Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhạn dạng một số nguồn gen hoa lan hoàng thảo (dendrobium) bản địa của việt nam (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM


TRẦN DUY DƢƠNG



NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ
NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM)
BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM


Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng
Mã số : 62.62.01.11


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP




HÀ NỘI - 2015

Luận án được hoành thành tại:
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa
2. TS. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ

Phản biện 1:……………………………………………………
Phản biện 2:………………………………………………………
Phản biện 3:………………………………………………………


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ tại Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Vào lúc:……giờ…….ngày…….tháng… năm…
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng về hình
dáng, màu sắc và kích thước với hơn 1148 loài khác nhau, đứng thứ 2 trong họ
hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch và cs., 2009). Vùng Đông
Nam Á có thể coi là quê hương của chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài,
riêng ở Việt Nam đã có hơn 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân Linh,
2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng được phân bố rộng
rãi trên khắp các vùng miền trong cả nước.
Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực
vật, việc đánh giá quỹ gen là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ
cho việc xác định các giống/loài khác nhau mà còn nhằm tìm hiểu mối quan hệ
về di truyền giữa các giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen. Sự phát triển
mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử đã

tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu
bảo tồn đa dạng sinh học. Ưu thế của các kỹ thuật phân tử là có khả năng xác
định được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị bảo tồn của
loài và quần thể. Chính vì vậy, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (DNA
fingerprinting) của các giống/loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng định
chủ quyền quốc gia về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc
xác định bản quyền đối với giống cây trồng và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về
tên các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam nói chung và lan Hoàng
Thảo nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học và
thực tiễn cao, không chỉ phục vụ cho lợi ích trước mắt mà còn định hướng mục
tiêu lâu dài trong công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ các
chương trình kinh tế trọng điểm đất nước. cơ sở
, chúng tôi đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và
xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium)
bản địa của Việt Nam”.
2. Mục tiêu của luận án
- Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân
tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo
bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới.
- Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng
Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ
liệu cho xây dựng ADN mã vạch.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức
phân tử của các mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo bản địa, là cơ sở để tuyển
chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới;
2
- Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc nhận dạng một số giống/loài
lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam, làm cơ sở cho công tác bảo tồn, lưu giữ các

nguồn gen quý, có giá trị kinh tế và đăng kí trên ngân hàng gen thế giới.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Đề tài góp phần thu thập và lưu giữ các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo
bản địa của Việt Nam;
- góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan
Hoàng Thảo quý hiếm của Việt Nam bảo tồn,
l .
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Là các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các vùng
miền Việt Nam.
4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm được triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện
Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014.
5. Những đóng góp của luận án
Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ
thống về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ
thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm
của Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS. Kết quả của luận án có ý nghĩa
trong việc phân loại, phục vụ cho việc bảo tồn, ,
phong l
.
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về chi lan Hoàng Thảo
1.1.1. Hệ thống phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium)
thuộc họ lan hay họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp
Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida), ngành thực vật hạt kín

Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật
(Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch và cs., 2009; Evans và
cs., 2012).
Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium. sw) ở Việt Nam
thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985). Hệ thống này rõ ràng, không
phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan Hoàng Thảo ở
Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007).
1.1.2. Đặc điểm hình thái
1.1.2.1. Thân
3
Thân của các đại diện chi lan Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình
con suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 2-3cm đến 120cm hoặc
đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20-50cm (Trần Hợp, 1998). Thân có thể
mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên hay có dạng tràng hạt.
1.1.2.2. Rễ
Rễ của các đại diện chi lan Hoàng Thảo là rễ khí sinh, thường mảnh, hình
trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc
buông thõng xuống.
1.1.2.3. Lá
Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân,
ít khi không có bẹ. Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt
thường nhẵn. Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc
ít khi lá hình thoi dài (Averyanov, 2004).
1.1.2.4. Nhóm hoa
Nhóm hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc. Nhóm
hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh
(Trần Hợp, 1998).
1.1.2.5. Hoa
Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên. Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ. Hoa đa số
các loài có hương thơm.

1.1.2.6. Quả
Quả nang thường là hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm
xen lẫn những sợi lông mảnh
1.1.3. Phân bố vùng sinh thái
Ở hơn 100 loài phân bố
chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc, Trung, Nam và ở trên một số đảo ven biển
nước ta (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004).
1.2. Giá trị sử dụng củaa hoa lan Hoàng Thảo
Ngoài ý nghĩa làm cảnh, một số loài Hoàng Thảo cũng là một vị
thuốc dân tộc cổ truyền h và cs., 2004; Cai và cs., 2012; Feng
và cs., 2013).
1.3. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và
xác định maker nhận dạng ở thực vật
1.3.1. Khái niệm về đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong
cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền
được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể.
1.3.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự
nhiên và rất quan trọng đối với con người.
4
1.3.3. Các phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị
nhận dạng ở thực vật
1.3.3.1. Phƣơng pháp dựa vào chỉ thị hình thái
Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền
thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ
thể là thân, lá, hoa.
1.3.3.2. Phƣơng pháp dựa vào các chỉ thị hóa sinh
Các isozyme được định nghĩa như các dạng khác nhau của một
enzyme (protein) có chức năng giống hay gần gũi nhau có ở cùng một cá

thể (Salazar, 2003).
1. 3. 3. 3. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử ADN
Các chỉ thị ADN phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là:
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); Amplified Fragment
Length Polymorphism (AFLP); Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD); Microsatellite hay Simple Sequence Repeates (SSR); Inter-simple
sequence repeats (ISSRs) (Singh và cs., 2012; Shangguo và cs., 2013; Swati
Das và cs., 2014).
1.3.3.4. Các phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình
tự gen
* Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có
chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã.
Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1 – 5.8S – ITS2. Một lợi thế của vùng ITS là nó bao
gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng
5.8S khá bảo ôn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và
ngành (Richardson và cs., 2001; Sharma và cs, 2012).
* Vùng Gen rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) được sử dụng
nhiều để dựng cây phát sinh loài. Tuy nhiên, đối với mối quan hệ di truyền ở
mức dưới loài thì sự phân tích trên gen này gặp nhiều hạn chế (Kress và
Erickson, 2007).
* Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK): Các nghiên cứu sử dụng
trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài như cho thấy gen matK có
tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành
gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật (Asahina và cs., 2010; Sharma
và cs., 2012).
1. 4. Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng
hoa lan trên thế giới
1.4.1.1. Nghiên cứu ở mức độ hình thái
Đối với loài Lan Hoàng Thảo (Dendrobium), có rất nhiều các nghiên

cứu về cây lan Hoàng Thảo như các nghiên cứu của Pellegrino và cs., 2005;
Krishnan và cs., 2011).
5
1.4.1.2. Nghiên cứu ở mức độ phân tử
* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RFLP trên ADN lạp thể
Đối với cây hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất Surin và cs., 2014 đã sử
dụng kĩ thuật RFLP để xác định định dạng 25 giống hoa lan Hoàng Thảo bản
địa của Thái Lan. 23 trong số 25 giống này đã được nhận dạng, chỉ duy nhất có
hai loài là D. crumenatum và D. formosum không xác định được.
* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RAPD
Đã có các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa hình ở lan,
các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào một số loại như lan Kiếm (Cymbidiums),
lan Hài (Paphiopedilum), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), lan Đai Châu
(Rhynchostylis gigantea) và lan Hoàng Thảo (Dendrobium) (
Bateman, 2001;
Choi và cs., 2006;

Goh và cs., 2005; Li và cs., 2007; Parab và cs., 2008; Zha và
cs., 2009; Chattopadhyay và cs., 2012; Paromik và Suman, 2014). Trên cây
hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất, Pritam Chattopadhyay và cs., 2012 đã sử
dụng 5 mồi RAPD để phân tích mối quan hệ di truyền giữa 5 loài lan Hoàng
Thảo tại phía Bắc của Ấn Độ. Kết quả cho thấy, với tổng số 124 băng ADN
được phân tích thì phát hiện có 25 băng cá biệt giữa các giống lan Hoàng Thảo.
* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị SSR
Đối với
. Đối với chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium), chỉ có một vài
nghiên cứu về sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền trong những
năm gần đây như các nghiên cứu của Fan và cs., 2009, Cai và cs., 2012; Liu và
cs., 2014).
* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị ISSR

