Góp phần nghiên cứu định tính, định lượng và thăm dò một số tác dụng sinh học của cây bồ công anh việt nam

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
TRẦN VĂN CƯƠNG
GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u ĐỊNH TÍNH,
ĐỊNH LƯỢNG VÀ THÃM DÒ
MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA CÂY BỔ CÔNG ANH VIỆT NAM
(.LACTUCA INDICA L. ASTERACEAE)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 19^9-2004)
Thời gian thực hiện :15/12/2003-20/0
Người hướng dẫn
TS. NGUYỄN THÁI AN
Nơi thưc hiên
: Bộ môn Dược Học cổ Truyền
HÀ NÔI 05-2004
Iw i. u
Lởi cảm ơn
Tôi xin gửi lời biết ơn 5âu sắc đến:
Ts Vũ Văn Biền
Ts Hguyễn Thái Rn
Rgười đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình làm
đề tài này.
Hhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, eô
bộ môn Dược I}ỌC cổ Truyền, bộ môn Bượe lý, bộ môn Vi Sinh
Ký Sinh cùng các eô hỹ thuật viên đã giúp đỡ, tạo điều hiện
tốt nhấí cho tôi hoàn thành hhoá luận này.
Tlằ nội ngày 2Q tháng 05 năm 2QQ4
Sinh viên: Trần Vần Cương
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đ ề

.
1
Phần 1-Tổng quan 2
1.1. Đặc điểm thực vật, phân b ố 2
1.2. Thành phần hoá học 2
1.3. Công dụng 3
1.3.1. Theo y hoc cổ truyền 3
1.3.2. Theo y học hiện đại 5
1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 6
Phần 2-Thực nghiệm kết quả 7
2.1. Nguyên liệu,phương tiện,phương pháp nghiên cứu

7
2.1.1. Nguyên liệu

.
7
2.1.2. Phương tiện 7
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 8
2.2. Thực nghiệm kết quả 9
2.2.1. Định tính flavonoid 9
2.2.2. Định lượng flavonoid 12
2.2.3. Chiết xuất, phân lập 13
2.2.4.Thử tác dụng dược lý
18
Phần 3-Kết luận và đề xuất

.
20

3.1. Kết luận 24
3.2. Đề xuất 25
Tài liệu tham khảo
ĐẶT VẤN ĐỂ
•
Nước ta có nguồn dược liệu phong phú và nền y học cổ truyền dân tộc lâu
đời. Vì vậy việc nghiên cứu sử dụng các dược liệu sẵn có trên cơ sở kết hợp y
học cổ truyền với y học hiện đại là một chủ trương của nhà nước.
Chúng ta đang phấn đấu trong những năm tới trên thị trường thuốc nước ta,
thuốc đông dược chiếm khoảng 30% thị phần để góp phần làm giảm giá
thuốc. Ngày nay với sự phát triển của công nghệ bào chế, việc chiết riêng các
thành phần trong dược liệu để làm thuốc đang được các nhà khoa học quan
tâm. Do đó việc nghiên cứu, tách chiết, thăm dò tác dụng sinh học của các
thành phần trong dược liệu là rất cần thiết.
Cây bồ công anh (Lactuca indica L. Asteraceae) là một cây thuốc mọc
hoang ở khắp nước ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến. Từ lâu
đã được nhân ta sử dụng với tác dụng trị mụn nhọt, sưng vú, đầu đinh Tài
liệu nghiên cứu về bồ cổng anh chưa nhiều, nguồn nguyên liệu trong nước lại
rất sẩn. Do vậy, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu dược liệu này với mục đích
góp phần dần đưa dược liệu này vào khai thác và sử dụng hợp lý, hiệu quả
hơn.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên trong khoá luận này chúng tôi mới chỉ
nghiên cứu một số nội dung sau:
1. Định tính , định lượng flavonoid toàn phần từ lá bồ công anh.
2. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng chất phân lập.
3. Thăm dò tác dụng lợi mật và tác dụng kháng khuẩn của lá bồ công anh.
PHẦN 1
TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây bồ công anh Việt Nam có tên khoa học là Lactuca indica L. Asteraceae

