
17
2.1.2 Hoá chất và thuốc thử
18
2.1.3 Thiết bị và máy móc
18
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét
25
2.2.1 Nghiên cứu khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin trong dịch
chiết thô 1(D 1)

.
25
2.2.2 Giai đoạn chiết lectin từ hạt mít dại 25
2.2.3 Giai đoạn kết tủa Protein- lectin
26
2.2.4 Giai đoạn tinh chế leclin mít d ạ i
28
2.2.5 Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin.
.
.
31
2.2.6 Kết quả điện di lectin mít dại tinh chế trên gel polyacrylamid 32
2.2.7 Kết quả tinh chê IgA bằng cột sắc ký ái lực Sepharose-
Jacalin 32
2.2.8 Kiểm tra khả nãng kết hợp của IgA tinh chế và lectin mít dại
tinh chế bằng phưcfng pháp ELLA

34
2.2.9 Sử dụng lectin mít tinh chế xác định sự thay đổi hàm lượng
IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung

35
2.3 Bàn luân 37
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X U Ấ l

39
Tài liệu iham khảo
CÁC CHỬ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN
AFP :
Alpha - Fetoprotein
AIDS :
Acquired Immunodificiency Syndrom
BSA :
Bovine serum Albumin
C D / :
Cluster of Differentiation
Con A :
Concanavalin A
DI :
Dịch chiết thô
D2 :
Dịch chiết hoà tan sau tủa
D3 :
Dịch thu hồi lectin
DEAE:
Dimethyl aminoethyl
E U SA :
Enzyme “ Linked Immuno Sorbent Assay
E L L A :
Enzyme - Linked Lectino Sorbent Assay
HĐR :
Hoạt độ riêng
H Đ TS;
Hoạt độ tổng số
HAA :

Heamatoagglutinating activity
HIV :
. Human Immunodeficient Virus
Ig :
Immuno globulin
kDa ;
Kilo Dalton
PBS :
Phosphate buffered saline
SDS :
Sodium dodecyl sulphate
ĐẶT VẤN ĐỂ
Nếu như Hormon, enzym, vitamin là những chất có đặc tính sinh học
có vai trò quan trọng đối với cơ thể thí lectin cũng là chất có đặc tính sinh học
đặc biệt. Mặc dù lectin không có nguồn gốc miễn dịch nhưng nổ vẫn có khả
năng kết hợp nhiều loại tế bào theo kiểu đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể,
liên kết với đường hoặc những hợp chất chứa đường.
Hơn một thế kỷ qua kể từ lần đầu tiên được phát hiện (1888), lectin đã
thu hút sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới bởi mức đô
phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng ứng dụng đa dạng của nó trong
các lĩnh vực của đời sống.
Lectin được phân bố nhiều nhất trong giới thực vật, đặc biệt tập trung ở
hai họ Fabaceae và Moraceae. Trong số những lectin được phát hiện thì lectin
được tinh chế từ chi Artocapus của họ Moraceae có những đặc tính đặc biệt và
đã được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực miễn dịch học như; khả năng kết hợp
đặc hiệu IgA, được sử dụng để tinh chế IgA và Iheo dõi hàm lượng IgA trong
một số bệnh, khả năng kích thích phan chia tế bào lympho, khả năng tưcfng tác
với glycoprotein ở bề mặt tế bào lyinpho T của người là phân tử kết hợp đặc
hiệu với virus HIV trong pha nhiễm khuẩn đẩu tiên của AIDS. Như vậy, lectin
tinh chế từ các loài mít đã thực sự trở thành công cụ hữu ích cho việc chẩn

đoán một số căn bệnh hiện nay trên thế giới.
ở Việt Nam đã có nhiều cồng trình nghiên cứu về lectin tinh chế từ các
loài mít và cũng cho một số ứng dụng khả quan. Kế thừa những thành quả của
các công trình trên, chúng tôi thực hiện đề tài này với các mục tiêu và nội
dung sau:
Chiết tách và tinh chế lectin từ cây Artocơrpus masticata G. Morơceae
có hiệu suât và độ tinh sạch cao.
Tinh chế IgA từ dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung.
Sử dụng lectin tinh chế ứng dụng để xác định hàm lượng IgA trong
dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung và người bình thường bằng
phương pháp ELLA.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 Sơ lược về ỉectin:
1.1.1 Lịch sử của lectỉn:
Năm 1888, Stillmark đã tìm ra một chất độc được chiết từ cây thẩu dẩu,
có hoạt tính ngưng kết hồng cầu, ông gọi chúng là ricin. Công bố của
Stillmark đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Sau ricin , các nhà khoa học
khác cũng tách chiết được các chất độc khác có đặc tính tương tự ricin như
abrin, crotÌn và còn phát hiện thấy các chất này được phân bố rộng rãi trong
cả giới thực vật và động vật. Đầu tiên, các nhà khoa học nhận thấy sự ngưng
kết tế bào hồng cầu của các độc tố nói trên mang tính chọn lọc nhóm máu [24,
25]. Vì vậy Boyd (1954) gọi chúng là lectin. Thuật ngữ này xuất phát từ tiếng
Latinh là “ lectus”, là thì quá khứ của động từ Legere có nghĩa là chọn lọc.
Sau đó, vào những năm cuối thập kỷ 60, khi nghiên cứu một số đặc điểm
sinh học của lectin cho thấy: có khoảng 25% lectin tìm thấy là có khả năng
gây ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [25]. Ngoài ra người ta còn phát hiện thấy
một đặc tính quan trọng nữa của lectin, đó là khả năng tưcmg tác với các loại
đường. Vì vậy khái niệm của lectin được bổ xung và định nghĩa như sau:
“Lectin là những chất có bản chất là protein hay glycoprotein có khả nãng
Wcfng tác vói đường và có đặc tính cơ bản là khả nâng gây ngưng kết tế bào"