Với hoa lan Hoàng Thảo, năm 2009 tác giả Wang và cộng sự đã sử dụng 17
chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 31 loài hoa lan Hoàng Thảo được thu
thập ở Trung Quốc. Kết quả cho thấy, trong số tổng 2368 băng được khuếch đại thi
có 278 ISSR locus có độ đa hình là 100%.
* Các nghiên cứu dựa vào trình tự ADN
Công trình đầu tiên trên thế giới sử dụng mã vạch ADN để phân biệt
Dendrobium là công trình của nhóm tác giả Trung Quốc công bố năm 2009 (Yao và
cs., 2009). Trong nghiên cứu này, các tác giả giải mã vùng chen giữa psbA-trnH nằm
trên genome lục lạp của 17 loài Dendrobium. Cũng trên đối tượng Dendrobium,
nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina và cs., 2010) lại sử dụng trình tự gen matK và rbcL
để phân định loài đồng thời nghiên cứu sự phát sinh chủng loài của nhóm
Dendrobium dùng trong y học.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam
Từ năm 1985 đến nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học như
Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Đại học Nông Nghiệp
I, Đại học Lâm Nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau hoa quả đã tập trung
vào nghiên cứu, điều tra, phân loại lưu giữ một số tập đoàn phong lan ở nước ta. Đối
với cây hoa lan Hoàng Thảo, Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cộng sự., 2012 đã nghiên
6
cứu dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D.pulchellum, D.Gatton
Sunray và D.moschatum có mối quan hệ rất gần nhau, mức tương đồng lần lượt là
96,5% và 95%. : “Đánh giá đa
dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium
.
rker nhận
dạng trên đối tượng lan Hoàng Thảo dựa trên giải trình tự các vùng gen ITS, matK,
rbcL
. Mới đây
nhất, Trần Hoàng Dũng và cộng sự 2012 đã ứng dụng công nghệ ADN để phânn loại
và nhận diện lan Hoàng thảo trầm rừng (D.parishii) và Phi điệp (D.anosmum) tại

Việt nam.

CHƢƠNG II
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu phục vụ cho nghiên cứu bao gồm:
- Kế thừa nguồn vật liệu của đã có của Viện Di truyền Nông nghiệp và
GS. TS. Trần Duy Quý, 32 mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo (độ tuổi từ
2-3 năm) được thu thập ở các tỉnh miền của cả nước và được lưu giữ tại vườn
lan thuộc Trung tâm công nghệ cao, Viện Di truyền Nông nghiệp và nhà vườn
số 422, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng
Thảo bản địa của Việt Nam
2.2.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở mức
hình thái
2.2.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở
mức độ phân tử bằng chỉ thị RAPD
2.2.2. Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân để nhận dạng
một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa trong tập đoàn nghiên cứu
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2. 3.1. Phƣơng đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái
- Mô tả hình thái hoa lan theo phương pháp của Pellegrino, 2005 là
phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình
thái bên ngoài.
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền mở mức phân tử bằng chỉ
thị RAPD
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
2.3.2.2. Điện di kiểm tra kết quả tách chiết ADN tổng số
2.3.2.3. Kiểm tra ADN bằng trên gel agarose

2.3.2.4. Kiểm tra ADN bằng máy đo quang phổ
7
2.3.2.5. Phản ứng RAPD
Các loại mồi RAPD thuộc nhóm OPA và OPN do hãng Operon cung cấp;
mồi ITS do Sigma cung cấp.
2.3.3. Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân
2. 3.3.1. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR
Vùng ITS được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1 và ITS4.
2.3.3.2. Giải trình tự sản phẩm PCR
2. 3.3.3. So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank
2. 3.3.5. Xây dựng cây phát sinh loài
2.4. Phần mềm xử lý số liệu
- Số liệu nghiên cứu được phân tích, xử lý dựa trên các phần mềm Excel
version 5.0, phần mềm PCORD, phần mềm NTSYS, MEGA: phiên bản 5.2.1, để
xây dựng cây phát sinh loài.
2. 5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di
truyền Nông nghiệp, thời gian nghiên cứu: 2010-2014.

CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. tập đoàn chi lan Hoàng Thảo
hoa lan nhà
vườn số 422 Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội 3
Thảo C (D2
-
. Các mẫu giống hoa như: D4, D7, D8, D12, D13, D14, D17, D19,
D20, D21, D22, D23, D24 và D25 có dải phân bố rộng từ Bắc đến Nam. Các mẫu
giống hoa còn lại chỉ tìm thấy ở một số địa phương của một vài tỉnh miền Trung hoặc
phía Nam, trong đó có mẫu giống hoa Hoàng thảo Vani (D27), Hoàng Thảo Đại Bạch

hạc (D32) chỉ tìm thấy ở Kontum.
3.1.1. Kết quả đánh giá đa dạng si truyền bằng chỉ thị hình thái
Thân của các đại diện chi Hoàng thảo đều phân đốt, có nhiều hình dạng
như: hình con suốt, hình chùy, hình vuông, hình tràng hạt, thuôn tròn, và phổ
biến nhất là hình trụ. Thân cũng có nhiều dạng khác nhau như, thân mảnh thân
bám, thân phình to mập, thân dài, thân ngắn phình to, nhưng đa số là thân dài,
buông thõng xuống. Cá biệt có loài chỉ có các mấu dày lên, còn lóng thì hầu như
không có, làm thân có dạng tràng hạt (D2) hoặc sự dày lên là dần dần độc lập ở
mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D28). Đây là dấu hiệu đặc trưng để nhận
dạng hoa lan Hoàng Thảo Điện Biên (D2) là loài đặc hữu của Điện Biên.
8
Bảng 3.1. Các
Ký
hiệu
Tên tiếng Việt
Tên Latin
Xuất xứ
Ký
hiệu
Tên tiếng Việt
Tên Latin
Xuất xứ
D1
Hoàng Thảo Long nhãn Lai
Châu
D. fimbriatum
Lai Châu
D17
Hoàng Thảo Kim Điệp
D. capillipes

Lâm Đồng
D2
Hoàng Thảo Chuỗi ngọc
Điện Biên
D. findlayanum
Điện Biên
D18
Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc
D. findlayanum
Kontum
D3
Hoàng Thảo Thái Bình
D. moschatum
Thái Bình
D19
Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng
Nai
D. farmeri
Đồng Nai
D4
Hoàng Thảo Phi Điệp tím
D. anosmum
Hòa Bình
D20
Hoàng Thảo Tiểu hoàng lạp
D. chrysotoxum
Kontum
D5
Hoàng Thảo Trầm tím
D.parishii

Sơn La
D21
Hoàng Thảo Đại hoàng lạp
D. chrysotoxum
Lâm Đồng
D6
Hoàng Thảo trầm trắng
D.parishii.var
alba
Điện Biên
D22
Hoàng Thảo bạch hạc
langbiang
D. wattii
Lâm Đồng
D7
Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng
D. chrysanthum
Yên Bái
D23
Hoàng Thảo Hạc vĩ
D. aphylum
Đà Lạt

Hoàng Thảo Phi điệp vàng
D. chrysanthum
Điện Biên
D24
Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ
D.lindleyi

QuảngTrị
D9
Hoàng Thảo Long tu Bắc
D. primulinum
Sơn La
D25
Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung
D. lindleyi
Lâm Đồng
D10
Hoàng Thảo Trúc
D. hancockii
Ninh Bình
D26
Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà
D. haveyanum
Lâm Đồng

D11
Hoàng Thảo Xoắn
D. tortile
Ninh Bình
D27
Hoàng Thảo Vani

D. aduncum
Kon Tum
D12
Hoàng Thảo
D. amabile

D28
Hoàng Thảo Đùi gà
D. nobile
Đà Lạt
D13
Hoàng Thảo Kiều vàng
D. thyrsiflorum
Tuyên Quang
D29
Hoàng Thảo Long tu đá
D. primulinum
Tây Nguyên
D14
Hoàng Thảo Kiều trắng
D. farmeri
Tuyên Quang
D30
Hoàng Thảo Môi tơ
D. delacourii
Guill
Tây Nguyên
D15
Hoàng Thảo Tam Đảo
D. daoense
Tam Đảo
D31
Hoàng Thảo Nhất Điểm Hồng
D. draconis
Rchb.f