họ Cúc [1,4,8]. Ngoài ra còn một số tên khác như: cây mũi mác, diếp dại, diếp
trời, rau bồ cóc, rau mét, phắc bao [8]
Cây thảo mọc đứng, sống 1 hay 2 năm, thân nhẵn, thẳng, cao 0,50 - lm có
khi đến 2m, ít phân cành ,đôi khi có những đốm tía trên thân.
Lá mọc so le gần như không cuống và không đều. Lá ở trên ngắ rất đa dạng.
Lá ở phía dưới dài khoảng 30cm rộng khoảng 5-6cm chia thành nhiều thuỳ n
và hẹp hơn có ít răng cưa hoặc nguyên.
Cụm hoa là 1 đầu tụ họp thành chuỳ dài 20-40cm mọc ở ngọn thân và kẽ lá,
phân nhiều nhánh mang 2 đến 5 đầu.Tổng bao hình trụ, mỗi đầu có 8 đến 10
hoa màu vàng hoặc vàng nhạt. Tràng hoa có lưỡi dài, nhị 5, bao phấn có đỉnh
rất tròn, tai hình dùi, vòi nhuỵ có gai.
Quả bế, màu đen, có mào lông trắng nhạt, hai cạnh có cánh, hai cạnh khác
giảm thành một đường lồi.
Thân và lá bấm có nhựa màu trắng chảy ra. Mùa hoa vào tháng 6-7, mùa
quả vào tháng 8- 9.
Cây bồ công anh (Lactuca indica L.) mọc hoang, phân bố chủ yếu ở vùng
ấm thuộc các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia,
Philippin Tại Việt Nam bồ công anh (Lactuca indica L.) phân bố rải rác
khắp mọi nơi. Từ miền núi (thường ở độ cao dưới 1000m) trung du đến đồng
bằng [1,2,4,8,13].
1.2. Thành phần hoá học
2
Lá tươi cây bồ công anh (Lactuca indica L.) có chứa 91,8% nước, 3,4%
protein, vitamin c [2,7] . Ngoài ra trong cây còn có chứa flavonoid, saponin
thuộc nhóm steroid, coumarin, serquiterpen lacton, tanin và sterol. [6]
Năm 1995, Park Hee Juhn và cộng sự đã phát hiện trong cây Lactuca
indica L. có sterol và triterpen, đã tách và xác định cấu trúc của 3 sterol là
f3- sitosterol , compesterol, stigmasterol và 6 triterpen là ị3- amyrin , lupeol,
pseudotarasterol , taraxasterol [16].
Ngoài ra một số loài bồ công anh khác đã được nghiên cứu như:

Trong rễ cây Lactuca virosa L. có serquiterpen lacton [17].
Phần trên mặt đất của cây Lactuca saligna L. xác định có serquiterpen
lacton, triterpen, sterol, coumarin, flavonoid và đã nhận dạng cấu trúc của 3
chất serquiterpen lacton là: lactucin; lactucopicin diacetat; 11(3,13
dihydrolactucopicrindiacetat [14].
Trong cây Lactuca savita L. đã tách và xác định được cấu trúc của 3
serquiterpen. [15] .
Đối với cây bồ công anh Trung Quốc (jTaraxacum officinale Wigg.
Asteraceae) người ta phát hiện thấy toàn cây chứa chất đắng taraxacin, một
chất kết tinh taraxacerin, saponosid, phytosterol ((3-sitosterol), stigmasterol,
taraxasterol, homataraxasterol, flavonoid. [7]
1.3. Công dụng
1.3.1 Theo y học cổ truyền [3,7]
Cây bồ công anh có vị cam khổ , tính hàn, quy vào các kinh can, tỳ, vị.
Công năng: Giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, lương huyết, tán ứ, trợ tiêu
hoá, lợi sữa.
Chủ trị: tỳ vị có hoả uất, sưng vú, tràng nhạc, đinh độc nhiệt ung nhọt,
ghẻ lở, đầy bụng, khó tiêu.
Kiêng kị: người có ung nhọt đã vỡ không nên dùng.
3
Môl số vhươns thuốc trong dân gian CO vi thuốc bồ câng anh:
- Đơn thuốc chữa sưng vú, tắc tia sữa: [7]
Bồ công anh tươi 20-30 lá, rửa sạch, thêm ít muối giã nát vắt lấy nước
uống còn bã dùng đắp lên nơi vú sưng đau. Thường dùng 2-3 lần là đỡ.
- Đơn thuốc chữa ăn uống kém tiêu hay bị mụn nhọt [7]
Lá bồ công anh khô 10 đến 15 gam sắc với 3 bát nước còn 1 bát uống
trong 3 đến 5 ngày.
- Đơn thuốc chữa đau dạ dày [7]
Lá bồ công anh khô 20g
Lá khôi 15g

Khổ sâm lOg
Cách dùng: Thêm 300 ml nước sắc đun sôi trong 15 phút.Thêm ít đường
vào uống. Chia 3 - 5 lần trong ngày, uống liên tục 3-10 ngày, nghỉ 3
ngày rồi tiếp tục uống cho đến khi khỏi.
- Bồ công anh hợp tễ I : [10]
Bồ công anh
30g
Bạc hà
5g
Hoàng cầm
9g
Nguyên sâm
9g
Hoàng liên
2g
Sài hồ
5g
Cam thảo
3g
Liên kiều 18g
Sinh địa
9g
Cát cánh
6g
Mẫu lệ
9g
Trúc diệp
6g
Chi tử
6g