[25].
Mặc dù các khái niệm của lectin thay đổi nhưng ‘lectin” vẫn được sử
dụng như một thuật ngữ khoa học.
* Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
Sau hơn 100 năm kể từ khi Stillmark tìm ra ricin - lectin đầu tiên, quá
trình nghiên cứu lectin tiếp theo được chia làm 3 giai đoạn:
Cuối tliế kỷ XIX đầu thể kỷ XX: Các nhà khoa học tập trung vào nghiên
cứu, điều tra sự phân bố của lectin trong giới sinh vật, rất nhiều công trình
nghiên cứu được công bô như của: Stillmark (1888), Helin (1891),
Lansteiner (1902), Lansteiner và Raubischeck (1903), Melden (Ỉ909),
Korbert(1913), Ludwingvaf Kraus(1902), Kayser(1903), Guyot (1908) đã
xác định lectin được phân bố rộng rãi trong thực vật, động vật và cả các vi
sinh vật như virus, vi nấm. [25J
Từ năm 1950- 1970: Ngoài các công trình về điều tra cơ bản, người ta bắt
đầu tập trung vào chiết tách tinh chế để xác định cấu tạo phân tù (cấu tạo
bâc ỉ và cấu trúc không gian) của lectin. Phương pháp tinh chế lectin đã
trải qua nhiều giai đoạn nghiên cứu từ sắc kỹ cột, đến sắc ký trao đổi ion và
cuối cùng dựa trên khả năng tưưiig tác đặc hiệu với đường của lectin, các
nhà khoa học đã tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký ái lực. Kỹ thuật
này đã được Agrwal và Golsteiner nghiên cứu và sử dụng đầu tiên vào năm
1965 [24J. Đây ỉà phương pháp tinh chế lectin hiệu quả nhất, cho chế phẩm
lectin có độ tinh sạch cao và hiện đang được sử dụng tại nhiều nơi trên thế
giới.
Từ năm 1970 đến nay: Nhờ sự hoàn thiện về kỹ thuật tinh chế lectin, các
nghiên cứu tiếp Iheo về lectin được phát triển mạnh sang hướng ứng dụng
trong các lĩnh vực của đời sống và đả đạt được những kết quả khả quan;
Lectin chiết tách từ các cá thể họ hàng gần gũi có những đặc tính sinh học
và có cấu tạo khá giống nhau (Soni-1982), (Wully-1984) được sử dụng làm
cơ sở để gián tiếp phân loại thực vật ở mức độ phân tử.
Lectin được chiết tách từ đậu thận đỏ {Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) có

khả năng kích thích sự phân chia bạch cầu người.
Lectin được chiết suất từ sam biển châu Mỹ {Lỉmulus polyphemus) có khả
năng phân tách bạch cầu và tế bào ung thư máu.
- Con A được sử dụng trong chẩn đoán một số bệnh ung thư có liên quan
đến sự biến đổi hàm lượng AFP dựa trên tương tác đặc hiệu giữa Con A và
AFP [23 j.
- Lectin của một số loài inít có khả năng kích thích phan chia tế bào lympho
T_CD4^ ở người, Lectin từ loài mít mật {ArỉocarỊ?us heteropbyỉỉus
Moraceae) còn có khả nâng tương tác với glycoprotein trên bế mặt tế bào
T_CD% , đem iại nhiều hy vọng cho một loại thuốc mới hữu hiệu trong
chẩn đoán và điều trị căn bệnh thế kỷ AIDS [31J.
* Nghiên cứu Lectin ở Việt Nam:
Nghiên cứu lectin mới được triển khai ở Việt Nam trong khoảng 20
năm nay (kể từ năm 1983) theo 3 hướng cơ bản:
• Điều tra sự phân bố lectin trong giới sinh vật ở Việt Nam.
• Tách chiết tinh chế và bước đáu nghiên cứu tính chất và cấu trúc của
lectin.
• Nghiên cứu ứng dụng của lectin.
Mặc dù thời gian nghiên cứu chưa nhiều nhưng cũng đã thu được nhiều kết
quả khả quan:
• Nhiều công trình điều tra đã khẳng định lectin có sự phân bố rông rãi
trong giới sinh vật của Việt Nam [2, 6, 15J. Nhiều công trình đã tách
chiết thành công một số lectiii, từ đó tiếp tục nghiên cứu tính chấl và
cấu trúc phân tử của chúng 12 |.
• Bước đầu nghiên cứu ứng đụng: Đưa lectin vào chẩn đoán thai sớm [2J,
tinh chế lgA| và nghiên cứu biểu hiện bệnh lý của chúng ở người [8], sử
dụng lectin để chẩn đoán bệnh nhiễm sán máng [9J.
Các nghiên cứu trên đây cho thấy một triển vọng tốt đẹp về nghiên cứu
lectin ở Việt Nam. Sô' lượng lectin tinh chế ngày càng nhiều và chắc chắn sẽ
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh học, dược