Lâm Đồng
D16
Hoàng Thảo Hoàng lạp Tây
Bắc
D. chrysotoxum

D32
Hoàng Thảo Đại bạch hạc
D. christyanum
Kontum
Ghi chú: D. Dendrobium


9
Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân. Lá
phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2-6 chiếc ở đỉnh thân cũng
có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà không có lá. Lá thường tồn tại khi cây ra hoa.
Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều (D15 trung bình 35,9 lá/cây; D23 trung bình 31,7
lá/cây) đến rất ít (D22 trung bình 6,46 lá/cây). Lá có thể cứng hoặc mềm, bề mặt
thường nhẵn. Đa số lá của lan Hoàng Thảo trong 32 mẫu giống nghiên cứu có lá
dạng hình lưỡi mác, mộit vàu lá hình bầu dục, đỉnh lá nhọn, nhọn lệch hoặc tù.
Nhóm hoa có thể có nhiều hoa, hoặc có ít hoa. Nhóm hoa dài thường rủ thõng
xuống, hoặc mọc so le (Hình 3.4). Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có sự khác
biệt rõ rệt với nhau về kích thước, số lượng, cách sắp xếp và màu sắc, hình dạng lá
đài, cánh hoa, cánh môi. Hoa thường không quá lớn, đường kính dao động trong
khoảng 1,35-5,8cm. Cánh môi của các mẫu giống nghiên cứu có nhiều màu sắc khác
nhau như màu vàng sẫm hay vàng nhạt, màu trắng có đốm vàng hoặc cam ở giữa,
hay màu trắng họng đen (D3) hoặc màu tím (D4), màu vàng họng đen (D1), màu tím
nhạt họng vàng vv Hình dạng cánh môi thường gặp là hình tròn, hình gần tròn
hình rô, hình phễu, hình tim, hình bầu dục, hình trứng hay hình cằm (D32). Từ các

kết quả về số liệu hình thái như thân, lá, hoa của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo, chúng
tôi sử dụng phần mềm Pcord 4.0 để xây dựng sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền
giữa các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo (Hình 3.6).


Hình 3.4. Một số kiểu hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
Xét ở mức độ tương đồng 37%, 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo chia làm 5
nhóm chính:
Nhóm I: Bao gồm 8 mẫu giống là các mẫu D1, D3, D4, D5, D6, D10, D11,
D15 ở mức độ tương đồng từ 55-100% và chia làm hai nhóm phụ:
+ Nhóm phụ thứ 1 bao gồm 6 mẫu giống là các mẫu D1, D3, D4, D5, D6 và
D11 trong đó 3 giống D4, D5 và D6 được xếp vào một nhóm là các mẫu HT Phi
điệp tím (D4), Hoàng thảo trầm tím (D5) và Trầm trắng (D6) có hệ số tương đồng di
truyền từ 95 đến 100% trong đó mẫu D5 và D6 có hệ số tương đồng di truyền 100%.
+ Nhóm phụ thứ 2 gồm 2 mẫu giống D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D15 (Hoàng
Thảo Tam Đảo)

10

Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 32 mẫu giống
hoa lan Hoàng Thảo dựa trên chỉ thị hình thái
Nhóm II: gồm 15 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo khác nhau có hệ số tương
đồng di truyền từ 37-100% bao gồm các mẫu giống D2, D7, D9, D12, D13, D14,
D17, D18, D19, D22, D23, D26, D27, D29, D30 ở mức độ tương đồng di truyền từ
37-100%. Ở mức độ tương đồng di truyền 43% các mẫu này lại chia thành hai nhóm
phụ khác nhau bao gồm:
Nhóm phụ II.1: Bao gồm 8 mẫu giống là các mẫu D2, D9, D17, D18, D23,
D27, D29 và D30 trong đó hai mẫu D2 và D18 có hệ số tương đồng di truyền là
100%.
Nhóm phụ II.2: Bao gồm các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo gồm D7, D12,

D13, D14, D17, D19 và D26 ở mức độ tương đồng di truyền 68%. Nhóm phụ thứ
II.2 chia thành hai nhóm nhỏ hơn trong đó D7 và D17 vào một nhóm còn lại là 5
mẫu giống D12, D13, D14, D19, và D26 tạo thành một nhóm. Đây là các giống hoa
lan Hoàng Thảo Kiều của miền Bắc hay gọi là Thủy Tiên theo cách gọi của người
miền Nam. Các mẫu giống hoa trong nhóm này về đặc điểm hình thái như thân, lá,
hình dạng hoa khá giống nhau, chỉ khác nhau về màu hoa Nhóm này bao gồm các
loài mang đặc điểm là có hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi. Tuy vậy
sự khác biệt lớn ở đây là thân có hình con suốt, lá tập trung ở đỉnh, cụm hoa thường
nhiều hoa (Clements, 2003; Dương Đức Huyến, 2007).
Nhóm III: Bao gồm 4 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là D8, D28, D31và
D32. Trong số 4 mẫu giống này thì hai mẫu giống D31 và D32 rất dễ nhầm khi
chúng có đặc điểm hình thái như thân, lá, rễ, hoa tương đối giống nhau. Hai mẫu
giống này chỉ khác nhau về đặc điểm hình dạng cánh môi, mẫu giống D31 có hình
dạng hình mác, còn mẫu giống D32 có dạng hình cằm.
Nhóm IV: Bao gồm 3 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là các mẫu giống D16,
D20 và D21. Trong số 3 mẫu giống này thì hai mẫu giống D20 và D21 được phân bố ở
hai tỉnh Đồng Nai và Lâm Đồng. Về mặt hình thái chúng có màu hoa giống nhau hơn
nữa hình thái như thân, lá, rễ cũng như nhau, chỉ khác nhau về kích thước lá.
I
II
III
IV
V

11
Nhóm V: gồm hai mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là Hoàng Thảo vảy rồng lá
nhỏ (D24) và Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung (D25). Đây là hai mẫu giống phân bố ở
khắp ba miền Bắc, Trung và Nam có đặc điểm hình thái như nhau và chỉ khác nhau
về kích cỡ lá. Có thể nhận thấy rằng hai giống này là một loài và chỉ khác nhau ở
vùng phân bố nên khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng có ít sai khác đặc

biệt là lá.
Sự phân loại chi Dendrobium từ trước đến nay một trong những vấn đề phức
tạp trong họ Orchidaceae do sự đa dạng về hình thái, phạm vi phân bố rộng, số
lượng các loài lớn, và do sự biến đổi hình thái chồng chéo giữa các loài. Cho tới
nay, đại đa số các nhà phân loại đều chia chi lan Hoàng Thảo thành các nhóm
(section). Một vài tác giả đã chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân
chi (subgenra)(Dressler, 1993; Kumar và cs., 2011; Schuiteman, 2011). Chính vì
vậy, trong nghiên cứu này, việc sử dụng chỉ thị hình thái để đánh giá đa dạng di
truyền chỉ được tương đối chính
. Tuy nhiên,
trong việc phân loại các loài thuộc chi lan Hoàng Thảo của Việt
Nam ở mức hình thái
và bằng chỉ thị RAPD.
3.1.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử
3.1.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

.
3.1.2.2. mẫu
Kết quả thực hiện
ổng số 408 loại
4,5 2. Với 20 mồi ngẫu
nhiên, mồi OPN9 có tổng số băng nhân lên được nhiều nhất (254 băng), mồi OPN7
có tổng số băng nhân lên thấp nhất (84 băng). Dưới đây là một số mồi RAPD điển
hình (Hình 3.11).
Trong tổng số 20 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu có 26 loại băng cá
biệt hoặc băng khuyết xuất hiện. Mồi OPN7 cho năm loại băng khác nhau. Còn lại là
các mồi OPN1, OPN2, OPN3, OPN6, OPN8, OPN11, OPN12, OPN13, OPN16,
OPN19, OPN20, OPA3 và OPA6 xuất hiện 1-2 băng cá biệt/hoặc băng khuyết. V
mẫu
.