Ngân hoa
15g
Xích thược
5g
Cách dùng: sắc uống
Công dụng: Thanh nhiệt giải độc trị chứng phổi nhiễm xạ khuẩn
- Bồ công thang (Viện Y Học Dân Tộc Việt Nam) [10]
Bồ công anh 12g
4
Cúc hoa
Cam thảo
Kim ngân hoa
8g
4g
12g
Cách dùng: sắc uống
Công dụng: Trị mụn nhọt ngoài da
1.3.2. Theo y học hiện đại
• Nước sắc lá cây bồ công anh Lactuca indica L. khòng thể hiện độc tính
qua đường uống, cụ thể với liều 200g dược liệu/kg chuột không quan sát
thấy chuột nào chết [6].
• Flavonoid toàn phần của lá cây bồ công anh Lactuca indica L. có tác
dụng chống oxi hoá, kìm hãm hoạt động của peroxydase máu thỏ trong
phản ứng oxi hoá Indigocarmin và làm tăng lượng nhóm thiol tự do
trong huyết thanh thỏ [9].
• Dịch chiết từ lá cây bồ công anh Lactuca indica L. còn có hoạt tính
dọn gốc tự do [19].
• Cao lá bồ công anh (Lactuca indica L.) với liều lg dược liệu/20g chuột
có tác dụng giảm đau và tác dụng này mạnh hơn là flavonoid toàn phần
với liều 0,07g flavonoid toàn phần/20g chuột (thử tác dụng giảm đau nội

tạng - theo phương pháp của Kosteng) [6].
• Cao lá (2:1) cây bồ công anh (Lactuca Indica L. Asteraceae) với liều
4g dược liệu/lOOg chuột và dung dịch flavonoid 2,5% liều 0,005g
flavonoid toàn phần /20g chuột đều có tác dụng chống viêm bắt đầu từ
giờ thứ 2 kể từ khi uống chế phẩm. [6]
• Các nhà khoa học trên thế giới đã thử tác dụng dược lý với dịch chiết
cloroform và dịch chiết methanol của cây bồ công anh (Lactuca indica
L.) mọc ở nước ngoài thấy cả 2 dịch chiết có tác dụng làm giảm
cholesterol huyết thanh tương đương nhau[ 16].Thành phần serquiterpen
5
lacton là lactucain c, lactucasid trong cây còn có tác dụng chống đái
tháo đường [18].
1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến [12]
Thường dùng lá đôi khi người ta cũng dùng cả thân bỏ rễ, thường được
thu hái vào tháng 5-7 lúc cây chưa ra hoa hoặc bắt đầu ra hoa. Loại bỏ lá
già, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô. Phải thường xuyên phơi lại để tránh mốc.
6
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu , phương tiện, phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu:
Lá cây bồ công anh Việt Nam được thu hái vào tháng 8/2003 lúc cây sắp ra
hoa tại khu vực Hà Nội, được sấy khô, bảo quản trong túi nylon kín.
2.1.2. Phương tiện
2.1.2.1. Thiết bị
• Máy đo độ ẩm Presica HA60 (Thuỵ Sĩ)
• Bộ cất quay áp suất giảm Bucher (Đức).
• Máy đo phổ hồng ngoại IR
• Máy đo phổ khối 5989B-MS tại Phòng cấu trúc -Viện Hoá Học
• Nồi hấp tiệt trùng Autoclab

• Cân phân tích presica (Thuỵ Sĩ)
• Và một số thiết bị khác
2.1.2.2. Hoá chất
• Dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích
• Bột silicagel làm bản mỏng - Viện kiểm nghiệm
• Sephadex LH,0 - Merck (Đức)
• Bản mỏng sắc ký Silicagel GF254 -Merck (Đức)
• Một số hoá chất khác
2.1.2.3. Động vật, vi sinh vật thí nghiệm
- Thử tác dụng lợi mật trên chuột nhắt trọng lượng 20±2g khoẻ mạnh bình
thường, không phân biệt đực cái được nuôi bằng thức ăn do Viện Vệ Sinh
Dịch Tễ Hà Nội cung cấp.
7
- Vi sinh vật: bao gồm 5 chủng Gram(+) và 5 chủng Gram (-) do bộ môn
Vi sinh-Ký sinh cung cấp.
Gram âm
Escherichia coli
ATCC
25922 (Ec)
Proteus mirabilis
BV
108 (Pr)
Shigella flexneri
DT
112 (Shi)
Salmonella typhi
DT 220
(Sal)
Pseudomonas aeruginosa
UM 201