học, y học và đáp ứng với nhu cẩu thực tiễn Việt Nam.
1.1.2 Các tính chất của lectin:
Tính chất vật lý và hoá học:
Khới lượng phân tỉc Khối lượng phân tử của ỉectin rất khác nhau,
chúng có khoảng dao động rất lớn từ vài nghìn Da (Lectin rễ cây gai-
ưì ticaceơe 8500 Da), đến vài trăm ngiiìn Da (Lectin của loài sam biển châu Á
Tachyĩeus trideníus 700. 000 Da). Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khối
lượng phân tử của lectin khôtig liên quan đến hoạt tính của lectin và cũng
không mang tính đặc trưng hay mức độ tiến hoá của loài hoặc cá thể [24],
Tính tan: Lee tin có bản chất là protein nên có khả năng hoà tan trong
nước, đặc biệt đễ hoà tan trong dung dịch muối loãng. Vì vậy, nước muối sinh
lý thường được dùng để làm dung môi chiết, tách và tinh chế ỉectin. Ngược lại
lectin dễ bị kết tủa bởi aceton, alcol ở nhiệt độ thấp cũng như một số muối
trung tính ở nồng độ cao và kim loại nặng.
Khả năng tưong tác vói đường: Khả năng tưomg tác với đường là một
trong những đặc tính quan trọng của lectin. Lectin có khả năng tương tác với
đường đơn và cả các đường nằm trên bề mặt tế bào. Bản chất hoá học của
tưoíig tác này có nhiểu giả thuyết nhưng các nhà khoa học đều thống nhất: Sự
bển vững của liên kết giữa đường và lectin được duy trì bởi liên kết phân cực (
liên kết hydro giữa - OH của đường và với đầu phân cực của gốc aminoaciđ
của phân tử lectin) và liên kết không phân cực (Lực Vanderwall) [24j.
Khả năng tưcmg tác đặc hiệu của lectin với đường đã được ứng dụng trong
nhiều nghiên cứu về tế bào học, miễn dịch học và huyết học. Đặc biệt dựa trên
khả năng tương tác đặc hiệu của leclin với đườiig đã cho phép sử dụng phương
pháp sắc ký ái lực để tinh chế nhiều sản phẩm lectin cũng như nhiểu loại
glycoprotein cho hiệu suấi và độ linh khiết cao.
Đặc tính sinh học của lectin:
Khả năng ngưng kết tế bào:
Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của ỉectin. Đặc tính này là
cơ sở để phát hiện ra lectin và phân biệt lectin với các chất sinh học khác cũng

có ái lực với đường như glucosidase, glycotransferase
Khả năng ngưng kết tế bào của lectin phụ thuộc vào bản chất của lectin (số
trung tâm Hên kết đường, cấu trúc không gian ) và còn phụ thuộc vào bản
chất của tế bào cần ngưng kết (receptor màng tế bào, thể chất màng ) Bên
cạnh đó những điều kiện gây ngưng kết như: nhiệt độ, pH, nồng độ tế bào,
nồng độ lecíin, chất gây ức chế ngưng kết. cũng có ảnh hưởng đến khả năng
ngưng kết tế bào của lectin [22J.
Đối tượng tế bào mà lectin có thể gây ngưng kết rất rộng, lectin không
chỉ có khả năng ngưng kết trên những tế bào động vật mà còn có khả năng
ngưng kết cả những tế bào vi khuẩn, nấm, vi sinh vật đơn bào Điều này đã
mở ra những khả năng nghiên cứu và ứng dụng lớn của lectin trong nhiều lĩnh
vực sinh y dược học, miễn dịch học
Khả năng kích thích và kìm hãm $ựphân bào:
Ngoài khả năng gây ngưng kết tế bào, khả năng kích thích phíln bào hay kìm
hãm sự phân bào cũng là đặc tính của lectin được ứng dụng nhiều trong y học
và miễn dịch học.
Lectin có khả năng kích thích phân bào nhiều loại tế bào khác nhau
trong đó kích thích mạnh nhất sự phân bào của tế bào lympho. Lectin xâm
nhập vào cơ thể có tác dụng như những kháng nguyên kích thích sự phân chia
các tế bào lympho, do đó chúng tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể.
Trái với khả năng kích thích phân bào, lectin còn có khả năng kìm hãm
sự phân bào. Điển hình ỉà với những lế bào ung thư, lectin kìm hãm sự phát
triển của tế bào khối u và ngăn ngừa sự di chuyển cửa chúng. Brucke đã giải
thích cơ chế như sau: khi leclin xầm nhập vào tế bào chủ sẽ tác động lên AND
và khởi động sự tổng hợp interferon. Interferon từ tế bào chủ được tiết ra xâm
nhập vào tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của khối u[2, 10J.
Các đặc tính sinh học khác:
Ngoài những đặc tính sinh học nói trên, lectin còn có nhiều đặc tính khác
như [26J:
- Sản sinh ra các tế bào T ức chế.

