Phát triển thuốc trừ sâu thảo mộc phòng trừ sâu xanh bướm trắng (pieris rapae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI













LƯU THỊ PHƯƠNG



PHÁT TRIỂN THUỐC TRỪ SÂU THẢO MỘC
PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG
(PIERIS RAPAE)


LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số : 60.42.02.01

Giảng viên hướng dẫn : TS. ðặng Xuân Nghiêm

HÀ NỘI - 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm
ơn và các thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn


Lưu Thị Phương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


ii
LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn,
giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ bộ môn Sinh học
phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại học Nông
nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường Trường ñại
học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo TS. ðặng Xuân Nghiêm ñã
dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn
thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn tới cùng thầy giáo TS.
Nguyễn Văn Giang, Kĩ sư Nguyễn Ngọc Hòa, Kĩ sư Nguyễn Khắc Hải, các bạn
sinh viên, gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện ñể tôi học tập và hoàn
thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Mặc dù tôi ñã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt
tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất
mong nhận ñược những ñóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2013.

Học viên

Lưu Thị Phương


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


iii



MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các từ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình viii
PHẦN I MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu 2
1.2.1 Mục ñích 2
1.2.2 Yêu cầu 3
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
2.1 Tổng quan về sâu xanh bướm trắng Pieris rapae (Lynnaeus) 5
2.1.1 Sự sinh trưởng và phát triển của sâu xanh bướm trắng 5
2.1.2 Các biện pháp phòng chống 7

2.1.3 Các loại enzyme chính trong dịch tiêu hóa của sâu 8
2.2 Tổng quan về các loại thực vật sử dụng trong ñề tài 20
2.2.1 Hạt gấc 20
2.2.2 Quả ớt 22
2.2.3 Xoan ta 24
2.3 Tình hình nghiên cứu thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học 25
PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1 Vật liệu và ñối tượng nghiên cứu 29
3.1.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 29
3.1.2 ðối tượng nghiên cứu 29
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


iv
3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 29
3.1.4 Thiết bị và hóa chất sử sụng 29
3.2 Phương pháp nghiên cứu 31
3.2.1 Chuẩn bị sâu xanh bướm trắng cho nghiên cứu 31
3.2.2 Chuẩn bị dịch chiết từ thực vật 31
3.2.3 Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn cho sâu 31
3.2.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu 32
3.2.5 Thu dịch chiết enzyme tiêu hóa từ sâu xanh (Mehrabadi và Bandani,
2009) 32
3.2.6 Hoạt tính gây ức chế các enzyme có trong ruột sâu của các dịch chiết 32
3.2.7 Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên cây trồng trong phòng thí nghiệm 33
3.2.8 Tách chiết quả ớt bằng các dung môi hữu cơ khác nhau 33
3.2.9 Khảo sát hiệu lực gây chết trên ñồng ruộng 33
3.2.10 Ảnh hưởng của các loại dịch chiết tới một vài chỉ tiêu nông sinh học
của cải bắp 34
3.3 Phương pháp xử lí số liệu 37

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
4.1 Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn cho sâu 38
4.2 Khảo sát hiệu lực diệt sâu 40
4.3 Khảo sát hiệu lực cộng hưởng của các dịch chiết 42
4.4 Khả năng ức chế enzyme ruột sâu của các loại dịch chiết 43
4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu với cây trồng trong phòng thí nghiệm 45
4.6 Hiệu lực gây ngán ăn và diệt sâu của dịch chiết gấc và ớt khi tách
chiết bằng các dung môi khác nhau
46
4.7 Nồng ñộ tối ưu diệt sâu của dịch chiết ớt và gấc 49
4.8 Khảo sát hiệu lực gây chết trên ñồng ruộng 53
4.9 Ảnh hưởng của các loại dịch chiết tới một vài chỉ tiêu nông sinh học
của cải bắp
56
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60
5.1 Kết luận 60
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


v

5.2 Kiến nghị 61
PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 63
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