(Pseu)
Gram dương
Staphylococcus aureus
ATCC 1128
(Sta)
Bacillus pumilus
ATCC 10241
(Bp)
Bacillus subtilis
ATCC
6633
(Bs)
Bacillus cereus
ATCC 9946
(Be)
Sarcina lutea
ATCC 9341 (SI)
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
2.1.3.1. Định tính flavonoid:
- Định tính trong ống nghiệm bằng các phản ứng theo tài liệu [11]
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng theo tài liệu [5]
2.1.3.2. Định lượng: theo phương pháp cân [5]
* Nguyên tắc: chiết kiệt flavonoid bằng dung môi thích hợp, thu hồi dung
môi, sấy, cân, tính hàm lượng flavonoid toàn phần theo công thức:
x% =

-
100
mix -b)
a: khối lượng ílavonoid toàn phần (g)

m: khối lượng dược liệu đem định lượng (g)
b: hàm ẩm của dược liệu
2.1.3.3. Phân lập và nhận dạng một thành phần từ dịch chiết ethylacetat:
- Dùng sắc ký chế hoá và sắc ký lọc qua gel Sephadex LH20.
8
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc kí lớp mỏng.
- Nhận dạng sơ bộ chất phân lập dựa vào các dữ liệu phổ IR, MS.
2.I.3.4. Thử tác dụng sinh học
• Dùng cao lỏng 2:1 chiết bằng dung môi ethanol 70° và hỗn dịch flavonoid
toàn phần 5% để thử tác dụng sinh học.
• Thử tác dụng lợi mật theo phương pháp Rudi.
• Nguyên tắ£i Cho chuột uống chế phẩm thử trước 2 ngày, ngày thứ ba sau
khi uống 60 phút gây mê, mổ, thắt ống mật chủ, khâu lại. Sau 30 phút mổ lại
cắt túi mật , cân. So sánh với mẫu chứng cho uống dung dịch NaCl 0,9%. Độ
lợi mật tính theo công thức:
L% = 100
mc
Trong đó mt : trọng lượng mật trung bình của lô thử
mc : trọng lượng mật trung bình của lô chứng
• Thử tác dụng kháng khuẩn trên 10 chủng vi khuẩn theo phương pháp
khoanh giấy khuyếch tán trên môi trường đặc. [12]
*Nguỵên tắc: Dựa trên sự khuyếch tán chất thử từ khoanh giấy vào môi
trường nuôi cấy đặc có sẵn vi sinh vật chỉ thị. Độ kháng khuẩn được thể hiện
thông qua đường kính vòng vô khuẩn. Tiến hành song song với mẫu chứng là
kháng sinh Penicilin (Gram +), Gentamycin (Gram -).
2.2. Thực nghiệm và kết quả
2.2.1. Định tính flavonoid
2.2.1.1. Chiết xuất flavonoid toàn phần
Cân 20 g bột lá dược liệu cho vào túi giấy lọc, đặt vào bình Shoxlet. Chiết
bằng methanol ở nhiệt độ 60° trên nồi cách thuỷ. Chiết đến khi dịch chiết

không còn cho phản ứng dương tính với NaOH 10%. Cất thu hồi dung môi
dưới áp suất giảm . cắn thu được hoà tan trong 200ml nước cất nóng. Để qua
đêm, lọc loại bỏ tủa Chlorophyl. Dịch nước đem lắc với Chloroform đến khi
lớp Chloroform không còn phát quang tại bước sóng 365nm. Dịch nước được
9
chiết bằng ethylacetat đến khi dịch ethylacetat không còn màu vàng. Gộp dịch
ethylacetat ta được dịch chiếtl và phẩn dịch nước còn lại được chiết bằng hỗn
hợp nước - ethylacetat - methanol ( 4:5:1). Để phân lớp thấy lớp ethylacetat trở
nên vàng đậm hơn rất nhiều so với lớp ethylacetat chiết lần cuối cùng ở trên.
Bỏ phần nước lấy phần ethylacetat được dịch chiết 2.
Dịch chiết 1 và 2 cất thu hồi dung môi được cắn El, E2 .
Sơ đồ quy trình chiết xuất flavonoid toàn phân
2.2.1.2. Các phản ứng trong ống nghiệm
Cắn E1 và E2 được hoà tan trong ethanol tiến hành làm các phản ứng:
• Phản ứng với hơi amoniac : Nhỏ một giọt dung dịch E1 toàn phần lên tờ
giấy lọc, để khô tự nhiên rồi hơ lên miệng lọ NH3 đặc thấy màu vàng đậm
lên ( phản ứng dương tính).
• Phản ứng cyanỉdin: lấy lml dung dịch E1 toàn phần thêm một ít bột Mg và
3 giọt HC1 đặc. Đun sôi nhẹ, dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt ( phản
ứng dương tính).
• Phản ứng với FeCỈ3: Lấy lml dung dịch E1 cho vào ống nghiệm thêm 2
giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen (phản ứng dương
tính).
• Phản ứng diazo hoá: Lấy lml dịch E1 cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt
thuốc thử diazo mới pha thấy màu đỏ - vàng nhạt xuất hiện (phản ứng
dương tính).
• Phản ứng với chì Acetat: Lấy lml dịch E1 cho vào ống nghiệm thêm một
giọt dung dịch chì acetat 5% thấy có kết tủa vàng (phản ứng dương tính).
• Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Lấy lml dung dịch E1 thêm vào vài
giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng đậm có ánh đỏ (phản