- Làm trung gian trong quá trình tiêu diệt tế bào đích của tế bào lympho và
đại thực bào.
- ITiúc đẩy quá trình thực bào của đại thực bào đối với nấm và vi khuẩn.
“ Tác dụng tương tự Insulin trên tế bào mỡ.
- Tham gia phản ứng giải phóng tiểu cầu.
- ức chế sự thụ tinh của trứng.
- Tương tác với hormon rau thai.
- Úc chế sự giải phóng Histamin từ tế bào Mast và tế bào ưa kiềm.
- Liên kết vi khuẩn cố định đạm[2J.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin:
Ảnh hưởnữ của ữH:
Yếu tớ pH có ảnh hưởng lớn trong quá trình tách chiết tinh chế lectin và
hoạt tính của chúng:
ở pH đẳng điện, lectin dễ bị tủa và có hoạt tính thấp nhất.
ở pH tối thích, hoạt tính của lectin được thể hiện tối đa.
Các nghiên cứu cho thấy ờ môi trường acid mạnh hoặc kiềm mạnh, hoạt tính
của lectin bị giảm hoặc mất hoàn toàn.
Ảnh hưỏnẹ của nhỉèt đô:
Lectin có bản chất là protein vì vậy rất dễ bị biến tính bởi nhiệt độ. ở nhiệt
độ quá thấp hoạt tính của lectin giảm, còn ở nhiệt độ cao hoạt tính của lectin
giảm đần rồi mất hẳn.
Ảnh hưởns của dườns đơn:
Các loại đườiig đơn có anh hưởng lớn tới hoạt tính ngưiig kết tế bào của
lectin, vì khi có mặt của đường đơn, trung tâm liên kết hydrocacbon của lectin
bị phong toả làm lectiii không liên kết được với các receptor trên bề mặt tế
bào, do đó tế bào không bị nguiig kết [2J.
Ảnh hưởne của enzvm:
Những enzym có khả năng biến đổi tính chất của màng tế bào cũng gây
ảnh hưởng lớn đến khả năng ngưng kết tế bào của lectin.
Một số enzym có khả năng thuỷ phân một số protein trên màng ỉàm bộc lộ ra

các receptor có bản chất là glycoprotein tạo điều kiện thuận ỉợi cho các phân
tử lectin gắn vào màng dễ đàng, do đó làm tăng hoạt tính của lectin. Nhưng
ngược lại, có những enzym như galactosiđase làm giảm hoặc mất hoạt tính
của lectin một cách rõ rệt [22J,
Ảnh hưởìie của các ion kim loai:
Hoạt tính của lectin cũng chịu ảnh hưởng của một số kim loại. Tuy nhiên,
ảnh hưởng của kim loại tớí hoạt tính của lectin là rất phức tạp và không tuân
theo một quy luật nào nhất định. Kim loại có thể hoạt hoá hay ức chế hoạt tính
của từng lectin ở một nồng độ nhất định. Thậm chí trên cùng một loại lectin,
một kim loại có thể gây tăng hoạt tính ở nồng độ này nhưng lại gây giảm hoạt
tính ởnồng độ khác [10J.
1.1.3 Các phương pháp tinh chế lectin:
* Sắc ký lọc gel:
Đây là phương pháp tách chiết lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa trên kích
thước phân tử. Chất giá thường được sử dụng là Sephađex. Mỗi hạt Sephadex
có bản chất là polysaccharid liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ xốp.Để tinh
chế lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G75 và Sephadex GIOO [16J.
* Sắc ký trao đổi ion:
Lectin có bản chất là protein nên phân tử của nó có mang điện tích. Tuỳ
thuộc vào pH môi trường mà lectin mang điện tích âm hay dương. Dựa ứên
tính chất này người ta sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tình chế lectin. Các
chất nhựa gắn ion như DEAE- Sephadex, DEAE- Cellulose thường được sử
dụng làm chất trao đổi ỉectin- ion [16].
* Sẩc ký ái lực: [16, 19J
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên khả năng kết hợp đặc hiệu của
lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand). Chất kết hợp này được
gắn trên một chất rắn tạo nên pha tình của cột sắc ký. Chất giá được sử dụng
là một số loại gel như Sephadex, Sepharose, Sepharyl.,. Quá trình sắc ký được
chia làm 3 giai đoạn:
- Gắn lectin lên cột: ở giai đoạn này lectin kết hợp đặc hiệu với chất kết