APMSF : Amidinophenyl-methane sulfonyl-fluoride.
BVTV : Bảo vệ thực vật.
CMC : Carboxymethyl cellulose.
CT : Công thức.
DMSO : Dimethyl sulfoxide.
DNSA : Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution.
GFP : Green-fluorescent protein.
LD
50
: Lethal dose 50.
LC
50
: Lethal concentration 50.
LDL : Low Density Lipoproteins.
Na 2,6D : Na 2, 6-dichlorophenol indophenol.
pHMB : parahydroxymercuribenzoate.
PMSF : Phenylmethanesulfonylfluoride.
P. rapae : Pieris rapae (L.), sâu xanh bướm trắng.
TLCK : Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochloride.
TPCK : Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone.
TRPV1 : Transient Receptor Potential V1.
TS : Tiến sĩ.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang
1 Các nhóm enzyme protease tiêu hóa trong ruột một số loại côn trùng. 12
2 Một số chất ức chế protease 15
3 Máy móc dùng trong ñề tài 30
4 Hóa chất sử dụng 30
5 Hiệu lực gây ngán ăn với sâu xanh bướm trắng của các mẫu dịch chiết
từ thực vật 39
6 Hiệu lực gây ngán ăn với các phương pháp tách chiết khác nhau 47
7 Giá trị trung bình của các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển khi thu hoạch 57
8 Một vài chỉ tiêu năng suất và chất lượng của cải bắp sử dụng trong ñề tài 58
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


viii
DANH MỤC HÌNH


STT Tên hình Trang
1 Các dạng hình thái của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae
(Lynnaeus)). 5

2 Phân loại protease 10
3 Phân loại amylase 17
4 Phân loại cellulase 19
5 Hiệu lực diệt sâu dịch chiết ớt sau 48 giờ 40
6 Hiệu lực diệt sâu xanh bướm trắng của bốn dịch chiết 41
7 Hiệu lực diệt sâu cộng hưởng. 43
8 Khả năng ức chế của các dịch chiết tới enzyme ruột sâu. 44

9 Hiệu lực diệt sâu với cây trồng trong phòng thí nghiệm. 46
10 Hiệu lực diệt sâu của dịch chiết gấc và ớt khi tách chiết bằng các dung
môi khác nhau. 48
11 Hiệu lực diệt sâu ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau của dịch chiết ớt
tách chiết bằng methanol. 49
12 Hiệu lực diệt sâu ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau của dịch chiết
gấc tách chiết bằng H
2
O. 51
13 Nồng ñộ tối ưu diệt sâu của các loại dịch chiết. 52
14 Hình ảnh thí nghiệm xác ñịnh nồng ñộ tối ưu diệt sâu của các loại
dịch chiết. 53

15 Số lượng sâu con/cây sau 4 tuần phun. 54
16 Hiệu lực diệt sâu của các dịch chiết ngoài ñồng ruộng. 55
17 Hình ảnh rau cải bắp ñang trong giai ñoạn cuốn bắp 57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


1

PHẦN I. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Sâu và các sinh vật gây hại là những tác nhân hạn chế ñáng kể năng suất cây
trồng trên khắp thế giới. Các nhà khoa học ước tính, hàng năm, thiệt hại mùa màng
do sâu hại lên ñến 30% và con số này còn cao hơn ở các nước ñang phát triển
(Thomas và Waage, 1996). Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) là sâu hại rau họ
hoa thập tự (cruciferous vegetables) chủ yếu trên toàn thế giới, chúng trực tiếp ăn lá,

lá non, thân, hoa của cây rau với tốc ñộ nhanh, khả năng gây hại lớn, gây ảnh hưởng
nghiêm trọng tới sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng và năng suất mùa màng
trên diện rộng. Mặt khác, sự tồn tại của sâu cùng phân và chất dịch do sâu tiết ra
làm ảnh hưởng tới phẩm chất của sản phẩm sau thu hoạch, gây khó khăn cho tiêu
thụ và tiêu dùng các sản phẩm rau xanh. Chúng có thể gây ra tổn thất từ 90 - 100%
mùa màng (Talekar và Shelton, 1993).
Các biện pháp diệt trừ sâu xanh bướm trắng chủ yếu hiện nay dùng thuốc trừ
sâu hóa học vì chúng cho hiệu quả nhanh, mạnh, sử dụng thuận tiện, rẻ và dùng
ñược trên các diện tích lớn, .v.v. Biện pháp áp dụng thuốc hóa học ñã trở thành một
nội dung không thể thiếu trong quy trình canh tác của nhiều loại cây trồng, trong ñó
có các loại rau hoa thập tự (ñối tượng gây hại chính của sâu xanh bướm trắng) ở
trên thế giới và Việt Nam (Phạm Văn Lầm, 1995).
Việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học và sử dụng chúng một cách thiếu kiến
thức, tràn lan, không kiểm soát dẫn tới nhiều tác hại lớn ñến sức khoẻ con người,
gây ô nhiễm môi trường vùng trồng rau, ảnh hưởng tới nguồn ñất và nước, ñồng
thời ảnh hưởng tới sự ña dạng của các sinh vật có lợi, phá vỡ cân bằng sinh thái, và
ñặc biệt, nó còn thúc ñẩy quá trình tiến hoá theo hướng kháng thuốc trừ sâu ở các
loài sâu bệnh (Roush, 1997). Chính vì vậy, việc tìm ra các thuốc trừ sâu sinh học
thân thiện với môi trường, ít ảnh hưởng ñến hệ sinh thái, và không có tác hại ñến
sức khoẻ của con người ñã ñược ñặt ra.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