ứng dương tính).
• Với dung dịch H2S04 đặc. lấy lml dung dịch E1 thêm vào vài giọt H2S04
đặc lắc đều thấy xuất hiện màu vàng đậm có ánh đỏ ( phản ứng dương
tính).
Tương tự làm các phản ứng với dung dịch E2 kết quả đều cho phản ứng dương
tính.
„ * Kết luân: Như vậy dung dịch El, E2 là dung dịch Flavonoid. Gộp cắn E1 và
E2 ta được flavonoid toàn phần.
2.2.1.3. Định tính bằng sác ký lớp mỏng
11
Chấm sắc ký lớp mỏng dung dịch E1 trong ethanol.
Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck được hoạt hoá trong tủ sấy 110°c trong
30 phút. Triển khai bằng hệ dung môi methanol - ethylactat - nước - acid
acetic (tỷ lệ 17 - 100 - 13 - 1) ta thu được kết quả như bảng 1, Hình 1 trang 17.
Bảng 1: Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng.
Vết
Rf (xlOO)
Màu sắc
Độ đậm
n h 3
u v + n h 3
1
79
Vàng đậm Vàng
++++
2
69
Vàng nâu
Vàng nâu
+++++

3 63
Vàng nâu
Vàng
+
4
47 Vàng
Vàng nâu
+++
5
29
Vàng nâu
Vàng nâu
++
6 23 Vàng nâu
Vàng nâu +
7
11 Vàng
Vàng náu
++
8
6
Vàng nâu
Vàng nâu
++
2.2.2. Định lượng flavonoid toàn phần
Cân 3 mẫu dược liệu mỗi mẫu 20 g. Chiết flavonoid toàn phần theo quy trình
phần 2.2.1.1. cắn ílavonoid toàn phần thu được sấy khô ở 60° đến khối lượng
không đổi, cân. Hàm lượng ílavonoid toàn phần trong dược liệu được tính theo
công thức:
x% = —^ 100

m(l-b)
m: khối lượng dược liệu đem định lượng (g)
a: khối lượng flavonoid toàn phần (g)
b: hàm ẩm của dược liệu
Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần được ghi trong bảng 2:
Độ ẩm dược liệu được xác định bằng máy xác định độ ẩm nhanh với hàm
ẩm dược liệu là 5,65%
12
Bảng 2:Kết quả định lượng flavonoid toàn phần
Mẫu Khối lượng
dược liệu(g)
Độ ẩm
(%)
Khối lượng cắn
(g)
Hàm lượng
(%)
1
20.01
5.6 5 0,2553
1,35
2
20.03 5.65
0,2652
1,40
3
20.02 5.65
0,2538
1,34
Trung

bình
1,36
Nhân xét: Như vậy nếu chỉ dùng ethylacetat thì khó chiết kiệt được flavonoid.
Do vậy sau khi chiết ílavonoid bằng ethylacetat ta nên chọn dung môi thích
hợp để chiết kiệt flavonoid. Trong trường hợp này ta có thể dùng hỗn hợp
dung mồi là ethylacetat-methanol-nước ( 5:1:4 ).
2.2.3. Chiết xuất, phân lập
2.2.3.I. Chiết xuất
Cắn E1 được chiết xuất như phần 2.2.1.1. cắn E1 thu được hoà tan trong
10ml ethanol tuyệt đối, cho từ từ 50ml aceton , làm lạnh, lọc. Dịch thu được
cất thu hồi dung môi, được cắn F .
Cắn F thu được hoà tan trong nước cất. Sau đó lắc với diethylether (l).LỚp
diethyl ether được lắc với nước cất đến khi lớp nước cất không còn màu. Lấy
lớp diethylether thu hồi diethylether ta được cắn Fl.
Lớp nước (1) được lắc với diethylether đến khi lớp diethylether không còn
màu. Lấy lớp nước bỏ lớp diethyl ether. Sau đó lớp nước này được chiết lại với
ethylacetat. Cất thu hồi ethyl acetat ta được cắn F2.
Chấm sắc ký dung dịch Fl, dung dịch F2, dung dịch El.
13
Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck được hoạt hoá trong tủ sấy 110°c
trong 30 phút. Triển khai bằng hệ dung môi methanol - ethylactat - nước - acid
acetic ( 17 - 100- 13 - 1) ( Hình 1 trang 17).
Sơ đồ quy trình chiết Fỉ, F2 từ cắn flavonoid
2.2.3.2. Phân lập
• Chuan hi bản mỏng chế ho (í:
Cân lOOg silicagel, cân 0,2g Natri carboxymethyl xellulose (NaCMC) ngâm
trương nở trong 100ml nước, khuấy đều cho tan, cho 150 ml nước vào lOOg
14
silicagel, khuấy đều , cho dung dịch NaCMC vào, khuấy đều rồi iọc qua rây
mịn. Tráng lên tấm kính (20x20cm) đã được làm sạch. Để khô tự nhiên, đem