hợp và được giữ ỉại cột.
- Rửa cột: ở giai đoạn này những protein nào không có ái lực với lectin và
các protein thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
- Phản hấp phụ lectin khỏi cột: Dùng một dung dịch có ái lực hoá học
phù hợp để đẩy lectin ra khỏi cột.
Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tinh chế lectin lần đầu tiên
vào năm Ĩ965 [24], cho đến nay nó vãn được sử dụng rộng rãi VI kỹ thuật đơn
giản, cho hiệu suất cao và chất lượng chế phẩm rất tinh sạch.
1.1.4 ứng dụng của lectin:
Lectin đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống:
Trong huyết học: ỉectin được sử đụng để phân loại nhóm máu. Phương
pháp xác định này cho kết quả nhanh chóng và chính xác nhưng lại đòi hỏi
phải có loại lectin có tính đặc hiệu và độ tinh sạch cao.
- Trong tê bào học: Lectin được sử dụng để nghiên cứu một số cấu trúc
màng tế bào.Phương pháp sắc ký đã được sử dụng để xác định bản chất
glycoprotein của receptor màng tế bào.
- Miễn dịch học: lectin được sử dụng để phát hiện và tinh chế các hoạt chất
sinh học cớ ái lực với lectin như các globuỉin miễn dịch .Từ đó các nhà
khoa học có thể nghiên cứu cấu trúc, bản chất và chức năng của chúng
trong cơ thể. Lectin còn được ứng dụng làm chất kích thích miễn địch để
tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch cho cơ thể (lectin được chiết, tách
và tinh chế từ đậu thân đỏ Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) [23J
- Trong y học: lectin được sử dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh mang lại
hiệu quả cao và độ chính xác. Dựa vào khả năng phân biệt một số vi sinh
vật, lectin được sử dụng cùng với các xét nghiệm thông thường khác để
nâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh. Hiện nay trên thế giới, người ta ứng
dụng phương pháp ELLA (là phương pháp ELISA cải tiến) để xác định
virus gây bệnh [20j hoặc xác định hàm lượng một số chất mang hoạt tính
sinh học có ái lực cao với lectin. Dựa vào khả năng phân biệt tế bào bình
thường và tế bào ung thư, lectin được sử dụng để chẩn đoán sớm một số

bệnh ung thư. Ngoài ra lectin còn nhận biết được sự khác biệt của
glycoprotein giữa tế bào ung thư có khả năng di căn thấp và tế bào ung thư
có khả năng di căn cao. Do đó leclin có giá trị theo dõi và tiên lượng bệnh
[23J.
- Trong lĩnh vực dược học: lectin dùng làm thuốc tuy còn mới mẻ nhưng đã
mở ra nhiều triển vọng trong tương lai. Con A được sử dụng làm chất dẫn
đưa thuốc đến tế bào đích. Lectin đâu tưomg có khả năng ngăn cản thải loại
mảnh ghép, do đó tế bào luỷ xương ghép phát huy được chức năng tăng
sinh dòng bạch cầu và hồng cẩu, kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.
Lectin được chiết suất từ hạt cây mít mật {Artocarpus heterophyỉỉus
Moraceae) có khả năng tương tác đặc hiệu với glycoprotein ở bề mặt tế
bào T__CD/ là phân tử kết hợp đặc hiệu đầu tiên trong quá trình nhiễm
HIV, do đó có thể hạn chế nguy cơ mắc bệnh. Trong tương lai lectin có thể
sẽ được sử dụng ỉàm thuốc điều trị A!DS [31J.
- Trong kể hoạch hoá gia đinh: lectin được sử dụng để ngăn ngừa sự thụ
tinh của trứng, ngưng kết tinh trùng, chẩn đoán thai sớm và tưcfng tác với
hoiTnon rau thai [2J.
1.2 Cấu trúc, chức năng và vai trò của các globulin miễn dịch
trong hệ thống miễn dịch của cơ thể:
1.2.1 Một sô khái niệm chung;
Kháng thể cổ bản chất là các globulin hoà tan trong dịch sinh vật được
gọi là các globulin miễn địch (Ig). Đó miễn dịch là sản phẩm tổng hợp của tế
bào lympho B, là công cụ cơ bản để thực hiện phản ứng đáp ứng miễn dịch
bằng cách kết hợp dặc hiệu và vô hiệu hoá các chất lạ khi chúng xâm nhập
vào cơ thể.
*Cấu trúc chung củơ các globulin miễn dịch:
Phân tử globulin miẻn dịch được chia làm 5 lớp (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)
gồm một hay nhiều tiểu đơn vị có cấu trúc giống nhau [11, 16, 18, 21J.
Mỗi tiểu đcfn vị gồm 4 chuỗi polypeptid: Hai chuỗi nặng (Heavy chain) và
hai chuỗi nhẹ (Light chain) được nối với nhau bằng các cầu disulfua.

