Thử nghiện định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực phổ

B ộ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
BỘ MÔN : VÔ Cơ - HOÁ LÝ
PHAN TIẾN Lực
THỬ NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG SELEN TRONG NẤM
MEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP c ự c PHỔ
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999 -2004)
Giáo viên hướng dẫn: PGS. TSKH. LÊ THÀNH PHƯỚC
Th. s. HOÀNG THỊ TUYẾT NHUNG
Nơi thực hiện : Bộ môn Vô Cơ - Hoá Lý
Thời gian thực hiện : 2/2004 - 5/2004.
HẢ NỘI, 5-2004
\ ■ ì »
,
Ỷ - LC
ÚQ, /
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tói:
PGS.TSKH : LÊ THÀNH PHƯỚC
Th.s : HOÀNG THỊ TUYẾT NHUNG
Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em khắc phục những khó khăn để
hoàn thành khoá luận này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Vô cơ -
Hoá lý đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khoá luận.
HÀ NỘI: 5/2004
Sinh viên
Phan tiến Lực
3.1.3. Xử lý dụng cụ 15
3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 16
3.2.1. Kết quả khảo sát chọn thông số cho phép đo 16
3.2.2. Kiểm tra độ lặp lại của máy với bộ thông số đã chọn 16

3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính, lập đường chuẩn 18
3.2.4. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp đường chuẩn 21
3.2.5. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp thêm chuẩn 24
3.2.6. Khảo sát độ đúng (độ thu hồi) bằng phương pháp thêm 28
3.3. Bàn luận 30
4. Kết luận và đề nghị 31
5. Tài liệu tham khảo 33
6. Phụ lục
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
AAS : Atomic Absorption Spectophotometry - phổ hấp thụ nguyên tử.
DPP : Differential pulse polarography- Cực phổ xung vi phân.
DME : Dropping Mercury electrode - Điện cực giọt thuỷ ngân.
E1/2 : Half-wave potential - thế bán sóng.
SQW : Square Wave - sóng vuông.
HDME : Hanging Mercury Drop Electrode - Điện cực giọt thuỷ ngân treo,
ppb : part per billion - phần tỷ.
ppm : part per million - phần triệu.
l.ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngày nay, selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng đối vói cơ
thể con nguời. Enym Glutathion peroxydase chứa selen có vai trò cực kỳ quan
trọng, nó loại bỏ gốc tự do, bảo vệ màng tế bào và ADN. Enzym này có nhiều
ở gan để hoá giải các chất độc, ồ cơ tim để bảo vệ các tế bào có cường độ hoạt
động lớn. Selen có chức năng quan trọng trong qúa trình hô hấp tế bào vì liên
quan đến sinh tổng hợp Coenzym- Q. Sự thiếu hụt selen trong dinh dưỡng sẽ
có nguy cơ dẫn đến hàng chục loại bệnh tật: ung thư, tim mạch, lão hoá
sớm Tuy nhiên, cũng như các nguyên tố vi lượng khác, tác dụng sinh học
của selen phụ thuộc vào liều lượng. Ở liều cao selen có thể gây độc, vì vậy cần
phải xây dựng phương pháp tin cậy để xác định selen có trong các chế phẩm
bổ sung. Để định lượng selen có thể sử dụng nhiều phương pháp, trong đó
phương pháp cực phổ là phương pháp có nhiều ưu điểm.

Cùng với sự phát triển của các phương pháp phân tích khác, phương pháp
cực phổ ngày càng được hoàn thiện và có nhiều ưu điểm về độ nhạy, tính tối
ưu của phép đo, thòi gian thực hiện phép đo ngắn. Đặc biệt là việc vi tính hoá
toàn bộ qui trình và kết quả đo với phần mềm vi tính chuyên dụng đã đưa tới
những biến đổi sâu sắc trong kỹ thuật cực phổ.
Với mong muốn bước đầu làm quen và sử dụng máy cực phổ VA 757
Computrace để đánh giá hàm lượng Selen trong nấm men, chúng tôi đã thực
hiện đề tài:
“Thử nghiệm định lượng selen trong nấm men bằng phương pháp cực
phổ”, với 2 mục tiêu chính:
1- Nắm được cách sử dụng máy cực phổ với kỹ thuật đo xung vi
phân có phần mềm vi tính chuyên dụng.
2- Áp dụng khả năng của máy để định lượng selen trong nấm men.
2. TỔNG QUAN
2.1. Đại cương về nguyên tố selen [3], [13], [14].
• Selen là nguyên tố đã được Berzelius phát hiện năm 1817. Trong bảng
tuần hoàn các nguyên tố selen ở trong nhóm 6A cùng vói oxy, lưu huỳnh và
telu. Cấu tạo lớp điện tử ngoài cùng của selen là: 4s24p4 [14].
Về tính chất hoá học Selen rất giống lưu huỳnh. Trong hoá học vô cơ lưu
huỳnh và selen đều thể hiện hoá trị -2, 4, 6 ứng với các hợp chất sulfua và
selenua, sulfit và selenit, sulfat và selenat [3].
Vói nhiều hợp chất hữu cơ của lưu huỳnh, selen có thể thay thế vị trí của
lưu huỳnh trong các hợp chất đó cho những hợp chất tương tự của selen như
thioure và selenoure, cystein và selenocystein, methionin và selenomethionin,
các enzym có nhóm -SH tương tự như enzym chứa -SeH
• Selen thâm nhập vào cơ thể con người chủ yếu thông qua thức ăn, do
đó khẩu phần selen phụ thuộc vào hàm lượng nguyên tố này trong ngũ cốc,
rau cỏ, trong cá, trong thịt gia súc và gia cầm .[3].
Selen phân tán trong đất đá, thường lẫn chung vói quặng lưu huỳnh (dạng
sulfid, selenid). Chu sa, thần sa dùng trong đông y có chứa selen. Nước