sấy ở 50°c trong 2 giờ. Rồi nâng nhiệt độ lên 110°c sấy trong 1 giờ.
• Tien hành sắc ký chếhoá:
Dung dịch F2 trong methanol được chấm thành dải trên bản mỏng vừa
tráng. Triển khai với hệ dung môi ethylacetat - methanol - nước - acid acetic
(100:17:13:1). Lấy bản mỏng ra để khô, cạo lấy vết đầu tiên (Rf= 0,8). Bột
chế hoá sấy khô ở 50°c/l giờ, phản hấp phụ bằng dung dịch methanol, cất thu
hồi methanol được cắn F3. cắn F3 chấm ký sắc trên bản mỏng GF254 hệ dung
môi Toluen - ethylactat - acid formic (5-8-2) thấy có hai vết trong đó 1 vết
mờ phát quang ở 365 nm. cắn F3 đem chạy cột sephadex LH-20.
• Chuẩn bi côt:
Sephadex được ngâm trương nở trong ethanol 50°. Cho một ít bông thuỷ
tinh xuống đáy cột đã được tráng bằng ethanol. Hút dung môi ngược từ dưới
lên để đuổi hết bột khí sau đó khoá van lại. Sephadex được khuấy đều trong
dung môi và rót từ từ liên tục vào ống. Mở khoá để dung môi chảy. Cho cột
lên bàn rung trong 1 giờ. Mở khoá để dung môi chảy với tốc độ 12 giọt/phút
trong 8 giờ.
• Tien hành chaỵ cot:
Hoà cắn F3 trong một lượng tối thiểu ethanol 50°, đưa dịch lên cột. Mở van
cho dung môi chảy. Tráng thành cột từ từ bằng lml dung môi vài lần, rót nhẹ
dung môi lên cột. Để dung môi chảy với tốc độ 12 giọt/phút. Hứng mỗi phân
đoạn 2mì.
• Kiểm tra các ỵhân đoan:
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, triển khai bằng hệ toluen - ethylacetat -
acidformic (5-8-2) .Từ ống 54 đến 75 có một vết duy nhất không phát
quang bước sóng 365 nm, lên màu vàng đậm với hơi NH3.
15
Gộp dịch từ ống 60 đến 70, cất thu hồi dung môi ta thu được tinh thể màu
vàng nhạt (C) (Hình 4 trang 17).
Kiểm tra độ tinh khiết của chất c vừa phân lập bằng sắc ký lớp mỏng với 3 hệ
dung môi:

• Hệ 1: Cloroform - methanol - aceton ( 15:5:2 )
• Hệ 2: Ethylacetat - methanol - nước - acid acetic ( 100:17:13:1 )
• Hệ 3: Toluen - ethylacetat - acid formic ( 5:8:2 )
Kết quả đều cho một vết duy nhất (hình 1 trang 17).
Chấm sắc ký đối chiếu chất c với dung dịch F2, hệ dung môi triển khai là
Toluen - ethylacetat - acid formic ( 5:8:2 ). Kết quả như hình 2 trangl7.
Bảng3: Kết quả kiểm tra chất c bằng sắc kí lớp mỏng
Hệ 1 Hệ 2
Hệ 3
Rf
n h 3 u v 354
Rf
n h 3 u v 354
Rf
n h 3
u v 354
0,58 Vàng Tím 0,8
Vàng Tím 0,48
Vàng
Tím
• Nhân dang chat_ c
- Tính chất: Tinh thể hình kim, vàng nhạt, tan tốt trong methanol, ethanol,
aceton rất ít tan trong nước (hình 2).
- Phổ hồng ngoại được đo dưới dạng viên nén KBr. Chất c có các đỉnh hấp thụ
tại: 3424; 72960; 1380 cm'1.
- Phổ khối được đo tại phòng cấu trúc-Viện Hoá Học. Kết quả phổ được đối
chiếu với phổ các chất trong thư viện phổ, sơ bộ kết luận chất c có cấu trúc là:
16
Stigmast-5-en-3-ol
HI