- Các chuỗi polypeptid này bao giờ cũng đi với nhau từng đôi một và giống
nhau hoàn toàn trong các phân tử Ig.
- Tất cả các globulin đều có chuôi nhẹ L thuộc kiểu K hoặc X, trong khi
chuỗi nặng H của các globulin có nhiều lớp khác nhau.
1.2.2 Chức năng của các globulín miễn dịch trong hệ thống miễn dịch
của cơ thể [7,11,18]:
* Chức năng nhận biết kháng nguyên:
Chức năng nhân biết kháng nguyên là chức năng rất quan trọng của các
giobưlin miễn địch, nó quyết định phản ứng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên-
kháng thể. Nhờ đó, các globulin miễn dịch trưng hoà được các kháng nguyên
như độc tố, vi khuẩn
Phân tử globulin miễn dịch kết hợp với quyết định kháng nguyên ở vị trí
gần hay chính vị trí hoạt động của kháng nguyên đo đó phong bế được phản
ứng của độc tố. Nếu điểm quyết định kháng nguyên nằm xa trung tâm hoạt
động của độc tố thì sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ ỉàm biến
đổi cấu trúc không gian của độc tố dãn đến kết quả độc tố không thể bám vào
các tế bào đích và hạn chế khả năng gây bệnh của kháng nguyên, ví dụ IgA
tiết ở niêm mạc đường tiêu hoá có vai trò ngăn vi khuẩn bám vào màng nhầy.
* Chức năng gây ngưtịg kết kháng nguyền:
Chức năng gây ngưng kết kháng nguyên là một trong những chức năng
sinh học khác của các globulin miễn dịch được coi như một chức năng thứ
phát vì khả năng này chỉ xảy ra sau khi các globulin miễn dịch đã thực hiện
xong chức năng kết hợp đặc hiệu kháng nguyên.
Các phân tử globulin miễn dịch của các lớp IgG, IgA, IgM, IgD, IgE có
khả năng ngimg kết vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng đơn bào, nhờ đó tạo điều
kiện thuận lợi cho quá trình thực bào.
* Chức năng hỗ trợ cho các quá trínk đại thực bào:
Các kháng nguyên khi đã được bao vây bởi các globuỉin miễn dịch thì
chúng dễ bị các đại thực bào bắt giữ và thực hiện quá trình thực bào. Đặc điểm
này đễ thực hiện vì các đại thực bào và bạch cầu trung tính có các receptor

cảm thụ với mảnh Fc của IgG và IgM. Hơn nữa, chúng còn có receptor cảm
nhận các mảnh bổ thể, khi đó khả nàng thực bào sẽ được tăng cường hơn nếu
các phân tử IgG và IgM có gắn bổ thể. Hiện tượng này gọi là “ opsonin hóa”.
* Chức nâng dung giải vi khuẩn:
Một số kháng thể thuộc lớp IgG và IgM có khả năng hoạt hoá bổ thể góp
phần làm tan một số vi khuẩn gram âm.
* Chức năng thay dổi tính thám thành mạch:
Khả nâng này được thể hiện rõ nhất ở kháng thể thuộc lớp IgE. IgE dễ
dàng gắn lên màng tế bào Mast và bạch cầu ưa kiềm. Sự tương tác này dẫn
đến quá trình giải phóng các chất trung gian hoá học như histamin, serotonin,
prostaglandin gây tăng tính thấm thành mạch, đo đó kháng thể trong máu
và đại thực bào dễ dàng Ịọt qua thành mạch đến tập trung ở vị trí có kháng
nguyên và thực hiện thuận lợi chức năng kết hợp kháng nguyên- kháng thể và
đại thực bào. Tuy vậy, nếu quá trình đáp ứng miễn dịch này xảy ra quá mạnh
mẽ sẽ gây nên tình trạng bệnh ìý, gọi là hiện tượng quá mẫn (sốc phản vệ) gây
nguy hiểm cho cơ thể.
1.2.3. IgA- Đặc điểm, cấu trúc và mòi liên quan với các bệnh lý [7, 21 j:
* Đặc điểm chung:
Trong hệ thống miễn dịch của người có hai loại IgA là IgA huyết thanh
và IgA tiết.
~ IgA huyết thanh chiếm khoảng í 5% - 20% tổng sô' globulin miễn dịch có
trong huyết thanh với nồng độ khoảng 2mg/ml, ở người Việt Nam khoảng
3,5mg/ml [14], IgA huyết thanh có hằng số lắng là 7S, khối lượng phân tử
160. OOOkDa, nó thường tồn tại ở dạng monomer (người ta ít gặp ở dạng
dimer).
- IgA tiết có trong dịch nước bọt, nước mắt, mồ hôi, sữa, dịch tiết đưcmg sinh
dục, dịch tiết đường tiêu hoá. IgA tiết chủ yếu tồn tại ở dạng dimer, có
hằng số lắng 7S, trọng lượng phân tử khoảng 400. OOOkDa. Nó được tổng
hợp tại chỗ từ tế bào plasma, gồm 2 monomer gắn với nhau bởi chuỗi J và
hợp phẫn tiết Sc.