2

Mục tiêu của chúng ta hiện nay là xây dựng một nền nông nghiệp bền vững,
ñảm bảo cho hệ sinh thái ổn ñịnh lâu dài, do ñó sự phát triển và thực hiện hệ thống
biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) ñang là mối quan tâm ở nhiều nước trên
thế giới, trong ñó có Việt Nam. ðảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, ñặc biệt ñối
với rau xanh ñang là vấn ñề bức xúc hiện nay. Cho nên những năm gần ñây các nhà

khoa học bảo vệ thực vật ñã tập trung nghiên cứu biện pháp sinh học và coi biện
pháp này là biện pháp cốt lõi trong hệ thống phòng trừ dịch hại tổng hợp.
Các nghiên cứu nhằm kiểm soát sâu hại tập trung vào 3 hướng chính: nghiên
cứu sử dụng các vi khuẩn, virus, nấm bệnh là thiên ñịch của mỗi loài sâu bệnh, nghiên
cứu sản xuất các protein ñộc cho sâu hại và côn trùng từ vi khuẩn, như Bt từ Bacillus
thuringensis (Tabashnik, 1994); nghiên cứu tạo ra các thuốc trừ sâu hại từ protein và
các hợp chất thứ sinh của thực vật như các protein ức chế enzyme tiêu hoá (PPIs) từ
một số loại hạt (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2000) hay azadirachtin và các chất có
trong dịch chiết lá và hạt cây xoan Ấn ðộ (Azadirachta indica) (Amadioha, 2000,
Dương Anh Tuấn, 2002, Montes-Molina và cộng sự, 2008). Nước ta có nguồn tài
nguyên thực vật phong phú và ña dạng, nhiều trong số này ñã ñược dùng làm thuốc
chữa bệnh (ðỗ Tất Lợi, 2006). Khả năng kháng khuẩn và kháng sâu bệnh của một số
cây thuốc cũng ñã ñược các nhà khoa học nước ta khảo sát và nghiên cứu (Lê Doãn
Liên và cộng sự, 2000, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 2000, ðặng Xuân Nghiêm, 2002).
Tuy nhiên, số lượng những nghiên cứu ñó còn rất ít ỏi so với tiềm năng ứng dụng thực
vật làm thuốc trừ sâu sinh học ở nước ta.
Vì thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện ñề tài: “Phát triển thuốc trừ sâu
thảo mộc phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae)” nhằm nghiên cứu hiệu
lực diệt và gây ngán ăn của một số dịch chiết từ các thực vật tiềm năng có hiệu lực
cao ñối với sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae). ðồng thời, nghiên cứu phối hợp
các dịch chiết/hợp chất từ các thực vật khác nhau ñể phát triển chế phẩm trừ sâu
hiệu quả hơn .
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


3

Khảo sát nhằm tìm ra loại dịch chiết từ thực vật có khả năng diệt trừ và gây

ngán ăn ñối với sâu xanh bướm trắng từ các loại thực vật có trong ñề tài. Tìm hiểu
hoạt tính gây ức chế enzyme có trong ruột sâu và tối ưu hóa việc tách chiết các chất
có hoạt tính phòng trừ sâu của các loại dịch chiết có hoạt tính. Nghiên cứu phối hợp
các dịch chiết/hợp chất từ các thực vật khác nhau ñể phát triển chế phẩm trừ sâu
hiệu quả hơn. Khảo sát hiệu lực gây chết sâu trên cây trồng trong phòng thí nghiệm
và ngoài ñồng ruộng của các công thức thử nghiệm. ðánh giá một số chỉ tiêu nông
sinh học và dinh dưỡng của cải bắp sau khi phun các công thức dịch chiết thực vật.
1.2.2. Yêu cầu
- Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn của các dịch chiết ñối với sâu xanh bướm trắng.
- Khảo sát hiệu lực diệt sâu của các dịch chiết ñối với sâu xanh bướm trắng.
- Khảo sát hoạt tính gây ức chế các enzyme có trong ruột sâu của các dịch chiết.
- Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên cây trồng trong phòng thí nghiệm.
- Lựa chọn dung môi tách chiết hiệu quả nhất cho các chất có hoạt tính
phòng trừ sâu từ các dịch chiết ñã chọn.
- Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên ñồng ruộng.
- ðánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu nông sinh học và dinh dưỡng của cải bắp
sau khi phun các công thức dịch chiết thực vật.











Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………

4



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


5

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về sâu xanh bướm trắng Pieris rapae (Lynnaeus)
2.1.1. Sự sinh trưởng và phát triển của sâu xanh bướm trắng
Sâu xanh bướm trắng phấn bố rộng rãi trên toàn châu Âu, Bắc Phi và châu Á
và cũng ñã vô tình ñược ñưa vào Bắc Mỹ, Australia và New Zealand. Sâu xanh có
phạm vi ký chủ rộng gồm 9 họ và 35 loài thực vật khác nhau như họ hoa thập tự, họ
cúc, họ bách hợp v.v. Tuy nhiên chúng chỉ phá hại nặng trên rau họ hoa thập tự và
là ñối tượng phải phòng trừ ở một số nước như Trung Quốc, Malaysia, Nhật Bản,
Philippin, khu vực Trung Mỹ và Australia.v.v.

Trứng


Ấu trùng

Nhộng


Con cái trưởng thành

Giới: ðộng vật
Ngành: Chân khớp
Lớp: Côn trùng
Bộ: Cánh phấn
Họ: Pieridae
Chi: Pieris
Loài: sâu xanh bướm
trắng (P. rapae)
(Lynnaeus, 1758)


Bắt cặp


Con ñực trưởng thành

Hình 1. Các dạng hình thái của sâu xanh bướm trắng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


6

(Pieris rapae (Lynnaeus)).
Nguồn: Capiner, 2008:
Bướm có thân màu ñen, hai cánh trắng, ñỉnh cánh có vết ñen hình tam giác.
Trứng màu hơi vàng, sâu non màu xanh lục, trên lưng có những ñiểm ñen nhỏ. Sâu
non có 5 tuổi, khi ñẫy sức dài khoảng 28 - 35mm. Nhộng màu xanh, khi gần vũ hóa
chuyển màu xanh hơi vàng (hình 1). ðặc tính sinh hoạt và phát sinh: bướm hoạt
ñộng ban ngày. Sau vũ hóa 3 - 4 ngày thì ñẻ trứng, trứng ñẻ từng qủa, rải rác mặt

sau của lá rau. Một bướm có thể ñẻ từ 50 - 200 trứng. Bướm sâu xanh sống khá lâu
từ 2 - 5 tuần lễ. Sâu xanh mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm
thủng lá rau và ăn kiệt chỉ còn gân lá. Vì vậy nếu ñể mật ñộ cao thì ruộng rau sẽ bị
trơ trụi, xơ xác. Vòng ñời của sâu xanh bướm trắng từ 26 - 30 ngày. Trong ñó giai
ñoạn trứng từ 6 - 8 ngày, sâu non 10 - 14 ngày, nhộng 7 - 8 ngày. Bướm vũ hóa sau
3 - 4 ngày thì ñẻ trứng (Lyu và cộng sự, 1995).
Sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước ñến tháng 5 năm sau,
nhưng thường nặng nhất từ tháng 2 ñến tháng 5 vì thời tiết lúc này phù hợp với sinh
trưởng và phát triển của sâu. Sâu xanh thường tập trung và gây hại nặng ở những
ruộng rau xanh tốt (Capinera, 2008). Các nghiên cứu về sinh thái quần thể ñều cho
rằng sâu xanh bướm trắng có khả năng sinh sản và phát tán mạnh khi nhiệt ñộ thích
hợp là 29 - 31°C và chúng luôn có mật ñộ cao ở những khu có trồng xen các loại
cây có hoa hoặc nhiều cây hoa dại trên bờ ruộng.
Ở Việt Nam trước ñây sâu xanh bướm trắng có phát sinh và gây hại trên rau
họ hoa thập tự nhưng chưa nghiêm trọng. Các nhà côn trùng học ở nước ta xếp sâu
xanh bướm trắng vào hạng thứ yếu, tuy nhiên trong nhiều năm gần ñây sâu xanh
bướm trắng phát sinh gây hại nặng và ñược coi là ñối tượng phải phòng trừ ở nhiều
ruộng rau trong cả nước. Các nghiên cứu của Lê Văn Trịnh (1998) cho tới nay là
một trong những nghiên cứu khá ñầy ñủ về sâu xanh bướm trắng, và kết quả cho
thấy vòng ñời của sâu xanh bướm trắng từ 19 - 30 ngày tuỳ theo ñiều kiện nhiệt ñộ,
ẩm ñộ khác nhau. Số trứng một bướm cái ñẻ là 120,5 - 141,6 và tỷ lệ nở của trứng
là 90,2 - 95,5%. Mỗi năm có 15 lứa sâu phát sinh với khoảng cách giữa cao ñiểm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