* 1

12

Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng
Thảo với mồi OPN11; Giếng 1-32: Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa
(D1-D32); M: 1kb ladder
3.1.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
quan hệ
hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ cây của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
3.13). Xét ở mức độ tương đồng di truyền 32%, 32
.

Hình 3.13.
dựa trên chỉ thị phân tử RAPD
:
34- 100%.
Nhóm phụ thứ nhất (I.1) gồm 6 mẫu giống bao gồm các giống D1 (Hoàng Thảo
Long Nhãn Lai Châu), D3 (Hoàng Thảo Thái Bình), D11 (Hoàng Thảo Xoắn), D15
(Hoàng Thảo Tam Đảo), D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D30 (Hoàng Thảo Môi tơ) có hệ số
tương đồng di truyền từ 50-80%.
Nhóm phụ thứ 2 (I.2) bao gồm 5 mẫu giống là các giống D4, D5, D6, D7 và D17.
Trong nhóm này, 3 giống D4 (Hoàng Thảo Phi điệp tím), D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và
D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng) có hệ số tương đồng di truyền là rất cao từ 80-100%.
(Hình 3.14). Trong 3 mẫu giống trên thì hai mẫu giống D5 và D6 có hệ số tương đồng là
100%. Đây là hai giống Hoàng Thảo trầm được thu thập ở hai vùng Sơn La và Điện

13
Biên có đặc điểm hình thái như thân, lá, kiểu hoa giống nhau nhưng khác về màu sắc
hoa. Kết quả này tương tự như tác giả Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 khi nghiên cứu tập

đoàn lan Hoàng Thảo bản địa với hai loài Trầm rừng (Dendrobium parishii) và Phi điệp
(Dendrobium anosmum) tại Việt Nam (Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 ).
Nhóm phụ thứ ba (I.3) hai mẫu giống D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D15 (Hoàng
Thảo Tam Đảo) với hệ số tương quan di truyền là 53%. Hai giống hoa này được thu thập
ở miền Bắc là Ninh Bình và Tam Đảo, chúng khác nhau hoàn toàn về thân, lá và hoa.

Hình 3.14. Giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5 (Trầm tím), D6 (Trầm trắng)
Nhóm II: Gồm 8 mẫu giống là D9, D12, D13, D14, D29, D19, D26 và D27 được
chia thành hai nhóm phụ khác nhau ở mức độ tương đồng di truyền 47%.
Nhóm phụ thứ nhất (II. 1) gồm bốn mẫu giống là D9, D29, D27 và D26 có hệ số
tương đồng dao động từ 51-75 % trong đó có hai giống D9 (Hoàng Thảo Long tu Bắc)
và D29 (Hoàng Thảo Long tu đá) có hệ số tương đồng cao nhất là 75%.
Nhóm phụ thứ hai (II. 2) gồm 4 mẫu giống D12, D13, D14 và D19 có hệ số tương
đồng di truyền từ 65-80%. Các giống Kiều về đặc điểm thân lá gần giống nhau, hoa đều
dạng trùm nhưng chỉ khác nhau về màu hoa. Trong 4 giống Kiều trên thì có hai giống
D13 (Hoàng Thảo Kiều vàng) và D14 (Hoàng Thảo Kiều trắng) có hệ số tương đồng cao
nhất là 80%.
Nhóm III: gồm 2 mẫu giống là D23 (Hoàng Thảo Hạc vĩ) và D28 (Hoàng Thảo
đùi gà) ở mức độ tương đồng di truyền là 50%.
Nhóm IV: gồm 6 giống là các giống D16, D20, D21, D22, D31và D32 và chia ra
làm hai nhóm phụ với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 33-50%.
Nhóm phụ thứ nhất (IV.1) gồm hai mẫu giống D31 và D32 với hệ số tương quan
di truyền là 50%; Nhóm phụ thứ hai (IV.2) gồm các giống D16, D20, D21 và D22
với hệ số tương quan di truyền dao động từ 50-75%. Trong đó, giống D20 và D21 có
hệ số tương quan di truyền cao nhất là 75%.
Nhóm V: gồm ba giống D8, D24, và D25 có hệ số tương đồng di truyền tương
đối cao trong số các nhóm dao động từ 50-100%. Trong nhóm này, hai giống D24
(Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung)
đồng d 100%.

14
3.1.3. Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di
truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo
32 mẫu . Qua kết quả so sánh
giữa sơ đồ hình cây bằng chỉ thị hình thái và sơ đồ hình cây bằng chỉ thị RAPD cho
thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5 nhóm khác nhau. Các
mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di truyền đều xếp chung
vào một nhóm. Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống có hệ số di truyền như
nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm
trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo vảy rồng lá trung).
Bên cạnh đó các mẫu giống khác như D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và
D18 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc); hoặc các giống lan Hoàng Thảo Kiều có hệ số
tương đồng khá cao từ 65-80%.
Tóm lại, việc nghiên cứu, đánh giá và so sánh đa dạng di truyền của tập đoàn
giống Hoa lan Hoàng Thảo là công việc rất cần thiết nhằm tạo nên cơ sở dữ liệu cho
các phương pháp bảo tồn, phát triển sử dụng bền vững nguồn tài nguyên di truyền,
và đồng thời có ý nghĩa chiến lược trong chương trình cải thiện giống. Việc kết hợp
giữa phương pháp
. Tuy nhiên, việc
sử dụng chỉ thị RAPD trong việc phân loại loài/dưới loài còn nhiều hạn chế, chính vì
vậy để xác định giữa các loài, dưới loài cần phải kết hợp giải trình tự ADN lục lạp
như vùng ITS, hoặc giải trình tự gen matK, gen rbcL (Richardson và cs., 2001;
Sharma và cs, 2012, Liu và cs., 2014).
3.2. Kết quả nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên trình tự
vùng ITS
3.2.1. Kết quả khuếch đại vùng ITS bằng PCR
Với cặp mồi ITS1 và ITS4, chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn ITS bằng
PCR. Kết quả sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt với một băng rõ duy nhất
cho mỗi giống lan Hoàng Thảo trên gel agarose 1% sau khi điện di (Hình 3.17). Các

băng nằm ở vị trí khoảng 700-800 bp. Như vậy, kích thước vùng gen ITS được
khuếch đại là phù hợp. Kết quả này cũng khá phù hợp với các kết quả nghiên cứu
của các tác giả khác khi khuếch đại vùng ITS trên cây lan Hoàng Thảo (Chiang và
Tsong, 2012; Trần Hoàng Dũng và cs., 2012; Liu và cs., 2014). Các băng sản phẩm
rõ, đúng kích thước nên có thể sử dụng giải trình tự.
Sản phẩm đoạn ITS sau khi khuếch đại bằng PCR sẽ được tinh sạch và bằng
phương pháp Qiagen Kit.


15

Hình 3.17. Ảnh điện di đoạn ITS của quả 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng
Thảo đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4
Giếng 1-32: Các giống hoa lan Hoàng Thảo; M: 100bp ladder
3.2.2. Kết quả phân tích trình tự các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên
trình tự vùng ITS
3.3.2.1. Kết quả giải trình tự vùng ITS của 32 mẫu lan Hoàng Thảo
Qua kết quả giải trình tự cho thấy, 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đã được
khuếch đại và giải trình tự vùng ITS bao gồm một phần vùng 18S, toàn bộ vùng
ITS1, 5.8S, ITS2 và một phần vùng 26S, tổng chiều dài thu được từ 652 đến 715
nucleotide, trung bình là 685,3 nucleotide. Tỉ lệ % trung bình của T(U)= 22,4%; C =
24,3%; A = 23,7 %; và G =29,6%. Kết quả này cũng khá cũng khá phù hợp với nhận
định của Xu và cs., 2005; Sigh và cs., 2012; Liu và cs., 2014.
3.3.2.2. Kết quả so sánh trình tự đoạn ITS một số mẫu hoa lan Hoàng Thảo bản
địa Việt Nam và thế giới
Để so sánh sự khác biệt các trình tự của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo
của Việt nam và thế giới, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự của các mẫu lan
Hoàng Thảo của Việt nam và thế giới dựa trên sự phân tích sắp cột thẳng hàng. Dưới
đây là một số kết quả so sánh trình tự vùng ITS của một số mẫu hoa lan Hoàng Thảo
của Việt Nam và thế giới.