khoáng một số vùng có hàm lượng selen cao.
Trong thực vật, selen thường tập trung trong các cây họ Đậu, họ Cà phê,
trong lúa mì, cây xấu hổ, cây nhàu, cây keo dậu, cây bakích và một vài loài
nấm. Tuy nhiên selen có tập trung cao trong những cây ấy được hay không
còn phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và môi trường.
Trong động vật, selen tập trung nhiều nhất ở da, gan các loài cá, đặc biệt
là ở cá ngừ. Vì thế mỡ cá, dầu gan cá có hàm lượng selen lớn. Các loài động
vật khác có hàm lượng selen nhỏ và không ổn định [3].
2.2. Vai trò sinh học của Selen [3], [14].
Trước đây selen được coi là nguyên tố có độc tính cao vì trên những
vùng đất kiềm giàu selen thường gặp một số bệnh ở súc vật và người (rụng
lông, yếu cơ ).
Thế nhưng từ năm 1958 người ta đã nhận ra lợi ích của selen đối với sức
khoẻ con người và động vật, khi mà Schwarz chiết ra từ thận động vật một yếu
tố chứa selen có tác dụng cực mạnh điều tri thoái hoá hoại tử gan [3].
Một trong những chức năng quan trọng nhất của selen là vai trò của
nguyên tố này trên hệ thống enzym của cơ thể. Selen có trong thành phần của
nhiều enzym, tạo ra các nhóm chức -S-SeH, -S-Se-S, là những tâm hoạt động
sinh học mạnh. Trong hệ thống chống gốc tự do của cơ thể, hệ enzym
Glutathion peroxydase chứa selen có vai trò cực kỳ quan trọng. Nó có mặt
trong mọi tế bào để cùng enzym SOD loại bỏ gốc tự do, đặc biệt là phá huỷ
H20 2, dập tắt các gốc Ư, LOO* của acid béo, bảo vệ màng tế bào và ADN.
Glutathion peroxydase chứa selen đặc biệt tập trung nhiều ở gan để hoá giải
các chất độc, ở cơ tim để bảo vệ các tế bào có cường độ hoạt động lớn [14].
Vai trò của selen trong việc ngăn chặn và điều trị ung thư đã được phát
hiện vào khoảng những năm 1970. Nhiều nhà khoa học đã khẳng định khẩu
phần ăn có hàm lượng selen đủ sẽ làm giảm tỷ lệ ung thư tuyến tiền liệt, bàng
quang, tuỵ tạng và ung thư da. Năm 1911, Wasserman đã chữa khỏi một số ca
ung thư vú ở chuột bằng cách tiêm hợp chất Seleneosin.
Tác dụng của selen đối với bệnh tim mạch được thể hiện trong bệnh Keshan

hay còn gọi là bệnh cơ trắng. Vì thiếu selen đã gây ra biến đổi thành phần
đạm của cơ tim, kèm theo sự tăng hoạt độ của Collagenase, đạm của cơ tim
dần dần bị thay thế bởi đạm của mô liên kết. Triệu chứng điển hình của bệnh
cơ trắng là suy tim đột ngột trong các trường hợp cấp tính. Việc sử dụng selen
để điều trị bệnh cơ trắng đã cho kết quả tốt.
Hiện nay có nhiều bằng chứng cho phép kết luận selen là một yếu tố quyết
định khả năng chống đỡ của cơ thể đối với hiện tượng nhiễm khuẩn. Selen xúc
tác cho quá trình tổng hợp các globulin miễn dịch cũng như các protein khác.
Tác dụng phối hợp của Selen + Vitamin E đã làm tăng kháng thể của hệ miễn
dịch lên nhiều lần.
Người ta thấy rằng hàm lượng selen trong võng mạc cao hơn những tổ
chức khác của cơ thể. Selen tham gia vào quá trình chuyển tín hiệu quang
thành tín hiệu điện ở võng mạc. Selen đảm bảo sự toàn vẹn của thuỷ tinh thể.
Những thí nghiệm của Sprinker, Newbome (1971), gây đục thuỷ tinh thể ở
chuột bằng cách cho chuột ăn một khẩu phần thiếu selen, chứng tỏ điều này.
Nếu cho chuột ăn thiếu selen nhưng thừa vitamin E bệnh đục thuỷ tinh thể vẫn
xảy ra [3].
Bệnh loạn dưỡng gan xuất hiện trên cơ địa thiếu selen trong khẩu phần
dinh dưỡng. Những triệu chứng của bệnh là mệt mỏi, lười hoạt động, thở dốc,
lười ăn, mất trương lực, đi đứng không vững và run chân.
Selen có tác dụng làm giảm độc tính nhiều ion kim loại nặng và nhiều loại
chất độc khác.
Tác dụng chống viêm của selen đã được khẳng định từ lâu. Dân gian thường
dùng rễ cây trinh nữ, một dược liệu giàu selen để điều trị bệnh thấp khớp. Tác
dụng của selen được tăng cường rõ rệt khi dùng kết hợp với Vitamin E, điều
này do selen kết hợp với Vitamin E làm ổn định các thể tiêu bào Lysosome,
mà sự không toàn vẹn của Lysosome được coi là nguyên nhân các rối loạn của
hiện tượng viêm.
Selen xúc tác cho sự tạo thành các gốc tự do bền (gốc Vitamin E =
Tocopheryl, CoenzymQ, Flavin ) chống lại các gốc tự do độc hại.