7

hai lứa là 20 - 26 ngày. Trên ruộng rau xuất hiện mật ñộ cao từ tháng 1 ñến tháng 5
(mật ñộ lên tới 9 con/cây), thời gian khác trong năm mật ñộ sâu thấp, ñặc biệt giữa
tháng 7 tới tháng 9 (ít khi vượt quá 1 con/cây). Thời vụ gieo trồng cũng là một vấn

ñề có ý nghĩa không nhỏ ñối với sự phát sinh gây hại của sâu xanh bướm trắng.
Hiện tại sản xuất cải bắp ở ñồng bằng sông Hồng có 3 thời vụ (vụ sớm, chính vụ, vụ
muộn), trong ñó sâu xanh bướm trắng phát sinh gây hại nặng nhất vào vụ muộn.
Sâu xanh bướm trắng là loại côn trùng ña thực gây hại chủ yếu trên các phần
xanh của cây rau ở tất cả các giai ñoạn phát triển của cây từ lúc non cho tới lúc già,
các bộ phận bị hại gồm: lá, thân non, hoa, mà quan trọng và gây hại nặng nhất là
trên lá cây. Sâu xanh phàm ăn và ăn các phần xanh trên cây rất nhanh tạo thành các
lỗ, mảng rách lớn trên lá chỉ trong một thời gian ngắn, khiến cho diện tích quang
hợp của cây bị giảm, cây sinh trưởng phát triển kém, còi cọc, ít tích lũy. Sâu xanh
mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm thủng lá rau và ăn kiệt chỉ
còn gân lá (Lê Văn Trịnh, 1998).
Mức ñộ gây hại trên rau của sâu xanh bướm trắng ở mức trung bình tới
nghiêm trọng. Mức trung bình là khả năng cây rau vẫn có thể cho thu hoạch nhưng
khối lượng và chất lượng bị giảm, mức nghiêm trọng có thể không cho thu hoạch,
chất lượng sản phẩm thấp không thể ñưa ra thị trường tiêu thụ. Loài sâu này phát
sinh và gây hại nặng ở tất cả các vùng và các mùa vụ trồng rau làm giảm năng suất
rau từ 30 – 50%, thậm chí còn có thể gây mất trắng (Lê Văn Trịnh, 1998). Như vậy
thiệt hại do sâu xanh gây ra trên các cây rau họ thập tự là rất ñáng lo ngại, rất cần sự
quan tâm giải quyết của các nhà nông học và bảo vệ thực vật.
2.1.2. Các biện pháp phòng chống
Sâu xanh bướm trắng là ñối tượng của nhiều ñộng vật ăn thịt, ký sinh, và gây
bệnh. Các côn trùng săn mồi như bọ lá chắn (Hemiptera: Pentatomidae), và ong bắp
cày vespid (Hymenoptera: Vespidae). Chim Apanteles glomeratus (L.), chim sẻ
ngô, v.v, tấn công trước giai ñoạn nhộng và giai ñoạn bướm. ðáng chú ý là loài ong
bắp cày ñẻ trứng ký sinh trên ấu trùng của sâu, ấu trùng phát triển và phá vỡ cơ thể
sâu. Trên 90% tỷ lệ tử vong của ấu trùng do sự xuất hiện tự nhiên của bệnh ñã ñược
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