* Kết quả so sánh trình tự mẫu D2 (Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc Điện Biên) và D18
(Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc)
Qua kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự ITS của mẫu
D2, D18 của Việt Nam và hai mẫu D. findlayanum |KF143462.1|, |HQ114257.1| của
thế giới cho thấy ở bảng thống kê số nucleotid của 4 trình tự ITS của loài
D.findlayanum có sự giao động số nucleotid của các trình tự từ 688- 694 nucleotid
Với kết quả so sánh trình tự các mẫu D.findlayanum cho thấy trình hai mẫu D2 và
D18 có khoang 19 sự khác biệt. Khi so sánh hai mẫu D2 và D18 với hai mẫu tham
chiếu D.findlayanum thì mẫu D2 và D18 có khoảng 8 sự khác biệt trình tự so với hai
mẫu D. findlayanum của thế giới (Hình 3.19). Kết quả này cho thấy các mẫu lan
Hoàng Thảo D2 và D18 của Việt Nam không có sự khác biệt mấy so với các mẫu
D.findlayanum của thế giới.

16

Hình 3.19. Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng
ITS của mẫu giống D2, D18 và hai mẫu giống D.findlayanum |KF143462.1|,
|HQ114257.1|
Tương tự như vậy các mẫu lan Hoàng Thảo khác cũng được phân tích sắp cột
thẳng hàng (alignments) với các mẫu lan Hoàng Thảo của thế giới để xác định sự sai
khác về trình tự cũng như nhận dạng loài/dưới loài dựa trên trình tự vùng ITS. Tuy
nhiên việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên GenBank nhằm mục đích cho một kết quả
so sánh với nhóm loài tương đồng nhất với trình tự tham chiếu. Kết quả BLAST
không thể kết luận chính xác về loài. Với những trường hợp BLAST có độ bao phủ
và tương đồng cao (99%) cũng không thể suy ngược lại tên loài. Bởi kết quả
BLAST chỉ hiển thị trình tự tương đồng nhất mà trên GenBank hiện có. Do vậy, để
có thể xác định đúng tên loài cần phải thực hiện thêm nhiều các phân tích khác như
so sánh với dữ liệu hình thái và xác định mối liên hệ qua cây phát sinh loài dựa trên
trình tự vùng ITS. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định tiến hành xây dựng cây phát
sinh chủng loài Dendrobium để xác định chính xác tên của các mẫu vật trong nghiên

cứu này.
3.2.3. Kết quả phân định loài dựa trên cây phát sinh loài
Qua hình 3.25 cho thấy, cây phát sinh loài chia 32 mẫu giống lan Hoàng Thảo làm
XVII nhóm khác nhau:
Nhóm thứ I: gồm 3 trình tự mẫu giống của Việt Nam là D4 (D. anosmum),
D5 (D. parishi.var alba) và D6 (D.parishi) với 6 trình tự gồm HM590378.1,
HM054736.1, HM054735.1, AB5936930.1 thuộc loài D.parishi và 2 trình tự
EU477499.1, JN388570.1 thuộc loài D.asosmum. Ở vị trí phân kỳ sớm, mẫu giống
D6 được nhận dạng về hình thái là D.parishi nhưng nằm gần mẫu giống EU47749.1
được nhận dạng là D.anosmum trong khi đó ở trên 4 mẫu giống HM590378.1.
HM054736.1, HM054735.1, AB5936930.1 thuộc loài D. parishi nằm cùng với
nhau. Điều này có thể khẳng định rằng mẫu giống EU47749.1 phải là D. parishi chứ
không phải D. anosmum, từ đó ta suy ra mẫu giống D6 thuộc loài D.parishi. Ở vị trí
phân kỳ trễ, mẫu giống D4, D5 và mẫu giống JN388570.1 nằm chung một nhóm.
Xét về hình thái, mẫu giống D4 được nhận dạng là D.anosmum còn mẫu giống D5
được nhận dạng là D. parishi.var alba. Tuy nhiên hai mẫu giống này lại nằm chung

17
với mẫu giống JN388570.1 trùng khớp đến 99%. Do vậy kết luận mẫu giống D5
chính là D. anosmum.var alba chứ không thể là D.parishii.arlba. Kết quả này cũng
trùng khớp với nghiên cứu của Trần Hoàng Dũng và cs., 2012 khi nghiên cứu phân
tích hai loài lan của Việt nam là Hoàng Thảo trầm rừng (D. parishi) và Hoàng Thảo
Phi điệp (D. anosmum)(Trần Hoàng Dũng và cs., 2012).
Nhóm thứ II bao gồm D9 và D29 với 3 trình tự thuộc loài D.primulinum là
KF14399.1, AB593641.1 và AB59352.1. Hai mẫu D9 và D29 nằm chung cùng với
mẫu AB59352.1 với chỉ số boostrap lên tới 99%. Đây là hai mẫu Long tu được được
phân bố ở hai vùng phía Bắc và Tây Nguyên. Về hình thái, chúng có đặc điểm tương
đối giống nhau và được nhận dạng thuộc loài D.primulinum. Do vậy hai mẫu D9 và
D29 được nhận dạng chính xác thuộc loài D.primulinum.
Nhóm thứ III là mẫu giống D23 được nhận dạng về hình thái là D. aphylum

nằm cùng chung nhóm với 4 trình tự là HM590384.1, HQ114247.1, HQ114248.1 và
KF143430.1 trùng khớp với nhau đến 100%. Vậy kết luận rằng mẫu D23 thu thập
chính xác và là lan Hoàng Thảo Hạc vĩ (D. aphylum).
Nhóm thứ IV: bao gồm 2 giống D11 và D28 nằm chung một nhóm với 6
trình tự so sánh. Trong nhóm này, mẫu D11 (D.tortile) phân chia nằm chung với 4
trình tự khác là EU4775071(D.nobile), EU477507.1(D.fiedricksianum),
,KF143518.1(D.sp.Jin XHs.n.9) và EU477511.1 (D.tortile) với chỉ số bootstrap lên
tới 98%. Xét về hình thái, D11 khác hoàn toàn về hình thái như thân, lá, hoa so với
mẫu EU477507.1 (D. fiedricksianum), KF143518.1(D. sp.Jin XHs.n.9). Ngay từ kết
quả so sánh trên Balst, những mẫu này cũng nằm lộn xộn không tập trung. Chính vì
vậy mà không thể nhận dạng được mẫu giống D11 có đúng là D.tortile hay không.
Tuy nhiên, mẫu giống D28 nằm chung cùng với hai trình tự thuộc D.nobile là
KC205193.1 và JN38579.1 với chỉ số bootstrap là 85%. Do vậy mẫu giống D28
được nhận dạng chính xác là D. nobile.
Nhóm V: gồm các mẫu giống D27, D2 và D18 chia thành 2 nhóm phụ:
- Nhóm phụ thứ 1 bao gồm mẫu D27 (D.aduncum) chia thành một nhóm nằm
chung với 3 trình tự khác thuộc loài D.aduncum gồm các trình tự JF713083.1,
KF143428.1 và JN388580.1 với chỉ số bootstrap trong nhóm là 99%. Đặc điểm về
hình thái, mẫu D27 giống với 3 mẫu còn loại thuộc loài D.aduncum nên có thể
khẳng định chính xác đây là loài D.aduncum.
Nhóm phụ thứ 2 gồm 2 mẫu D2 và D18, đây là hai mẫu Long tu (D.
findlayamum) được thu thập từ hai miền khác nhau. Xét về hình thái chúng giống
nhau y hệt về thân, lá, hoa chỉ khác ở chỗ Long tu Bắc (D2) ở giữa môi hoa không
có đốm. Khi so sánh trình tự của chúng thì chúng có chỉ số bootstrap là 100% so với
trình tự của 3 mẫu KF143246.1, HQ114257.1 và JN388589.1 đều thuộc loài
D.findlayamum nên khẳng định hai mẫu D2 và D18 thuộc loài D. findlayamum.