IgA có hai phân lớp là IgA| và IgAj. Trong đó IgA| chiếm 80%. Cấu
trúc của IgAị và IgAj có sự khác biệt về chiều dài của chuỗi polypeptid và
phần cấu trúc hydradcarbon. ở phân tử IgAj không có cấu trúc có cấu trúc N-
Acetyl- Galactosamin nhưng lại tìm thấy cấu trúc này ở phân tử của IgAị.
• Đặc điểm miễn dịch học:
+ ỉgA có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhập của các
virus, vi khuẩn và động vật nguyên sinh.
+ IgA tiết có vai trò bảo vệ tại chỗ, ngăn cản sự xâm nhập của các kháng
nguyên vào cơ thể qua hệ thống niêm mạc. Đặc biệt, IgA tiết có khả năng tồn
tại ở pH thấp của dạ dày vì vậy trẻ em được hưỏmg một lượng lớn IgA từ sữa
mẹ, giúp trẻ tăng cường khả năng miễn dịch trong 6 tháng đầu của trẻ sơ sinh.
• IgA và mối liên quan với các bệnh lý:
Các globulin miễn dịch được sinh ra nhằm bảo vệ cơ thể khi chất lạ xâm
nhập vào cơ thể. Vì vậy sự biến đổi hàm lượng các globulin miễn dịch có liên
quan chặt chẽ với các tình trạng bệnh lý của cơ thể.
IgA là một globulin miễn dịch có vai trò chính trong việc ngăn ngừa sự
tấn công của các vi sinh vật qua biểu mô. Bình thường, nồng độ IgA trong
máu luôn ổn định nhưng khi có sự xâm nhập của các vi sinh vật qua biểu mô
thì hàm lượng IgA sẽ tăng lên trong máu. Đặc biệt đối với IgA tiết, cổ vai trò
quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại các vi khuẩn như E. Coỉi,
Salmonella, Shigella quã hệ thống niêm mạc. VI vậy sự tăng hay giảm hàm
lượng IgA thường có liên quan đến một số bệnh lý của cơ thể như:
- Bệnh chuỗi nặng (a) thuộc IgA thể hiện sự tăng sinh tế bào lympho xâm
nhập vào tế bào non, các hạch mạc treo làm teo nhung mao ruột, giảm sự
hấp thu dinh dưỡng và dẫn đến hậu quả suy dinh dưỡng đặc biệt ở trẻ nhỏ.
- Khi cơ thể thiếu hụt IgA thường đẽ bị nhiễm trùng hô hấp và đường ruột-
Đặc biệt ở trẻ sơ sinh thường được cung cấp IgA từ nguồn sữa mẹ trong khi
hệ thống miễn dịch chưa hoàn chỉnh. Vì vậy với những trẻ em không được
bú mẹ, thường bị mắc các bệnh nhiễm trùng hơn trẻ được bú đầy đủ sữa
mẹ. Sự thiếu hụt IgA còn có thể gây ra hiện tượng sốc khi bị nhiễm trùng