Vì vậy, vi lượng selen giúp ngăn ngừa nhiều dạng ung thư, bảo vệ hệ tim
mạch, duy trì chức năng hoạt động tích cực của hệ miễn dịch, giải độc nhiều
hoá chất. Khoảng 40 loại bệnh tật, đặc biệt là các bệnh ung thư, có thể phát
sinh chỉ vì thiếu một liều vi lượng selen được cung cấp hàng ngày [14].
2.3. Nhu cầu Selen của cơ thể [3], [15].
Ở hàm lượng thấp, selen có tác dụng rất tốt trong việc phòng ngừa bệnh tật.
Nếu cơ thể thiếu selen sẽ dẫn tói sự phát sinh các quá trình bệnh lý. Nếu đưa
vào cơ thể hàm lượng selen lớn quá mức cần thiết sẽ dẫn tói nhiễm độc [3].
Năm 1980, các nhà khoa học Mỹ đã xác định hàm lượng selen trong chế
độ dinh dưỡng hằng ngày của người lớn là 50-200|ig. Kết quả này dựa vào thí
nghiêm trên động vật vì thời gian đó những dữ liệu về nhu cầu selen ở người
hầu như không có. Hàm lượng selen trong chế độ dinh dưỡng của phần lớn
động vật vào khoảng 0,1 fig/g thức ăn khô. Từ đó thấy rằng một người mỗi
ngày ăn 500g thức ăn khô thì được 50|ig selen. Hàm lượng selen trong chế độ
dinh dưỡng thay đổi trong khoảng rộng từ 50-200|ig/ngày. Điều này là do sự
không ổn định về sinh khả dụng của selen, và do chế độ dinh dưỡng của từng
người, từng vùng khác nhau [15].
Trong những năm 1980, có một số công trình nghiên cứu về nhu cầu selen ở
người. Các cuộc điều tra chỉ ra rằng bệnh cơ trắng không xuất hiện ở những
nơi mà hàm lượng selen đưa vào cơ thể hằng ngày là 19fj.g ở nam giới và 13ịig
ở nữ giới. Do vậy mà giá trị này được xem như là nhu cầu selen tối thiểu
trong chế độ dinh dưỡng.
Nhu cầu selen ở người cũng được xác định dựa vào chế độ ăn có hàm
lượng selen cần thiết để tăng tối đa hoạt tính của enzym Glutathion
peroxydase. Hội đồng nghiên cứu quốc gia Hoa kỳ đã chấp nhận lượng selen
đưa vào cơ thể hằng ngày là 100|j,g với nam giới và 70|0,g với nữ giới.
Đối với trẻ em hàm lượng Selen trong khẩu phần ăn là 10-15fig trong một
ngày.
Phụ nữ có thai và cho con bú thì hàm lượng Selen trong khẩu phần ăn tăng
thêm 10-20Ịig trong ngày.