18

0.02
D. parishii voucher NCHU-D89331201-1012|HM590378.1|
D. parishii|AB593630.1|
D. parishii voucher SBB-0528 |HM054736.1|
D. parishii voucher SBB-0527 HM054735.1|
D. anosmum |EU477499.1|
D. parishi - D6
D.parishi.var alba - D5
D. anosmum - D4
D. anosmum isolate D4 |JN388570.1|
D. primulinum voucher Jin X-H 10793 |KF143499.1|
D. primulinum |AB593641.1|
D. primulinum TBG 118293|AB593521.1|
D. primulinum -D9
D. primulinum - D29
D. aphyllum voucher NCHU-D89331201-1018 HM590384.1|
D. aphyllum voucher PS2523MT01 |HQ114247.1|
D. aphyllum voucher PS2523MT02 |HQ114248.1|

D.aphyllum -D23
D. aphyllum voucher Jin X-H 10798 |KF143430.1|
D. tortile - D11
D. nobile |EU477507.1|
D. friedricksianum |EU477505.1|
D. sp. Jin X-H s.n. 9 |KF143518.1|
D. tortile |EU477511.1|
D. nobile |KC205193.1|
D. nobile - D28
D. nobile |JN388579.1|
D. aduncum - D27
D. aduncum voucher SBB-0309 |JF713083.1|
D. aduncum voucher Jin X-H 9522 |KF143428.1|
D. aduncum |JN388580.1|
D. findlayanum -D2
D. findlayanum - D18
D. findlayanum voucher Jin X-H 11875|KF143462.1|
D. findlayanum voucher PS2531MT01 |HQ114257.1|
D. findlayanum isolate D23 |JN388589.1|
D. chysanthum - D7
D. chrysanthum |JN388584.1|
D. chrysanthum |FJ384738.1|
D. chysanthum- D8
D. chrysanthum voucher Jin X-H 11430 |KF143443.1|
D. chrysanthum voucher SBB-0617 |JF713093.1|
D. chrysanthum voucher SBB-0504 |JF713091.1|
D. brymerianum - D30
D. brymerianum voucher PS2510MT01|HQ114233.1|
D. brymerianum voucher Jin X-H10782 |KF143432.1|
D. brymerianum |JN388581.1|

D. brymerianum |EU477500.1|
D. pulchellum voucher Jin X-H 11878 |KF143503.1|
D. moschatum -D3
D. moschatum voucher Jin X-H 11886 |KF143492.1|
D. daoense - D15
D. fimbriatum isolate D22 |JN388588.1|
D. fimbriatum - D1
D. fimbriatum voucher PS2507MT01 |HQ114229.1|
D. fimbriatum voucher Jin X-H s.n. 16 (KF143461.1)
D. chrysotoxum - D20
D. chrysotoxum - D21
D. chrysotoxum |EU477501.1|
D. capillipes voucher NCHU-D89331201 |HM590379.1|
D. chrysotoxum voucher PS2501MT03 |HQ114223.1|
D. chrysotoxum -D16
D. chrysotoxum voucher PS2501MT01 |HQ114221.1|
D. chrysotoxum isolate D19 |JN388585.1|
D. hancockii voucher Jin X-H 13492 |KF143467.1|
D. hancockii isolate D25 |JN388591.1|
D. hancockii voucher PS2533MT01 |HQ114259.1|
D. hancockii |AB593575.1|
D. hancockii - D10
D. capillipes - D17
D. capillipes |AF362035.1|
D. capillipes voucher Jin X-H 10757 |KF143433.1|
D. capillipes voucher PS2502MT01 |HQ114224.1|
D. capillipes |JN388582.1|
D. amabile - D12
D. thyrsiflorum - D13
D. farmeri -D14

D. farmeri -D19
D. haveyanum -D26
D. thyrsiflorum |KC205200.1|
D. thyrsiflorum voucher Jin X-H 10755 |KF143519.1|
D. lindleyi - D24
D. lindleyi -D25
D. jenkinsii voucher Jin X-H 10709 |KF143478.1|
D. jenkinsii voucher PS2525MT01 |HQ114251.1|
D. jenkinsii voucher Jin X-H s.n. 4 |KF143479.1|
D. jenkinsii isolate D29 |JN388595.1|
D. draconis Rchb.f - D31
D. draconis |HM054628.1|
D. draconis voucher SBB-0545 |JF713101.1|
D. draconis |EU477503.1|
D. wattii - D22
D. wattii voucher Jin X-H 11817 |KF143525.1|
D. longicornu voucher Kurzweil H Lwin S 2647 |KF143484.1|
D. longicornu voucher Jin X-H 11663 |KF143485.1|
D. christyanum -D32
D. christyanum voucher Jin X-H s.n. 3 |KF143442.1|
D. christyanum voucher Jin X-H 11045 |KF143441.1|
D. christyanum |GU339106.1|
D. christyanum |EF629325.1|
88
100
91
99
96
100
100

100
86
100
95
74
99
97
75
100
100
99
75
62
96
98
59
85
77
100
99
100

88
100
100
77
76
73
74
99

98
90
100
99
100
90
99
68
70
64
76
56
70
79
87
97
99
99
99
82
79
71
90
64
75
80
Hình 3.25. Sơ đồ cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng ITS

19
Nhóm VI: gồm 2 mẫu D7 và D8, đây là hai giống thuộc loài D.chrysanthum

nằm chung với 6 trình tự của loài D.chrysanthum đối chứng. Trong hai mẫu này, D8
trùng khớp 100% với 2 mẫu D.chrysanthum khác là JN388584.1 và FJ384738.1.
Còn mẫu D8 tuy nằm cùng nhóm nhưng khoảng cách di truyền khá xa so với D7 và
các mẫu còn lại. Tuy nhiên, trình ITS của chúng đều thuộc loài D.chrysanthum. Vì
vậy kết luận rằng hai mẫu D7 và D8 thuộc loài D.chrysanthum.
Nhóm thứ VII: gồm trình tự của mẫu D30 (Hoàng Thảo Môi tơ -
D.brymerianum) nằm chung với trình tự của các mẫu gồm 4 mẫu thuộc loài
D.brymerianum: KF143432.1, HQ114233.1, JN388581.1 và EU477500.1 với chỉ số
bootstrap là 80%. Mẫu D30 của Việt Nam tuy nằm chung một nhóm với 4 mẫu còn
lại nhưng khoảng cách di truyền khá lớn với các mẫu của thế giới.
Nhóm thứ VIII gồm trình tự mẫu D3 (Hoàng Thảo Thái Bình -
D.moschatum) được xác định chính xác thuộc loài D. moschatum (KF143492.1) với
chỉ số bootstrap là 100%. Tuy nhiên trong nhóm này còn có 1 mẫu là D.puchellum
(KF1435031.1) cùng với tỷ lệ giống D.moschatum (KF143492.1). Xét về hình thái
chúng giống hệt nhau về thân, lá, hoa. Tuy nhiên mẫu (KF1435031.1) lại được xác
định là D.puchellum. Điều này có thể giải thích rằng có sự sai xót khi xác định tên
latinh của mẫu (KF1435031.1). Xét về hình thái, mẫu D3 được nhận dạng là
D.moschatum, qua đó khẳng định rằng mẫu D3 đúng là D.moschatum sau khi giải
trình tự vùng ITS.
Nhóm IX gồm trình tự 2 mẫu D1 (HT Long nhãn Điện Biên) và D15 (Hoàng
Thảo Tam Đảo) và 3 trình tự mẫu của thế giới thuộc loài (D. fimbriatum). Trong
nhóm này, mẫu D1 (D. fimbriatum) và D15 (D.daoense) có chỉ số bootstrap từ 86-
100 % với 3 mẫu thuộc loài D. fimbriatum là các mẫu HQ114229.1, JN388588.1,
KF143461.1. Tuy nhiên mẫu D15 tuy có chỉ số bootstrap như vậy nhưng về nhận
dạng qua hình thái dịnh danh tên lại là D.daoense. Chính vì vậy mà có thể khẳng
định rằng mẫu D15 qua quá trình thu thập mẫu bị lẫn tạp, mẫu D15 phải là loài D.
fimbriatum chứ không phải D.daoense.
Nhóm X gồm trình tự 3 mẫu giống của Việt Nam là D16, D20, D21 và 5 mẫu
trình tự của thế giới trong đó 4 mẫu đều thuộc loài Dendrobum chynsotoxum là các
mẫu HQ114221.1, JN388585.1, HQ114223.1, EU477501.1 và 1 mẫu thuộc loài