8

báo cáo. Trong giai ñoạn ñầu của nhiễm trùng, ấu trùng không hoạt ñộng và có màu
nhạt màu. Khi bệnh tiến triển, cơ thể sâu bướm biến màu vàng, và có xu hướng xuất
hiện phình to. Sau khi chết, cơ thể hóa ñen, lớp da bị vỡ, và sau ñó cơ thể bị thối rữa
(Capinera, 2008).
Các biện pháp phòng chống sâu xanh bướm trắng chủ yếu hiện nay là sử
dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học. Các loại thuốc ñược sử dụng phổ biến hiện nay
ñó là: VISERIN 4.5EC thuốc có nguồn gốc hóa học thuộc gốc Pyrethroid, Cymerin
10EC, Karate 2.5EC, Catex 1,8EC, 3,6 EC, v.v. .Ưu ñiểm của phương pháp này là
cho hiệu quả nhanh, mạnh, rõ rệt, dễ dàng sử dụng trên diện rộng và giá thành rẻ.
Tuy nhiên nếu không sử dụng ñúng cách, liều lượng, loại, thời ñiểm có thể gây tác
hại rất lớn tới chính con người và môi trường ñất, nước, không khí cùng với việc
làm giảm chất lượng nông sản ñưa ra thị trường. Hiện nay còn có các biện pháp
phòng trừ bằng các phương pháp sinh học, như thuốc trừ sâu sinh học (Vimatox 1.9
EC, Ratoin10EC, Delfin WG (32BIU), Biocin 16WP) chủ yếu dùng vi khuẩn
Bacillus thuringiensis (chế phẩm Bt), sử dụng các loại thiên ñịch (ong bắp cày).
Ngoài ra, sâu xanh bướm trắng hại chủ yếu trên lá rau, vì vậy khi phát hiện có
thể dùng biện pháp thủ công (dùng tay) giết sâu non và nhộng ñối với những vùng có
diện tích nhỏ, các biện pháp canh tác, cách ly các vùng trồng rau bị bệnh .v.v. Tuy
nhiên, các biện pháp này chưa thực sự hiệu quả và có tác dụng phòng trừ chưa cao.
2.1.3. Các loại enzyme chính trong dịch tiêu hóa của sâu
Sâu xanh bướm trắng gây hại chủ yếu trên các cây rau thuộc họ thập tự như
cải bắp, súp lơ, cải xanh, v.v. Các loại cây này chứa các vật chất hữu cơ chủ yếu là
tinh bột, cellulose, protein tương ứng với các nhóm enzyme chính cần nghiên cứu
ñó là amylase, cellulase và protease.
* Tổng quan về protease
Là nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-
NH)
n
trong phân tử protein, polypeptide ñến sản phẩm thủy phân cuối cùng là các

acid amin, ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este.
Protease có chức năng sinh học rất ña dạng, ñóng vai trò quan trọng trong việc ñiều
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


9

hòa quá trình trao ñổi chất ở sinh vật sống. Ngoài chức năng xúc tác cho phản ứng
thủy phân protein thành amino acid và các peptide có phân tử lượng thấp mà các tế
bào có thể dễ dàng hấp thu, nhất là vai trò trong thủy phân các hợp chất protein xảy
ra ở hệ tiêu hóa của ñộng vật, protease còn có vai trò quyết ñịnh trong thiết lập, duy
trì sự cân bằng giữa tổng hợp và phân giải protein. Bên cạnh ñó chúng còn tham gia
vào quá trình hình thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình ñông tụ máu,
ñiều chỉnh huyết áp, ñiều hòa cấu hình các enzyme và ñiều hòa biểu hiện gen
(Nguyễn Văn Mùi, 2001). Protease rất ña dạng về chức năng ở mức ñộ tế bào, cơ
quan ñến cơ thể nên ñược phân bố rất rộng rãi trên nhiều ñối tượng từ vi sinh vật (vi
khuẩn, nấm và virus) ñến thực vật (ñu ñủ, dứa.v.v.) và ñộng vật (gan, dạ dày
bê.v.v.). Trong cơ thể côn trùng protease trong hệ tiêu hóa của côn trùng có vai trò
trong thủy phân các hợp chất có bản chất là protein trong thức ăn.
Phân loại:
Theo hệ thống phân loại quốc tế (International Union of Biochemistry and
Molecular Biology, 1992), enzyme protease ñược phân thành các lớp như trong
hình 2.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


10

Hình 2. Phân loại protease

Protease ñược phân chia thành hai nhóm lớn là endopeptidase và
exopeptidase dựa vào vào vị trí tác ñộng trên mạch polypeptide. Exopeptidase lại
ñược phân chia thành hai loại: aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở
ñầu N tự do của chuỗi polypeptide ñể giải phóng ra một amino acid, một dipeptide
hoặc một tripeptide; carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu C
của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào ñộng học của cơ chế xúc tác, endopeptidase ñược chia thành bốn
nhóm:
Nhóm thứ nhất: Serine proteinase là những proteinase chứa nhóm –OH của
gốc serine trong trung tâm hoạt ñộng và có vai trò ñặc biệt quan trọng ñối với hoạt
ñộng xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme ñộng vật như chymotrypsin,
trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt ñộng mạnh ở vùng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


