Thu nhận phlorotannin từ rong mơ (sargassum) tại nha trang khánh hòa và thử nghiệm sử dụng phlorotannin làm thực phẩm chức năng chống oxy hóa (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


ĐẶNG XUÂN CƢỜNG





NGHIÊN CỨU THU NHẬN PHLOROTANNIN TỪ
RONG MƠ (SARGASSUM
SERRATUM
) TẠI NHA
TRANG VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỒ
UỐNG CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản
Mã số: 62540105


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Nha Trang - 2015

Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Nha Trang và Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công
nghệ Nha Trang.


Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Vũ Ngọc Bội
Trường Đại học Nha Trang
2. PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân
Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang


Phản biện 1: GS. TSKH Nguyễn Trọng Cẩn

Phản biện 2: PGS. TS Phùng Thị Thanh Tú

Phản biện 3: PGS. TS Nguyễn Anh Tuấn

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sỹ
cấp Trường họp tại:
……………………………………………………………………………
Vào hồi …………giờ ……… ngày ……tháng ……….năm………

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Trường Đại học Nha Trang hoặc thư viện Quốc gia Hà Nội.

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Rong nâu (Phaeophyta) là loại rong giàu các chất có hoạt tính sinh
học như lamilaran, fucoidan, alginate, phlorotannin, … Các chất này
có nhiều hoạt tính sinh học, trong đó đáng chú ý là hoạt tính chống
oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm…. Ngành rong nâu (Phaeophyta)
có nhiều họ như: Alariaceae, Fucaceae và Sargassaceae.
Ở Việt Nam, chi rong mơ (Sargassum) thuộc họ rong mơ
(Sargassaceae) được biết là chi rong có sản lượng lớn và có giá trị
cao, do chi rong này có chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị như
fucoidan, laminaran, alginate, phlorotannin,…. Trong đó đáng chú ý là
phlorotannin - một hợp chất chuyển hóa thứ cấp kiểu hỗn hợp
phenolic. Phlorotannin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như:
hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u,
ngừa ung thư,… Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin là một
trong những hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất và phlorotannin
được biết đến là chất chống oxy hóa không độc và an toàn với con
người nên có thể khai thác và sử dụng trong hỗ trợ cơ thể đào thải các
gốc tự do giúp tăng cường sức khỏe. Do vậy, phlorotannin từ rong mơ
đã được các nhà nghiên cứu quan tâm.
Vùng biển Nha Trang có nguồn lợi rong mơ Sargassum phong phú và
đa dạng về số lượng, chủng loại. Mặt khác, rong mơ ở vùng biển Nha
Trang được cho rằng có chứa các hoạt chất sinh học như fucoidan,
phlorotannin, alginate,…. với hàm lượng cao. Do vậy việc nghiên cứu

“
Nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ Sargassum serratum
tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính
chống oxy hóa”
là cần thiết.

2
2. Mục tiêu của Luận án:
- Nghiên cứu thu nhận phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ
rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang,
Khánh Hòa.
- Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính
chống oxy hóa.
3. Đối tƣơng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng ở vùng biển Nha
Trang được thu mẫu, rửa sạch bằng nước mặn, sấy khô đến độ ẩm
19% và bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng làm nguyên liệu trong
suốt quá trình nghiên cứu thu nhận phlorotannin.
3.2. Phạm vi nghiên cứu: gồm 5 phần
1) Nghiên cứu tách chiết và tối ưu hóa quá trình thu nhận
phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển
Nha Trang, Khánh Hòa.
2) Bước đầu phân đoạn và tinh sạch phlorotannin thu nhận từ rong
mơ (Sargassum serratum).
3) Nghiên cứu sấy phun để thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết
rong mơ S. serratum.
4) Đánh giá độc tính của phlorotannin thu từ rong mơ S. serratum.
5) Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa
.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chuẩn của Thế giới
và Việt Nam trong nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong mơ
(Sargassum serratum), có sử dụng toán học để tối ưu hóa nhằm tìm ra

3
các quy luật, phát hiện ra các tính chất mới, các mối quan hệ giữa các
đại lượng và kiểm chứng các giả thuyết.
5. Các đóng góp mới về mặt khoa học
- Lần đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về phlorotannin của
rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang,
Khánh Hòa từ nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tách chiết đến tinh sạch,
thử nghiệm độc tính trên chuột, nghiên cứu sấy phun để tạo bột chế
phẩm phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa cao và thử nghiệm sản
xuất đồ uống phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa. Do vậy, kết quả
nghiên cứu của Luận án có ý nghĩa khoa học cao. Kết quả này góp phần
khẳng định giá trị của nguồn lợi rong biển Việt Nam. Mặt khác, kết quả
của luận án còn là tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu và giảng
dạy trong lĩnh vực nghiên cứu các chất tự nhiên từ rong biển
.
- Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở để các doanh nghiệp sản
xuất thực phẩm phát triển thương mại hóa một số sản phẩm từ
phlorotannin thu nhận từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở
vùng biển Nha Trang.
6. Kết cấu của luận án
Luận án bao gồm 171 trang, trong đó 34 trang tổng quan, 22 trang
phương pháp nghiên cứu, 89 trang kết quả nghiên cứu, kết luận 2
trang, tài liệu tham khảo 24 trang và phụ lục.