D.cappillies (HM590379.1). Ở trong 5 mẫu của thế giới này có thể khẳng định mẫu
HM590379.1 giải trình tự sai vì nếu mẫu này là loài D.cappillies thì bắt buộc nó
phải nằm trên nhóm thứ XII chứ không thể nằm cùng nhóm với 4 trình tự thuộc loài
D. chynsotoxum. Các mẫu D16, D20 và D21 tách thành 2 nhóm riêng biệt gồm D16
(Hoàng Thảo Hoàng Lạp Tây Bắc) thành 1 nhóm nằm chung với 4 trình tự còn D20
(Hoàng Thảo Tiểu Hoàng Lạp), D21 (Hoàng Thảo Tiểu Hoàng Lạp) nằm chung mộ
nhóm với mẫu EU477501.1 với chỉ số bootstrap rất cao (98%). Xét về hình thái, các
mẫu HT Hoàng Lạp đều có thân hình con suốt, lá hình mác và màu sắc hoa giống
nhau, chúng chỉ khác về kích cỡ của hoa một chút và phân bố ở các vùng khác nhau.
Qua đó có thể nhận thấy rằng, 3 mẫu D16, D20 và D21 có sự phân tách về mặt di

20
truyền. Tuy nhiên chúng đều cùng một loài D.chynsotoxum.
Nhóm XI: gồm 5 trình tự là mẫu giống D10 (D. hancokii) với 4 mẫu trình tự
thuộc loài D. hancokii tạo thành một nhóm với chỉ số bootstrap là 76-88%. Tuy
nhiên mẫu D10 tách hẳn nằm riêng rẽ có khoảng cách di truyền khá xa với 4 mẫu D.
hancokii của thế giới.
Nhóm XII gồm mẫu D17 (D.capillipes) với 4 mẫu trình tự thuộc loài
D.capillipes: AF362035.1, KF143433.1, JN388582.1 và HQ114224.1 và chia thành
2 nhánh gồm mẫu D17 với AF362035.1 với chỉ số bootstrap (88%) và 3 mẫu còn lại
tạo thành một nhánh với nhau. Chỉ số bootstrap của 2 nhánh này là 100%. Về hình
thái, mẫu D17 (Hoàng Thảo Kim Điệp) được nhận dạng là D.capillipes, qua đó
khẳng định rằng mẫu D17 đúng là D.capillipes sau khi giải trình tự vùng ITS.
Nhóm XIII bao gồm 7 trình tự bao gồm 5 mẫu giống thu thập D12
(D.amabile), D13 (D.thyrsiflorum), D14 (D.farmeri), D19 (D.farmeri), D26
(D.haveyanum) và trình tự các mẫu của thế giới là KF143519.1 và KC205200.1
thuộc loài D.thyrsiflorum tạo thành một nhóm và được chia thành 2 nhánh chính bao
gồm: 5 mẫu của Việt Nam và mẫu KC205200.1 vào cùng một nhánh với chỉ số
bootstrap là 100% và mẫu KF143519.1 đứng riêng biệt. Trong 5 mẫu của Việt Nam,
hai mẫu D12 và D13 tách ra nằm chung một nhóm với chỉ số bootstrap là 91% trong

khi đó D14, D19 và D26 nằm cùng chung một nhánh với mẫu KC205200.1 với chỉ
số bootstrap là 100%. Xét về hình thái, các mẫu lan Hoàng Thảo Kiều như D12,
D13, D14, D19 và Hoàng Thảo Thủy Tiên mỡ gà (D26) rất giống nhau về hình thái
như thân, lá, chúng chỉ khác nhau về màu sắc hoa và vùng phân bố. Tuy nhiên nhìn
vào cây phát sinh loài cho thấy, các mẫu thu thập có chỉ số bootstrap rất cao từ 96-
100% trong khi đó nhận dạng hình thái tên la tinh là khác nhau. Vậy có thể kết luận
rằng, các mẫu này khi thu thập chưa có độ chính xác về nhận dạng hình thái hoặc
chúng có quan hệ di truyền cực gần nên sử dụng ITS vẫn chưa đủ xác định được
chính xác loài của chúng. Chỉ duy nhất có thể xác định được D13 (Hoàng Thảo Kiều
vàng) là được nhận dạng là loài D.thyrsiflorum.
Nhóm thứ XIV bao gồm 2 trình tự 2 mẫu giống D24 và D25 (đều thuộc loài
D.lindleyi) và 4 mẫu trình tự thu thập là KF143479.1, JN388595.1, KF143478.1 và
HQ114251.1 với chỉ số bootstrap khá cao là từ 94-100% trong đó 2 mẫu của Trung
Quốc là KF143479.1, KF143478.1 và 2 mẫu của nước khác thuộc loài thuộc loài
D.jenkinsii. Mẫu D24 và D25 được nhận dạng tên là Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ và
HT vảy rồng lá trung. Xét về hình thái, 2 mẫu này rất dễ nhận nhầm với Hoàng Thảo
Vảy cá hoặc Hoàng Thảo Vảy rắn (D.jenkinsii). Lan Hoàng Thảo Vảy rồng rất
thường bị nhầm lẫn với Vảy rắn hay Vảy cá, khi so sánh thân và cành hoa, thân
Hoàng Thảo vảy rồng lớn hơn Vảy Rắn, hoa của Vảy rồng thành cuống dài 5 - 15
bông và Vảy Rắn thì 1 cành ít bông hơn. Chính vì vậy, qua kết quả giải trình tự
vùng ITS và so sánh trên cây phát sinh loài cho thấy, hai mẫu giống Hoàng Thảo
Vảy rồng lá nhỏ (D24) và Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung (D25) chính là loài HT
Vảy rắn hay còn gọi là Hoàng Thảo Vảy cá (D.jenkinsii) chứ không phải là Hoàng

21
Thảo Vảy rồng (D.lindleyi).
Nhóm thứ XV bao gồm trình tự của Hoàng Thảo Nhất điểm hồng (D.
draconis Rchb.f - D31) và trình tự của và 3 mẫu trình tự HM054628.1, EU477503.1,
và JF713101.1 với chỉ số boostrap là 100%. Chứng tỏ mẫu D31 thu thập là chính
xác và thuộc loài D.draconis.