2.4. Một số dạng thuốc chứa Selen [15],
+ Granions de Sélénium (Pháp): ống 2ml chứa 0,96mg Selenium.
+ Celnium (Pháp): nang chứa 5ƠỊj.g selen dưới dạng men bia nuôi cấy ở môi
trường đặc biệt đã hấp thu selen vô cơ trong môi trường nuôi cấy.
+ Selenium injectable (Pháp): lọ 10ml chứa 0,219mg Natriselenit tương ứng
vói lOOỊLig nguyên tố selen.
+ Selsun: dịch keo chứa selen sulfid 2,5% bôi ngoài da để chống nấm, viêm
bì da tiết bã nhờn.
+ Young ton: mỗi nang mềm có:
Vitamin E : 400UI
Vitamin c : 500mg
Vitamin A : 5000UI
Selen trong nấm men : 96,2mg (tương đương 50|Lig selen)
+ Belaf: mỗi nang mềm có:
P-caroten: 15mg
Vitamin E : 400UI
Vitamin c : 500mg
Selen trong nấm men : 92,6mg (tương đương 50jng selen)
Ngoài ra còn có các chế phẩm Binacle, Saylom, Cigelton có thành phần
tương tự, đều chứa 50jug selen.
Chỉ định cho các dạng thuốc chứa selen là: Dự phòng và điều trị các bệnh
tim mạch, cao huyết áp, viêm khớp, rối loạn thị lực, rối loạn chức năng tuần
hoàn, bệnh cơ và da.
2.5. Selen trong nấm men [15].
Khi đưa selen như một nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy, thì
nấm men có khả năng đồng hoá chuyển selen vi lượng này vào thành phần các
acid amin và protein. Dựa trên cơ sở đó, natriselenit đã được đưa vào môi
trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae.
2.6. Các phương pháp định lượng Selen [3], [7], [12], [16].
2.6.1. Phương pháp phân tích khối lượng [3], [15].

Phương pháp này có ứng dụng rộng rãi với những mẫu thử có hàm lượng
selen cao.
Nguyên tắc : dùng các chất khử khác nhau như S02, muối Fe2+, Sn2+, Cu1+,
thioure, natri hypophosphit để chuyển những hợp chất selenat, selenit về
selen nguyên tố kết tủa đỏ. Lọc, rửa, sấy khô rồi cân, tính kết quả.
Trong các thuốc thử trên, dùng S02 trong môi trường H ơ là tốt hơn cả vì
kết tủa rất tinh khiết.
2.6.2. Phương pháp huỳnh quang [3].
Dựa trên phản ứng giữa Selen (IV) và 3-3 diamino benzidin (O-diamino
thơm) tạo thành phức monopiazoselenol trong dung môi hữu cơ. Phức này
phát huỳnh quang ở bước sóng nhất định tuỳ thuộc vào chất thử và bước sóng
kích thích.
Đo cường độ huỳnh quang có thể xác định được nồng độ phức.
Định lượng bằng phương pháp huỳnh quang sẽ nhạy hơn nhiều so với
phương pháp đo quang.
2.6.3. Phương pháp đo quang [3].
Nguyên tắc của phương pháp: Vô cơ hoá mẫu, đưa toàn bộ selen trong
mẫu về dạng Se(IV), cho tạo phức piazoselenol với 2,3-0-diaminonaphtalen
trong môi trường pH = 2 ± 0,2, có mặt của Hydroxylamin hydroclorid. Chiết
phức piazoselenol bằng cyclohexan rồi đem đo mật độ quang D ở vùng tử
ngoại với XmaK= 378nm. Từ đó xác định được nồng độ phức và hàm lượng
selen trong mẫu đo.
Phương pháp này được dùng trong Dược điển Mỹ XXIV để định lượng
selen, đây là phương pháp có độ nhạy cao, tuy nhiên ở điều kiện nước ta hoá
chất khó kiếm và đắt tiền, mặt khác thời gian phân tích mẫu lâu, dung môi
hữu cơ gây độc, phức piazoselenol dễ bị phá huỷ trong ánh sáng.
2.6.4. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [12], [13].
Nguyên tắc của phương pháp: Trong điều kiện bình thường nguyên tử tồn
tại ở trạng thái cơ bản, không thu cũng không phát năng lượng, đây là trạng
thái bền vững của nguyên tử. Nhưng khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu

kích thích nó bằng một chùm tia sáng đơn sắc thích hợp, có độ dài bước sóng
trùng với các vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên tố đó, thì chúng sẽ hấp
thụ các tia sáng, tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử. Sự giảm cường độ ánh sáng do
nguyên tử hấp thụ tuân theo định luật Lambert - Beer:
D = log^ = Kv. L . c
Trong đó : D : cường độ hấp thụ của một vạch phổ.
I0 : cường độ chùm sáng tới.
I : cường độ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp
thụ.
Kv: là một hằng số, gọi là hệ số hấp thụ, phụ thuộc bước
sóng X.
L : bề dày của môi trường hấp thụ chứa nguyên tố phân
tích.
c : Nồng độ nguyên tố nghiên cứu trong mẫu.
Phương pháp AAS có độ nhạy cao, có thể phân tích đồng thòi nhiều
nguyên tố cùng một lúc, nhưng giá thành phân tích cao vì đòi hỏi trang thiết bị
đắt tiền.
2.6.5. Phương pháp cực phổ [2], [7], [12].
2.6.5.I. Cực phổ cổ điển [7], [12].
Nguyên tắc: Đây là phương pháp phân tích điện hoá dựa trên việc đo dòng
thu được từ sự điện phân dung dịch tại vi điện cực theo thế áp vào. Cực phổ đồ
biểu diễn mối quan hệ giữa dòng và thế của quá trình điện phân, trong điều
kiện xác định sẽ cung cấp những thông tin định tính (thế bán sóng E1/2) và
định lượng (chiều cao sóng tỷ lệ với cường độ dòng ) về chất phân tích.
Giới hạn phân tích của cực phổ cổ điển là 10'2- 10'5M. Phép định lượng bằng
cực phổ cổ điển dựa trên phương trình Ilkovic.
Id = 6 0 5 .n .D 1/2.m 2/3.t1/6.C
= k.c với k = 605 . n . D1/2. m2/3. t1/6
Trong đó: Id : Cường độ dòng khuyếch tán giới hạn (pA)
n : Số electron mà một ion chất khử cực trao đổi trong