H2 H3
F2
Fl El F2
H ình 1 Hình 2 Hình 3
Hình 1: Sắc ký kiểm tra độ tinh khiết chất c vói 3 hệ dung môi
• Hệ 1: Cloroform-methanol-aceton(15:5:2)
• Hệ 2: Ethylacetat-methanol-nước -acid acetic (100:17:13:1)
• Hệ 3: Toluen-ethylacetat-acid formic (5:8:2)
Hình 2: c - F2: Chấm đối chiếu chất c với F2.
Hình 3: F1-F2-E1: sắc ký flavonoid toàn phần, phân đoạn Fl, phân đoạn F2
ề ' É
' ' ộ r
Hình 4: Tinh thể chất c
17
2.2.4. Thử tác dụng sinh học
2.2.4.Ì.Chuẩn bị chế phẩm thử:
2.2A.2 Chuẩn bị cao 2:1
Cân 200 g dược liệu. Cho vào bình chiết ngâm dung môi ethanol 70°.
Đổ ngập dung môi sau 2 ngày rút dịch chiết. Tiếp tục làm như thế thêm 2 lần.
Dịch trong ethanol 70° đem cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm. Để qua đêm
lọc loại tủa chlorophyl. Cô cách thuỷ còn 100 ml được cao lỏng 2:1.
2.2.4.3. Chuẩn bị hỗn dịch flavonoid 5%
Tiến hành chiết cao lỏng như phần 2.2.4.2. Cao lỏng thu được đem chiết bằng
chloroform để loại tạp sau đó chiết bằng ethylacetat. Cất thu hồi ethylacetat
thu được cắn flavonoid đem sấy ở nhiệt độ 60° trong 1 giờ. Cân được 2,03 g.
Thêm 1 ml ethanol hoà tan cắn flavonoid. Thêm 3 giọt Tween80 trộn đều.
Đun nóng nước đến khoảng 60° cho từ từ nước vào, đun nóng đuổi hết cồn
đồng thời khuấy trộn đều để phân tán thành hỗn dịch.
2.2.4A. Chuẩn bị mẫu chuẩn Chophyton
Lấy 20 viên Chophyton nghiền thành bột mịn sau đó chiết bằng ethanol 70°.

Dịch thu được cất loại ethanol, cô cạn còn 200ml được cao lỏng chophyton.
2.2A.5. Thử tác dụng lợi mật
Dùng chuột nhắt trọng lượng 20± 2g chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 7 con.
• Lô 1 cho uống dung dịch NaCl 0.9% liều 2ml/10g chuột.
• Lô 2 cho uống cao lỏng 2:1 liều 0,4g dược liệu/10 g chuột.
• Lô 3 cho uống cao lỏng Chophyton liều 10 mg/lg chuột.
• Lô 4 cho uống hỗn dịch flavonoid 5% liều lOmg flavonoid/10 g
chuột.
Nuôi chuột khi mua về trong 2 ngày đến ngày thứ 3 cho uống thuốc. Nuôi
chuột và cho uống thuốc hết ngày thứ 4 đến ngày thứ 5. Sau khi chuột uống
18
thuốc được 60 phút gây mê nhẹ nhàng bằng diethyl ether rồi mổ bụng thắt ống
mật chủ sau đó khâu vết mổ lại. Sau 30 phút ỉấy mật ra cân trên cân phân tích
Kết quả lợi mật được tính theo công thức:
m — ỉ ì ì
L% = — — 100
mc
Trong đó mt : trọng lượng mật trung bình của lô thử
mc : trọng lượng mật trung bình của lô chứng
Bảng 4: Kết quả khối lượng mật chuột (đơn vị g)
Stt
Mẫu cao 2:1
Mẫu flavonoid
5%
Mẫu
Chophyton
Mẫu chứng
1
0.0628
0.0932 0.0673 0.0291

2
0.0593
0.0897 0.0648
0.0294
3
0.0720
0.0941 0.0683
0.0310
4
0.0598 0.0915 0.0641
0.0314
5
0.0643 0.0963 0.0695
0.0275
6
0.0632 0.0646 0.0701
0.0266
7
0.0587
0.0952 0.0534 0.0281
TB
0.0613±0.003
0.0935±0.002 0.0653±0.006
0.029±0.001
Bảng 5: Kết quả độ lợi mật
Mẫu KL túi mật
trung bình (g)
p
Độ lợi mật(%)
Mẫu chứng