máu.
- Sự thiếu hụt IgA và IgG kèm theo sự tăng hàm lượng IgM cũng là nguyên
nhân tăng sản hạch bạch huyết và giảm mạnh số lượng bạch cầu trung tính.
Chính do những mối liên quan chặt chẽ giữa hệ thống miễn dịch và trạng
thái bệnh ỉý mà hướng nghiên cứu xác định sự thay đổi của các chỉ số globulin
miẽn dịch trong bệnh lý vãn đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa
học nhằm phát hiện sớm cũng như dự phòng và điều trị các bệnh có liên quan.
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ:
2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm;
2.1.1 Nguyên liệu:
^Nguyên liệu tách, chiết và tình chếlectỉn:
Nsuyên ỉỉêu: Hạt già của cây mít dại (hay còn gọi là hạt chay nhung-
Artocarpus masticatữ G. Moraceaè) thu hái tại Hà Nội. Tên khoa học của cây
được xác định theo phân loại của giáo sư Vũ Vãn Chuyên.
■nwỉ cii(i •
Í-VỈ mciitcala Q. ỊMc\ací a*.
milHliỊỈHI llll lllĩttnt
Ocm i 2
B 9 10' tt 1?
Hình 1. Ảnh hạt mít dại A. masticata G. Moraceae
Xử lý nsuvên liêu: Thu hái quả đã già, lấy hạt rủa sạch và sấy khô ở 40° c. Bóc
vỏ, nghiền thành bột mịn, cho qua rây cỡ 315. Bột nguyên liệu xử lý được bảo
quản trong lọ thuỷ tinh nút kín.
* M ầu bệnh phẩm:
Đối tượng lấy mẫu: Bệnh nhân đã được khám tại khoa phụ khoa, bệnh viện
phụ sản Hà Nội và kết luận bị viêm cổ tử cung.
Cách lấy mãu:
- Dùng bông vô trùng thấm lấy dịch tiết ở cổ tử cung.
- Cho bông đã lấy mẫu vào từng hộp riêng biệt.
Các hộp này được bảo quản ở nhiệt độ - 20® c.

Cách xử lý mẫu:
- Ngâm bông có thấm bệnh phẩm vào đệm PBS pH 7,4.
- Chiết 3 lán bằng đệm PBS pH 7,4.
- Thu lấy dịch chiết
- Kết tủa bằng amonisulphat 41% bão hoà, ổn định kết tủa trong 24 h.
- Ly tâm iấy tủa ở 4° c, 10 000 vòng/phút, hoà tan tủa bằng đệm PBS
pH 7,4.
2.1.2 Hoá chất và thuốc thử:
- Acrylamiđ, Bis Acrylamid, Broniuacỵanogen, Sodium azid,
D - (+) - Galactose, Amonisulphat (MERCK- Germany).
- Amonipersulphat (Kockligh - Japan).
- Commasie Brillant Blue R250 (Recinal - Hungary).
- Sepharose 4B (Pharmacia biotech AB - Sweden).
- Thuốc thử Folinciocalteur.
- Thuốc thử đồng kiềm.
“ Đệm Blocking pH 7,65.
- Anti- IgA gắn OP (Sigma).
- Cơ chất OPD (Sigma).
- Hồng cầu người nhóm máu A, B, o lấy tại Viện huyết học và truyền
máu trung ương được chống đông máu bằng dung dịch ACD, rửa 3 ỉần
bằng nước muối sinh lý 0,9%.
2.1.3 Thiết bị và máy móc:
- Máy ly tâm lạnh Biof'uge I5R. (Gennany)
- Máy đo quang phổ UV-VIS.
- Máy chạy điện di Hoffoe Small II (USA).
- Máy đo pH Jenway (England),
- Máy đông khô Jouan LP3. (France)
- Máy khuấy từ.
- Cột sắc ký Sepharose 4B- Mucin (1,5 X 6cm).
- Bản nhựa làm phản ứng ELISA.

- Máy đo ELISA LP 200.
- Các dụng cụ thuỷ tinh khô sạch.
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu:
* Phươtig pháp xác định hoạt tính lectin:
Hoạt tính của lectin được xác định bằng khả năng ngimg kết tế bào
hồng cầu người theo phương pháp của Gebauer trên bản nhựa đáy nhọn
microtitle [10].
■ Hoạt độ lectin (HAA) là giá trị nghịch đảo của độ pha ỉoãng ỉớn nhất mà ở
đó lectin còn có khả năng nguriig kết hồng cầu.
■ Hoạt tính của lectin được xác định theo hai chỉ số:
+ Hoạt độ tổng số (HĐTS) được xác định theo công thức :
V. 2"
HĐTS=

50
Trong đó : V : thể tích mẫu thí nghiệm (^lỉ).
n : số giếng còn hoạt tính lectin
50 : số lectin đem thử
2 : độ pha loãng liên tiếp
HĐTS được lính bằng HAA
HĐTS
HĐR =
mPr
Trong đó : mPr ; khối lượng protein trong mẫu
thí nghiêm tính bằng mg.
Các bước tiến hành:
- Cho vào mỗi giếng 50 p,l dịch đêm PBS pH 7,4.
- Thêm vào giếng đầu 50 |il dịch cần xác định hoạt độ, pha loãng 2 lần ở các
giếng tiếp sau.
- Thêm 50 ^1 hồng cầu 2% pha trong nước muối sinh lý 0,9% vào mỗi

giếng.
- Đặt ở nhiệt độ phòng 60 phút, đọc kết quả.
* Phương pháp xác định Proíein:
■ Hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm được xác định bằng phưcíng pháp
Lowry[10], với chất chuẩn là BSA.
- Chất chuẩn BSA.
- Xây dựng đường chuẩn và lập phương trình hồi quy.
y = l,0345x- 0,0409 (với = 0,99)
Hình 2. Đồ thị đưòng chuẩn định lượng protein ở bước sóng 660nm