phản ứng điện hoá trên điện cực.
D : Hệ số khuyếch tán (ernes'1).
m : Khối lượng giọt thuỷ ngân chảy ra từ mao quản (mg/s).
t : Chu kỳ giọt (thời gian tạo giọt thuỷ ngân) (s).
c : Nồng độ chất điện hoạt trong dung dịch (mM)
Giá tĩị Id tỷ lệ với nồng độ c. Đây là phương trình làm cơ sở định lượng cho
phương pháp cực phổ.
2.Ó.5.2. Cực phổ sóng vuông [2], [7], [12].
Cực phổ sóng vuông được Barker và Senkins nghiên cứu với mục đích loại
trừ dòng tụ điện để tăng độ nhạy của phương pháp cực phổ. Ở đây dòng tụ
điện sẽ được loại trừ bằng cách máy chỉ ghi các tín hiệu đo ở cuối xung vuông
và ở cuối giọt khi bề mặt điện cực hầu như không tăng nữa. Theo Barker độ
nhạy của phương pháp cực phổ sóng vuông có thể đạt đến 10‘7M đối với quá
trình phản ứng thuận nghịch và 10'6 M đối với quá trình phản ứng không thuận
nghịch.
2.Ổ.5.3. Cực phổ xung vi phân [2], [7].
Trong cực phổ cổ điển, dòng được đo liên tục theo điện thế tăng dần trên
điện cực. Dòng này gồm hai thành phần là dòng khuy ếch tán Id và dòng tụ
điện Ic. Dòng khuyếch tán Id (dòng Faraday) bắt nguồn từ quá trình oxy hoá
khử xảy ra trên bề mặt điện cực và tỷ lệ thuận với nồng độ chất có hoạt tính
điện hoá. Dòng tụ điện Ic tạo ra bởi hiện tượng tích điện trong các vi điện cực.
Những thay đổi của dòng tụ điện là nguyên nhân chính làm giảm độ nhạy và
độ chọn lọc của cực phổ cổ điển. Nếu độ lớn của dòng khuyếch tán bằng hoặc
thấp hơn dòng tụ điện thì việc xác định sẽ không thực hiện được. Để triệt tiêu
dòng tụ điện người ta đặt lên điện cực làm việc ngoài thế một chiều biến đổi
tuyến tính theo thời gian, một thế xoay chiều dạng xung (điện áp phụ dạng
xung) vuông góc ở cuối chu trình đo. Cường độ dòng được đo ở hai thời điểm:
trong một khoảng thời gian Tị (16-20ms) trước khi nạp xung và trong khoảng
thời gian T2(20ms) trước khi cắt xung. Bằng kỹ thuật này, dòng tụ điện được
loại trừ triệt để hơn, độ nhạy của của phương pháp này rất cao (<10'7 M) và

phân giải được hai nấc có thế bán sóng cách nhau chỉ 0,05V. Đối với các quá
trình phản ứng bất thuận nghịch, độ nhạy của phương pháp cực phổ xung vi
phân cao hơn phương pháp cực phổ sóng vuông.
2.Ổ.5.4. Cực phổ Von-ampe hoà tan [2], [7].
Phương pháp Von-ampe hoà tan có độ nhạy cao bằng cách điện phân làm
giàu chất cần phân tích từ một dung dịch rất loãng lên bề mặt điện cực làm
việc. Nếu việc điện phân làm giàu được thực hiện trong những điều kiện thích
hợp thì nồng độ các chất cần xác định trên điện cực cao hơn trong dung dịch.
Việc xác định được thực hiện bằng quá trình điện phân hoà tan các chất đã kết
tủa trên bề mặt điện cực vào lại dung dịch. Phương pháp Vôn-ampe hòa tan có
độ nhạy rất cao.
2.7. Hệ máy cực phổ VA 757 Computrace [2], [7], [19].
* Nguyên lý hoạt động [7], [19].
Máy cực phổ VA 757 Computrace là sản phẩm kết hợp giữa toán, tin học
và các kỹ thuật cực phổ. Để tiến hành phân tích bằng phương pháp cực phổ,
người ta dùng bộ thiết bị gồm một máy cực phổ tự ghi và một bình điện phân
gồm hệ 3 điện cực: cực làm việc là điện cực giọt thuỷ ngân, cực so sánh có thế
không đổi, là điện cực calomen bão hoà và cực phụ trợ Pt. Bình điện phân phải
có cấu tạo thích hợp cho việc dẫn khí trơ N2 vào dung dịch phân tích để loại
oxy hoà tan trong dung dịch.
Dòng khuyếch đo được là một hàm phụ thuộc các yếu tố: Nồng độ chất
phân tích tham gia vào phản ứng điện hoá trên điện cực, diện tích của điện cực
(diện tích bề mặt giọt thuỷ ngân) và thòi gian.Vì diện tích bề mặt giọt thuỷ
ngân là hàm của thời gian, nên có thể xem dòng khuyếch tán là hàm của nồng
độ chất phân tích và thời gian:
Id = f(C, t)
Ngưòi ta phải dùng một máy bơm chính xác điều khiển bằng vi tính để tạo
ra những giọt thuỷ ngân có kích thước đồng nhất và không đổi trong quá trình
đo. Vận tốc nhỏ giọt (thông thường là 2-6 s) có thể giám sát được nhờ kích
thước mao quản và chiều cao của cột thuỷ ngân, do vậy đã lập được một nền