11
kiềm tính và thể hiện tính ñặc hiệu cơ chất tương ñối rộng.
Nhóm thứ 2: Cysteine proteinase là các proteinase chứa nhóm –SH trong
trung tâm hoạt ñộng. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như
papayin, bromelin, một vài protein ñộng vật và proteinase ký sinh trùng. Các
cystein proteinase thường hoạt ñộng ở vùng pH trung tính, có tính ñặc hiệu cơ
chất rộng.
Nhóm thứ 3: Aspartic proteinase hầu hết thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin
bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic
proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt ñộng và thường hoạt ñộng
mạnh ở pH trung tính.
Nhóm thứ 4: Metallo proteinase là nhóm proteinase ñược tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Chúng thường ñòi hỏi sự có

mặt của các ion kim loại, ñặc biệt là các kim loại hóa trị hai, như là các cofactor.
Các metallo proteinase thường hoạt ñộng vùng pH trung tính và hoạt ñộ giảm mạnh
dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease ñược phân loại một cách ñơn giản hơn thành ba nhóm căn
cứ vào dải pH tối thích:
- Protease acid: pH 2 - 4.
- Protease trung tính: pH 7 - 8.
- Protease kiềm: pH 9 - 11.
Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác
vì pH hoạt ñộng tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và
nhiều yếu tố khác nữa (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998).
Các nghiên cứu trên thế giới về protease trong cơ thể côn trùng chỉ ra rằng
hầu hết các protease thuộc các loại cystein, metallo, serine. Nghiên cứu của Atsushi
Mochizuki (1998) có thống kê các nhóm phân loại của protease trong một số loài
côn trùng (bảng 1).

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


12
Bảng 1. Các nhóm enzyme protease tiêu hóa trong ruột một số loại côn trùng.

Bộ/loài
5mm
EDTA

1mm
o-
Phe
3mm

PMSF

1mm
TPCK

0,7mm
TLCK
10
µM
Leu

1mM
pHMB

0,1mM
E-64
5mM
DAN

Thuộc
loại
Ephemeroptera
E. trispina
Odonata
A. juncea
Plecoptera
A. stigmatica
Orthoptera
O. yezoensis
Dictyoptera

S. maculata
P. americana
Hemiptera
R. clavatus
E. furcellata
Coleoptera
P. hilaris
Blitopertha sp.
L. oryzophilus
Carabus sp.
Neuroptera
C. carnea
Mecoptera
Panorpa sp.
Diptera
D. antiqua
Trichoptera
S.griseipennis
Lepidoptera
C. suppressalis
Hymenoptera
D. japonicus
P. chinensis

+


+















+



+
+


+

+

+



+


+







+

+
+




+




+

+

+



+

+
+







+




+


+


+

+

+

+



+

+



+
+


+


++

+

+

+

++

++

++

++
+

++

++

++

++

++
++

+
+

++
++

++

++

++

++

++

++

++
+













+

+
+
+

+

+

+

+

+






+
+

+
+
++
+

++

+

++

Cy

Cy

Cy

M+S (C)

S (T)
M+S (T)

M+Cy
Cy

S+Cy
M+Cy
M+Cy
Cy

M+S+Cy

M+S+Cy

M+S+Cy

?

M+S (T)

S (T)
M+S (T)

Ký hiệu: Cy: cystein M: metallo S: serine C: chymoTrypsin T:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


13
Trypsin +: ức chế một phần, ++: ức chế mạnh.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


14
Các hoạt chất ức chế protease
ðể chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh.v.v. một số loại cây trồng có khả
năng tổng hợp các chất chống lại chúng. Một trong các hợp chất là chất ức chế
protease, các chất ức chế này ñược phân loại thành các họ khác nhau dựa trên sự tương
quan về cấu trúc, phương thức tác ñộng và vị trí trung tâm xúc tác của chúng (Barrett,
1986, Grudkowska và Zagdanska, 2004).
Vào năm 1947, lần ñầu tiên các nhà khoa học ñã chứng minh ñược vai trò
bảo vệ thực vật của PPI khi Mickel và Standish quan sát thấy ấu trùng của một số
loài côn trùng không thể phát triển bình thường trong các sản phẩm ñậu tương. Sau
ñó các chất kìm hãm trypsin trong ñậu ñương cho thấy ñộc tính với ấu trùng của bọ
cánh cứng (flour beetle), Tribolium confusum (Haq và cộng sự, 2004). PPI chủ yếu
có trong củ và hạt, tuy nhiên nó cũng xuất hiện các bộ phận khác trên cây (De Leo
và cộng sự, 2002), chúng sinh ra ñể chống lại côn trùng sâu hại và các mầm bệnh
(Ryan, 1990). PPI có khả năng ức chế protease trong ruột côn trùng ngăn cản và
dừng sự sinh trưởng và phát triển của chúng (Lawrence và Koundal, 2002). Hầu hết
PPIs tương tác với các protease mục tiêu của chúng bằng cách tiếp xúc với các vị trí
hoạt ñộng (xúc tác) của protease (ức chế cạnh tranh), dẫn ñến sự hình thành của một
phức chất ổn ñịnh ức chế protease không còn khả năng hoạt ñộng (Dorrah, 2004).
PPI có chứa một ñơn vị duy nhất ñược gọi là chất ức chế ñơn giản, và các
PPI có chứa nhiều ñơn vị ức chế ñược gọi là chất ức chế phức tạp và chúng ñược