Nhóm thứ XVI bao gồm trình tự lan Hoàng Thảo Bạch hạc langbiang (D22-
D.wattii) và 3 trình tự khác là KF143525.1, KF143481.1, KF143485.1. Trong nhóm
này, trình tự của mẫu D22 nằm riêng biệt với D.wattii voucher Jin X-H 11817
(KF143525.1) với chỉ số bootstrap là 73%. Tuy nhiên nhóm D. wattii lại có quan hệ
di truyền rất gần với nhóm D.longicomu (KF143481.1, KF143485.1) với chỉ số
bootstrap từ 74-99%. Xét về mặt hình thái, D.wattii và D.longicomu có hình thái
tương đối giống nhau nên rất dễ nhầm lẫn khi phân biệt. Vì vậy, mẫu D22 (Hoàng
Thảo Bạch hạc langbiang -D.wattii ) chúng tôi khẳng định chính xác là loài D.wattii.
Nhóm thứ XVII gồm trình tự của mẫu Hoàng Thảo Đại bạch hạc (D.
christyanum-D32) với 4 trình tự F143442.1, KF143441, GU339106.1 và
EF629325.1 đều thuộc loài D.christyanum với chỉ số bootstrap của nhóm này rất cao
lên đến 98%. Điều này cho thấy mẫu D32 thu thập là chính xác và thuộc loài D.
christyanum.
Những thông tin qua giải trình tự vùng ITS cho thấy, đa số các mẫu giống thu
thập trong nghiên cứu đã được nhận dạng tương thích với nhận dạng về hình thái.
Trong 32 mẫu giống có 23 mẫu giống được nhận dạng tương thức hình thái với phân
tử là các mẫu giống D1, D2, D3, D4, D5, D7, D8, D9, D10, D13, D16, D17, D18,
D20, D21, D22, D23, D27, D28, D29, D30, D31 và D32 (Bảng 3.14). Tuy nhiên
trong quá trình nghiên cứu, các mẫu giống được nhận dạng dạng dựa trên hình thái,
sau đó được giải trình tự vùng ITS và có sự so sánh các mẫu giống đã giải trình tự
với các mẫu giống đã công bố trên ngân hàng GenBank thì có 9/32 hình thái chưa
thích ứng đối với phân tử là các mẫu giống D6, D11, D12, D14, D15, D19, D24,
D25 và D26. Trong số 9 mẫu giống này thì có 4 mẫu giống được đính chính lại tên
la tinh là các mẫu giống D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D15 (Hoàng Thảo Tam đảo);
D24 (Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung). 5 mẫu
giống chưa nhận dạng được là các mẫu giống D11 (Hoàng Thảo xoắn), D12 (Hoàng
Thảo Kiều tím), D14 (Hoàng Thảo Kiều trắng), D19 (Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng
nai) và D26 (Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà). Giải thích cho hiện tượng này có nhiều
nguyên nhân khác nhau như: Các mẫu giống thu thập có sự nhầm lẫn về tên la tinh
khác nhau; Quá trình bảo quản mẫu giống có sự nhầm lẫn hoặc dữ liệu trên ngân

hàng gen Bank chưa có đủ thông tin với các mẫu giống này do tên latinh và vùng
ITS không giống nhau.

22
Bảng 3.14. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đƣợc nhận dạng bằng trình tự vùng ITS
Ký
hiệu
Tên tiếng Việt
Nhận dạng dựa
trên hình thái
Nhận dạng theo
trình tự ITS
Ký
hiệu
Tên tiếng Việt
Nhận dạng dựa trên
hình thái
Nhận dạng theo
trình tự ITS
D1
HT Long nhãn Lai
Châu
D. fimbriatum
D. fimbriatum
D17
HT Kim Điệp
D. capillipes
D. capillipes
D2
HT chuỗi ngọc Điện

Biên
D. findlayanum
D. findlayanum
D18
Hoàng Thảo Chuỗi
Ngọc
D. findlayanum
D. findlayanum
D3
HT Thái Bình
D. moschatum
D. moschatum
D19
Kiều trắng Đồng
Nai
D. farmeri
Chưa xác định được
D4
Phi Điệp tím
D. anosmum
D. anosmum
D20
HT Tiểu hoàng lạp
D. chrysotoxum
D. chrysotoxum
D5
HT Trầm tím
D.parishii
D.parishii
D21

HT Đại hoàng lạp
D. chrysotoxum
D. chrysotoxum
D6
HT trầm trắng
D.parishi .var
alba
D.anosmum.var alba
D22
HT bạch hạc
langbiang
D. wattii
D. wattii
D7
HT Ngọc Vạn Vàng
D. chrysanthum
D. chrysanthum
D23
HT Hạc vĩ
D. aphylum
D. aphylum
D8
HT Phi điệp vàng
D. chrysanthum
D. chrysanthum
D24
HT Vảy rồng lá
nhỏ
D. lindleyi
D. jenkinsii

D9
HT Long tu Bắc
D. primulinum
D. primulinum
D25
HT Vảy rồng lá
trung
D. lindleyi
D. jenkinsii
D10
HT Trúc
D. hancockii
D. hancockii
D26
Thủy tiên mỡ gà
D. haveyanum
Chưa xác định được
D11
HT Xoắn
D. tortile
Chưa xác định được
D27
HT Vani

D. aduncum
D. aduncum
D12
HT
D. amabile
Chưa xác định được

D28
Hoàng Thảo Đùi
gà
D. nobile
D. nobile
D13
HT Kiều vàng
D. thyrsiflorum
D. thyrsiflorum
D29
Long tu đá
D. primulinum
D. primulinum
D14
HT Kiều trắng
D. farmeri
Chưa xác định được
D30
HT Môi tơ
D.brymerianum
D.brymerianum
D15
HT Tam Đảo
D. daoense
D. fimbriatum
D31
Nhất Điểm Hồng
D. draconis Rchb.f
D. draconis Rchb.f
D16

HT Hoàng lạp Tây
Bắc
D. chrysotoxum
D. chrysotoxum
D32
HT Đại bạch hạc
D. christyanum
D. christyanum
Ghi chú: HT- Hoàng Thảo

23
Tóm lại, mặc dù số mẫu giống thu thập vẫn còn hạn chế nhưng trình tự vùng
ITS một lần nữa cho thấy chúng phát huy sức mạnh là một mã vạch ADN phổ quát
trong việc phân định loài và ở mức dưới loài cho nhóm thực vật có hoa. Qua kết quả
cho thấy, đa số các mẫu giống được nhận dạng chính xác tên và loài của chúng. Vài
mẫu giống vật có sự khác biệt về tên gọi theo hình thái và theo trình tự vùng ITS.
Qua các phép phân tích cho thấy vị trí các mẫu giống vật trong cây phát sinh loài
dựa trên giải trình tự vùng ITS giúp khẳng định chính xác tên khoa học của các mẫu
giống vật bị nhầm lẫn. Thành công và kết quả trong nghiên cứu này tạo tiền đề quan
trọng cho chúng tôi mở rộng cỡ mẫu giống (số mẫu giống trong cùng loài), số loài
nghiên cứu (nhiều loài Dendrobium, hoặc nhiều loài trong họ Orchideacea), hoặc
chọn lựa thêm chỉ thị khác (gen 16 rRNA, gen matK, ) để hướng đến xây dựng mã
vạch ADN cho các loài lan có giá trị ở Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN:
1. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo rất đa dạng về thân, lá, và hoa. Dựa trên kết
quả phân tích đa dạng di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bằng chỉ thị
hình thái cho thấy hệ số tương đồng di truyền dao động từ 37-100% và chúng chia
làm 5 nhóm khác nhau. Một số mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 100%

như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D2
(Hoàng Thảo chuỗi ngọc Điện Biên và D18 (Hoàng Thảo chuỗi ngọc).
2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bằng
chỉ thị phân tử RAPD cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các giống lan Hoàng
Thảo nghiên cứu dao động trong khoảng từ 23 - 100%. Một số mẫu giống hoa như:
D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6 (Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo
Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (HT Vảy rồng lá trung) có hệ số tương đồng di truyền cao
nhất là 100%.
3. Qua so sánh kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng đặc điểm hình thái và chỉ thị
phân tử RAPD cho thấy 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo đều được chia làm 5
nhóm khác nhau. Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có quan hệ gần nhau về mặt di
truyền đều xếp chung vào một nhóm. Trong số các mẫu giống đó có các mẫu giống
có hệ số di truyền như nhau như các mẫu giống D5 (Hoàng Thảo Trầm tím) và D6
(Hoàng Thảo Trầm trắng); D24 (Hoàng Thảo Vảy rồng lá nhỏ) và D25 (Hoàng Thảo
vảy rồng lá trung).
4. Dựa trên chỉ thị phân tử RAPD, một số cặp mồi như OPN7, OPN20, OPN16,
OPN11 nhận dạng được một số mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo như: mẫu giống D9
(Hoàng Thảo Long tu Bắc với mồi OPN16, OPN20; Hoàng Thảo Chuỗi ngọc Điện
Biên (D2) ở mồi OPN7, OPN20.
5. Dựa trên kết quả giải trình tự vùng ITS, qua so sánh trình tự các mẫu giống hoa
lan Hoàng Thảo của Việt Nam và thế giới, đã xác định chính xác được 23/32 mẫu
giống hoa lan Hoàng Thảo. Trong 9 mẫu giống còn lại thì 4 mẫu giống được hiệu