thời gian lặp lại được. Mỗi lần giọt rơi xuống thì dung dịch được khuấy trộn
và hệ trở lại những điều kiện ban đầu của nó (t = 0). Dòng chạy qua đúng vào
trước lúc giọt rơi sẽ là cực đại đối với t = chu kỳ giọt. Vậy điện cực này đã
giải quyết được vấn đề phụ thuộc vào thời gian của dòng khuy ếch tán. Như
vậy dòng đo được chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích:
Id=k.c
Trên cực phổ đồ thu được, vị trí của đỉnh pic sẽ đặc trưng cho từng chất
được dùng vào mục đích phân tích định tính, chiều cao pic liên quan tuyến
tính với nồng độ được dùng vào mục đích định lượng [7].
* Máy VA 757 Computrace là máy máy cực phổ đa năng, bao gồm nhiều kỹ
thuật đo khác nhau (tuỳ đối tượng phân tích) như: Cực phổ sóng vuông, cực
phổ xung vi phân, cực phổ Von-ampe hoà tan, phương pháp Von-ampe quét
thế nhanh, nhằm làm tăng độ nhạy và độ chọn lọc [19].
* Lĩnh vực áp dụng [7], [12].
+ phân tích vô cơ:
Máy có thể phân tích được hầu hết các chất vô cơ, đặc biệt là vói kim loại
nặng. Các ứng dụng phân tích bao gồm việc xác định các hợp phần của hợp
kim cũng như hàm lượng vết kim loại trong nước thải, thực phẩm, sơn, thuỷ
tinh và các mẫu sinh học. Máy có thể cạnh tranh được với quang phổ hấp thụ
nguyên tử về độ nhạy, tính kinh tế, sự thuận tiện, đơn giản trong thao tác và
thời gian phân tích.
+ phân tích hữu cơ:
Tuy phép cực phổ đặc biệt thích hợp cho phân tích vô cơ, nhưng vẫn có
hàng trăm ứng dụng cho việc xác định các chất hữu cơ. Rất nhiều chất hữu cơ
có thể phân tích trực tiếp bằng kỹ thuật cực phổ khi trong phân tử của chúng
chứa các nhóm thế có thể tham gia phản ứng khử hoặc có nhóm thế tham gia
phản ứng oxy hoá. Với các chất không có phản ứng cực phổ ta có thể phân
tích chúng nhờ phương pháp gián tiếp bằng cách dùng phản ứng hoá học
chuyển chúng thành dạng hoạt động cực phổ hoặc phân tích chúng dựa trên
phản ứng với một chất khác có hoạt tính cực phổ.

+ Phân tích cực phổ các hỗn hợp:
Phương pháp phân tích cực phổ có thể xác định được nhiều chất cùng một
lúc. Khi một dung dịch cần phân tích có chứa hơn một chất bị khử thì các
dòng khuyếch tán gây ra bởi mỗi chất sẽ có thể quan sát được. Nếu thế trên
DME đủ âm để mọi chất đều bị khử thì dòng khuyếch tán sẽ đúng là tổng của
tất cả các dòng khuyếch tán riêng phần.
* Tóm tắt ưu điểm của máy cực phổ VA 757 Computrace /7/.
+ Phạm vi ứng dụng: Phân tích được cả chất vô cơ và hữu cơ, phân tích
được nhiều chất cùng một lúc.
+ Độ nhạy cao: Máy có thể làm việc ở vùng nồng độ ppm-ppb.
+ Độ phân giải cao: Phương pháp cực phổ có thể phân giải được 2 nấc có
thế bán sóng cách nhau chỉ 0,05V. Các đỉnh của sóng cực phổ sắc nhọn hơn
quang phổ tử ngoại và khả kiến nên có thể phân tích trực tiếp mà không cần
tách chiết, thời gian phân tích nhanh.
+ Máy có thể phân tích cả dung dịch đục, dung dịch có màu nên rất
thuận lợi, việc chuẩn bị mẫu đơn giản.
+ Các kết quả đo được tự động tính toán, vẽ đồ thị, lưu trữ trong hệ điều
hành của máy vi tính.
+ Việc tạo ra các điện cực mói (giọt thuỷ ngân mói) trong thời gian ngắn
sẽ ngăn không cho tạp chất hoặc sản phẩm phản ứng điện hoá bám lại ở điện
cực.
2.8. Các phương pháp vô cơ hoá [5], [13].
Quá trình vô cơ hoá mẫu để chuyển selen từ dạng hữu cơ trong mẫu về
dạng selen(IV) là bước quan trọng.
2.8.1. Phương pháp tro hoá ướt [13].
Nguyên tắc\ oxy hoá mẫu bằng một acid hoặc hỗn hợp acid có tính oxy hoá
mạnh thích hợp.
Phương pháp tro hoá ướt rút ngắn được thời gian phân tích so với tro hoá
khô, bảo toàn được chất phân tích nhưng phải dùng lượng acid nhiều, thường
gấp 3-5 lần mẫu vì vậy yêu cầu các acid phải có độ tinh khiết cao.