chia thành 48 họ thuộc 26 siêu họ khác nhau và không có mối quan hệ trong cấu
trúc phân tử giữa các họ PPI này (Rawlings và Barrett, 1993). Năm 2004, Rawlings
và các cộng sự ñã giới thiệu một bảng phân loại các chất ức chế protease dựa trên
tương tác phát hiện ở cấp ñộ của chuỗi axit amin. Danh sách phân loại này ban ñầu
xác ñịnh ñược 48 họ các chất ức chế và có thể ñược nhóm lại thành 26 siêu họ liên
quan ñến cấu trúc của chúng. Theo cơ sở dữ liệu MEROPS hiện nay có 85 họ của
các chất ức chế. Cùng với các chất ức chế phi protein khác, PPI có thể ñược sử dụng
ñể phân loại protease (bảng 2).


Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các PPI mới vẫn ñang ñược các nhà khoa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


15
học trên thế giới quan tâm.
Bảng 2: Một số chất ức chế protease
Loại chất ức chế
Khối lượng
phân tử (kDa)
Họ enzyme bị
ức chế
Dung môi hòa
tan
Nồng ñộ gây
ức chế
AEBSF-HCl 239.7 Thrombin và một
số serine
Nước pH = 5 – 6 0.1 - 2mm
Amastatin-HCl 511 Metallo Ethanol

0.5 % AcOH
1 - 100 µM
APMSF-HCl
(4-
Amidinophenyl-
methane
sulfonyl-fluoride)
252.7 Trypsin, serine H
2
O
(20 mg/ml).
-20 °C
10-50 µM
Arphamenine A 387.4 Metallo-protease H
2
O, MeOH IC
50
:
0.006 µg/ml
Diprotin A 341.5 Metallo protease H
2
O K
i
:2.2 µM
E-64 357.4 Papain, cysteine
proteases
H
2
O, DMSO
dung dịch nước +

cồn
1 - 10 µM
EDTA-Na
2
372.3 Metallo proteases H
2
O (pH 8) 1 - 10 mM
PMSF
Phenylmethyl
sulfonyl fluoride
174.2 Serine Isopropanol,
ethanol,
methanol. (100 -
200mM) Unstable
in aqueous
solution
0.1 - 1 mM
TLCK
(1-Chloro-3-
tosylamido-7-
amino-2-
heptanone HCl)
369.3 Trypsin 1 mM HCl,
DMSO H
2
O
(20 mg/ml)
Ph 7
10 - 1000 µM
Ức chế Trypsin

(PPI)
ca. 22000 trypsin, factor Xa H
2
O
(1 mg/ml) Nhiệt
ñộ và pH cao
10-100 µg/ml
nguồn
protease.htm)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ………………


16


* Tổng quan về amylase
Vào năm 1814, Kirchoff Saint Petercburg (Nga) ñã chứng minh hạt lúa mạch
nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành ñường ở nhiệt ñộ từ 40°C - 60°C.
Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu ñược kết tủa có
khả năng phân giải tinh bột thành ñường, và ñặt tên là diastase (xuất phát từ tiếng
Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, ñó là amylase). Năm 1851, Leuchs ñã phát
hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành ñường. Sau ñó, các enzyme
amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và ñộng vật, trong hạt nảy
mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt ñầu ñược quan tâm nghiên cứu (Nguyễn
Hữu Chấn, 1983).
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử
polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH => RH + R’-OH

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.
Trong cơ thể côn trùng amylase ñóng vai trò trong việc thủy phân các chất có
trong thức ăn như các hạt tinh bột trong lá cây, các chất ñường, các hạt dự trữ trong
cơ thể.
Phân loại:
Dựa vào thành phần cấu trúc, chức năng, vị trí của enzyme trong cơ thể sinh
vật, enzyme amylase ñược phân loại theo sơ ñồ ở hình 3 (International Union of
Biochemistry and Molecular Biology, 1992):