0.0613±0.003
Mẫu Chophyton
0.0653±0.006
<0.05
125.2%
Mẫu cao 2:1
0.029±0.001
<0.05
111.4%
Mẫu fla 5%
0.0935±0.002
<0.05
222.4%
19
Nhân xét: Chúng tôi thấy rằng flavonoid chiết xuất từ lá bồ công anh có tác
dụng lợi mật rất tốt trên chuột, cụ thể với liều lOmg flavonoid/10 g chuột độ
lợi mật là 222,4% . Dạng cao 2:1 cũng có tác dụng rất tốt. Do vậy để bào chế
thuốc gan mật từ lá bồ công anh ta có thể chiết riêng lấy íìavonoid để sử dụng.
2.2.4.Ó. Thử tác dụng kháng khuẩn:
2.2.4.6.I. Pha các dung dịch thử và chuẩn bị khoanh giấy:
• Pha dung dich Penicillin G 20 UJJml
Cân chính xác 0.1201 g Penicillin G pha trong bình định mức 100 ml bằng
nước cất. Lấy 10 ml dung dịch này pha trong bình định mức 100 ml bằng nước
cất, thêm vừa đủ 100 ml được dung dịch Penicillin 20 UI/ml.
• Pha dung dich Gentamỵcin 20 us!mỉ
Lấy 1 ml dung dịch Gentamycin 40mg/ml pha loãng bằng nước cát trong bình
định mức 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này thêm 10 ml nước cất ,thu được
dung dịch Gentamycin 20 )Lig/ml.
• Chuan bi cap lỏng 2jl_
Chiết theo mục 2.2.4.2. và dung dịch flavonoid 0.025g/ml .

• Tam khoanh gịấỵ:
Mỗi khoanh giấy sau khi tẩm được sấy ở 50° cho đến khổ và tẩm 3 lần. Trung
bình cứ 60 khoanh giấy thì hút hết 1 ml dịch.
2.2A.6.2. Chuan bỉ môi trường
Môi trường thạch thường
NaCl 0.5%
Pepton 0.5%
Cao thịt 0.3%
Thạch 1.6%
Nước cất vđ 500ml
Cân 3.5 g NaCl, 3.5 g Pepton, 1.5 g cao thịt hoà tan vào 500ml nước cất.
Sau đó rót vào 10 bình mỗi bình khoảng 50 ml môi trường. Thêm vào mỗi
20
bình 0.8 g thạch. Lắc đều cho vào nồi hấp tiệt trùng autoclab ở 121° trong 1
giờ.
2.2.4.Ố.3. Cấy giống và đặt khoanh giấy:
Tiến hành thử trên 10 chủng vi khuẩn đã trình bày ở mục 2.1.2.3.
Chủng giống được cấy truyền trên môi trường canh thang. Sau khi môi trường
thạch đã hấp tiệt trùng để nguội đến khoảng 45° được cấy giống và lắc đều.
Đổ môi trường trên các đĩa petri khoảng 20 ml. Sau khi thạch đã đông cứng,
đặt khoanh giấy vào các mẫu với vị trí như hình vẽ:
Mẫu chứng với chủng Gram âm là gentamycin, chủng Gram dương là
penicillin. Đặt các đĩa petri vào tủ ấm 37° trong 24 giờ sau đó lấy ra đọc kết
quả.
2.2A.6.4. Đọc kết quả:
Đo đường kính vòng vô khuẩn của từng mẫu, chỉ đo những vòng vô khuẩn có
đường kính lớn hơn 6,5 mm.
Kết quả đươc biểu diễn trong bảng ố:
21
Bảng 6: Kết quả đường kính vòng vô khuẩn ( đơn vị : mm)

Chủng
Cao 2:1
Dung dich Flavonoid
Mẫu chứng
EC 6,67
0 TB
0 0 TB
9,44 9,06 TB
7,22 0 6,94 0 0
8,58
8,72 8,95
Pro 9,44 9,64 9,41 0 0
15,82 16,68
23,80
9,12 9,42
0
0
16,76
15,92
Shi 8,44 8,52 8,47 7,80 7,81 7,41 22,60
24,52 24,00
8,62
8,30
6,88
7,16 23,94
24,88
Sal
0
0
0 0 10,50 10,48 10,49

0 0 0 0
0 0
Pseu
6,78 0 6,78 0 0
7,00 7,48
7,22
0
6,78
0 0 7,12 7,28
Sta
9,02
8,32
8.49
0 0
14,72 14,94
15,37
8,76
7,88 0
0 16,42
15,38
Bp 9,62 9,0 8,98 0 0
16,28 16,92
16,98
8,52 8,78 0 0
17,68 17,04
Bs
8,96
8,24 8,97 0 7,12 6,94
17,32
15,78 17.32

9,64
9,02 7,12
6,58 18,18
16,84
Be
9,42 8,72 8,95 7,10
6,92
6,90
18,08
18,94 17,81
9,92 7,72 6,88 6,68
17,22 17,00
SI 7,46 7,22 7,48 0 0
18,74 18,68
18,64
7,98 7,06 0 0
18,94 18,18
TB: trung bình
0: không đo được
Nhân x é t:
• Mẫu cao 2:1 có tác dụng kháng khuẩn tốt, chưa bị chủng đem thử kháng
biểu hiện vòng vô khuẩn rất trong và sạch (hình 5).
22