2.8.2. Xử lý mẫu trong lò vi sóng [13].
Thực chất là tro hoá ướt thực hiện trong lò vi sóng.
Nguyên tắc: Dùng năng lượng vi sóng đốt nóng thuốc thử và mẫu có khả
năng hấp thụ vi sóng đựng trong bình kín. Trong điều kiện kín, áp suất cao, có
thể dễ dàng đạt được nhiệt độ cao làm tăng tốc độ vô cơ hoá.
- 13-
Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, làm giảm đáng kể
thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu và vô cơ hoá triệt để, có thể vô cơ hoá
được nhiều mẫu cùng một đối tượng hoặc nhiều đối tượng trong một lần(12
mẫu). Có thể điều khiển quá trình vô cơ hoá từ xa bằng một máy vi tính do đó
làm tăng độ an toàn cho ngưòi sử dụng và độ tin cậy của hệ thống. Tuy nhiên
phương pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không đủ
điều kiện trang bị.
2.8.3. Đốt mẫu bằng khí oxy tinh khiết trong bình kín [5].
Mẫu được đem gói trong giấy lọc không tro và đặt trong que đốt, đốt mẫu
trong bình kín chứa oxy tinh khiết. Dùng các dung dịch thích hợp để hấp thụ.
Ưu điểm của phương pháp này là dụng cụ và thao tác đơn giản, thời gian
phá mẫu nhanh.
3. THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QỦA
3.1. Nguyên yật liệu, hoá chất, thiết bị dụng cụ
3.1.1. Hoá chất, nguyên liệu:
- Acid nitric đặc 65% loại PA của Merck (Đức)
- Acid hydrocloric 37% loại PA của Merck (Đức)
- Acid hydrocloric 0,1M
- Dung dịch selen chuẩn lOOOppm của Merck (Đức)
- Nước cất 2 lần
- Nước cất siêu lọc
- Hai mẫu nấm men của Trung tâm nghiên cứu và phát triển khoa
học công nghệ Dược (ký hiệu M1317 và M817)
3.1.2.Thiết b ị, dụng cụ:

- Máy cực phổ VA 757 Computrace (Metrohm/Thụy Sĩ)
-Bình khí Nitơ
- Máy in
- Bình khí oxy, túi đựng khí oxy
- Cân phân tích
- Bình định mức 25ml; 50ml; 100ml
- Pipet định mức các loại: 0,1ml; 0,2ml; 0,5ml;
lml; 2mỉ; 5ml; 10ml
- Giấy lọc không tro
- Cốc có mỏ
- Que đốt
- Bình đốt oxy
3.1.3. Xử lý dụng cụ.
Để tránh nhiễm từ dụng cụ gây ra sai số trong quá trình phân tích, tất
cả các dụng cụ thuỷ tinh đều phải được xử lý theo quy trình sau:
-15-
- Rửa sạch bằng các phương pháp thông thường
- Đổ đầy acid nitric (HN03) 10% ngâm trong vòng 24giờ
- Thu hồi lại HNO3 10%, tráng dụng cụ bằng nước cất, sau đó lại cho
HNO3 mới và đun cách thủy trong vòng 4-5giờ
- Đổ acid trong dụng cụ ra, tráng lại 3 lần bằng nước cất
- Để khô tự nhiên hoặc sấy nhẹ
3.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.
3.2.1. Kết quả khảo sát chọn thông sô cho phép đo.
Việc chọn thông số có ảnh hưởng đến độ phân giải và độ lặp lại của phép
đo. Sau thời gian khảo sát, chúng tôi đã chọn được bộ thông số là:
Nền đo:Acid hydrocloric (HC1) 0,1M.
Mode
DP
Differential Pulse

Highest current range
Lowest current range
Electrode
Drop size (1 9)
Stirrer speed (rpm)
Sweep
Equilibration time (s)
Start potential (V)
End potential (V)
Voltage step (V)
Voltage step time (s)
Sweep rate (V/s)
Pulse amplitude (V)
Pulse time (s)
10 mA
100 nA
HMDE
4
2000
20
-0.400
-0.600
0.006
1.200
0.005
0.050
0.040
3.2.2. Kiểm tra độ lặp lại của máy với bộ thông số đã chọn.
Tiến hành đo dung dịch chuẩn Se 0,1 ppm trong nền HC1 0,1M, ghi lại
cường độ dòng và thế bán sóng của 5 lần đo.

Kết quả được máy ghi lại như sau:
Kết quả xác định độ lặp lại của phép đo trên mẫu chuẩn Se 0,1 ppm, nén HCI 0.1N
VR V UA
1-1 -0.509 -0.203
1-2 -0.509 -0.201
1-3 -G.505 -0.204
1-4 -0.509 -0.204
1-5 -0.509 -0.203
I.mean Std.Dev*
-0.203 0.001
I.delta Comments
1(A)
U(V)
/ -v >N
:\V . ^
. A 0 V \
v r u - V
Hình 1: Cực phổ đồ độ lặp lại của máy với bộ thông số đã
/ Z$-Ẵũyl\
h ĩỉỉư-VỉẺs
- 17 - \ L
t % l /
\ .
Kết luận: Với bộ thông số đã chọn, máy cho độ lặp lại của các lần đo
khác nhau trên cùng một dung dịch là tốt.
Ta thấy: giá trị trung bình : Imean = - 0 ,2 0 3 A
độ lệch chuẩn : Std.dev = 0,001
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính, lập đường chuẩn [8], [9].
Sau khi đã tìm được những điều kiện thích hợp để định lượng selen như
trên, tiến hành pha 2 dãy dung dịch chuẩn selen (từ dung dịch chuẩn selen

lOOOppm) có các nồng độ sau:
- Dãy 1 : 0,lppm; 0,2ppm; 0,3ppm; 0,4ppm; 0,5ppm.
- Dãy 2 : lppm; 2ppm; 3ppm; 4ppm; 5ppm; 6ppm.
Rồi đem đo trên máy cực phổ VA757 Computrace, cho thấy như sau:
- Ở khoảng nồng độ từ 2ppm đến 6ppm không cho khoảng tuyến tính giữa
nồng độ c và cường độ dòng thu được. Do vậy ở khoảng nồng độ này không
thể dùng để lập đường chuẩn ( Hình 2).
- Ở khoảng nồng độ từ 0,lppm đến 0,5ppm đã cho sự liên hệ tuyến tính giữa
nồng độ c và cường độ dòng. Vì thế thiết lập được đường chuẩn với các nồng
độ 0,lppm; 0,2ppm; 0,3ppm; 0,4ppm và dùng để định lượng selen (Hình 3).
- 18-
D
2 Cũu
! °
50u 1
1 OOl
- I
a
□
□
2 OGrp 4.00.7! 6.GUTÌ
c / u J 'L )
Hlnh 2: Kết quả xác định nồng độ Se trong mẫu chuẩn 1-6 ppm, nền H ơ 0,1N
- 19-
-1.20U
0 1OOu 200u 300u 400u
c / (g/L)
U(V)
Hình 3: Cực phổ đồ và đường chuẩn dùng để định lượng selen.
- 2 0 -

Phương trình hồi quy: Id = -3,485.10'3.c +2,119.10"7
Độ lệch chuẩn : Std.Dev = 1,282.108
3.2.4. Định lượng selen trong nấm men theo phương pháp đường chuẩn
3.2.4.I. Kỹ thuật vô cơ hoá [12].
- Cân chính xác khoảng 50mg nấm men đem gói trong giấy lọc không tro
(kích thước giấy 2x3cm) và đặt mẫu trong que đốt.
- Đốt mẫu trong bình chứa 1 lít oxy.
- Cho vào bình 25ml HC1 0,1M. Lắc kỹ để hấp thụ hoàn toàn Seơ2, sau đó
đun cách thuỷ.
- Đổ dịch hấp thụ vào cốc có mỏ 100ml, rồi cho vào bình định mức 50ml.
Tráng bình đốt và nút 2 lần mỗi lần khoảng 10ml HC1 0,1M. Tập trung dịch
tráng vào cốc có mỏ, sau đó cho vào bình định mức 50ml.
- Định mức tất cả đến 50ml.
- Hút 10ml dung dịch này pha thành 25ml bằng HC1 0,1M trong bình định
mức 25ml.
- Dung dịch cuối cùng đem đo trên máy cực phổ VA757 Computrace.
- Hàm lượng selen trong nấm men được tính theo công thức:
O^-IO6
Trong đó:
X : Số )ug selen trong một gam nấm men khô (ịig/g)
c : Nồng độ selen xác định theo đường chuẩn (g/1)
V : Thể tích định mức bằng HC1 0,1M sau khi đốt mẫu (1)
k : Hệ số pha loãng của V trước khi đo cực phổ
m : Khối lượng mẫu (nấm men) cân đựơc (g)
a% : Phần trăm độ ẩm của mẫu (nấm men)
106 : Hệ số chuyển đổi g thành Ịig (|LLg/g)