4
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ
Rong mơ là nguồn tài nguyên giàu hoạt chất sinh học với các hoạt
tính sinh học phong phú và đa dạng, như chống oxy hóa, kháng khuẩn,
kháng nấm, chống đông tụ và chống bức xạ UV-B, khả năng làm lành
vết thương và tái tạo cấu trúc tế bào (Kang và ctv., 2003). Thực tế cho
thấy, tỉnh Khánh Hòa có 21 loài rong mơ trong đó loài Sargassum
serratum là loài phân bố rộng, trữ lượng lớn và là loài mới, có chứa
nhiều chất có hoạt tính tự nhiên như fucoidan, phlorotannin,… nhưng
chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN
Phlorotannin là một trong những hoạt chất chống oxy hóa mạnh
mẽ có nguồn gốc từ rong mơ (Ahn và cộng sự (2007); Kang và cộng
sự (2003); LIM (2002); Kuda (2007) và Shibata (2008)). Phlorotannin
có các đơn vị cơ bản là phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) với
kích thước phân tử dao động trong khoảng 126 Da - 650 kDa (Singh
và cộng sự (2006)) và có các kiểu liên kết đặc trưng trong cấu trúc
như: liên kết ether, liên kết phenyl, liên kết ether và liên kết phenyl,
liên kết dibenzodioxin (La Barre và cộng sự (2010)). Điều thú vị là
hàm lượng, cấu trúc và cơ chế chống oxy hóa của polyphenol/
phlorotannin trong rong nâu có mối liên hệ chặt chẽ với hoạt tính
chống oxy hóa. Phlorotannins là hỗn hợp phenolic với bản chất
polymer của phloroglucinol, chúng tồn tại trong nhiều họ của ngành
rong nâu như: Alariaceae, Fucaceae và Sargassaceae. Như vậy có thể
thấy phlorotannin là hoạt chất đáng để quan tâm nghiên cứu.

5
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN
TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
* Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hỗn hợp phenolic trong rong nâu
chính là phlorotannin (Jormalainen và cộng sự, (2004); Koivikko và
cộng sự, (2007); Swanson và cộng sự, (2002)). Siti A. Budhiyanti và
cộng sự (2012) công bố khả năng bắt gốc tự do (DPPH) dao động từ
14,61 ÷ 48,71% và 0,17 ÷ 44,05% tương ứng khi dịch chiết từ thành tế
bào và tế bào chất có nồng độ 0,45 mg/ml; hoạt tính khử sắt dao động
từ 2,05 ÷ 12,51% và 26,77 ÷ 68,80% tương ứng khi dịch chiết từ tế
bào chất và thành tế bào của một số loài Sargassum thu ở bờ biển
Indonesia có nồng độ 0,45 mg/ml được sử dụng, các dịch chiết này
đều chứa phlorotannin. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của loài S.
ramifolium và S. pteropleuron với chỉ số oxi hóa EC50 dao động từ
6,64 đến 7,14 mg/ml (Mayalen Zubia và cộng sự, 2007). Đồng thời
Soo Jin Heo và cộng sự (2005) chỉ ra khả năng bắt gốc tự do của loài
S. thunbergii và S. fulvellum tương ứng là 97,41% và 84,66%. Hoạt
tính chống oxy hóa mạnh của phlorotannin tinh chế từ một số loài
rong nâu có mối liên hệ mật thiết với phân tử skeleton (Ahn và cộng
sự, 2007). Như vậy thấy rằng có sự đa dạng về hoạt tính và hoạt lực
của phlorotannin ở các loài rong Sargassum khác nhau trên thế giới.
Những nghiên cứu trên cùng công bố của Barry Halliwell (2001) đã
cho thấy, phlorotannin có khả năng giảm thiểu sự tổn thương tế bào
dưới tác động của những gốc tự do như: superoxide, hydroxyl,
peroxyl, alkoxyl, hydroperoxyl, nitric oxide và nitrogen dioxide được
coi là gốc tự do. Điều này cũng được minh chứng trên loài S.
ringgoldianum có khả năng bắt gốc (
.

OH) đến 78% và (O
2-
) đến

6
88,4% và hoặt tính bắt gốc tự do (DPPH) của loài S. vulgare là 0,2%
÷ 20,3% (Naja và cộng sự, 2012) cũng như loài S. pallidum có hoạt
tính chống oxy hóa tổng dao động từ 0,04 ± 0,02 đến 52,08 ±
0,02µmol FeSO
4
/mg (Hong Ye và cộng sự, 2009).
* Tình hình nghiên cứu trong nƣớc về phlorotannin
Phlorotannin chống oxy hóa được chiết từ rong nâu mới bước đầu
được nghiên cứu ở Việt Nam từ năm 2009. Tuy nhiên đến năm 2010
mới có một số công bố về hoạt tính chống oxy hóa của một số loài
rong nâu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa, Việt Nam và những
công bố đều do nhóm nghiên cứu của tác giả công bố.
1.4. ỨNG DỤNG SẤY PHUN TẠO BỘT CHỨA
PHLOROTANNIN
Thực tế cho thấy kỹ thuật sấy phun sẽ giúp chuyển hóa hoạt chất từ
dạng dịch qua dạng bột, loại bỏ hầu hết dung môi, tiết kiệm chi phí
vận chuyển, nâng cao thời gian bảo quản hoạt chất và quan trọng nhất
là hình thành hạt vi nang nâng cao độ bền của hoạt chất nhờ khả năng
liên kết và bao gói của các chất trợ sấy được đính kèm trong quá trình
sấy phun. Nên kỹ thuật sấy phun rất phù hợp để tạo bột phlorotannin
chống oxy hóa có nguồn gốc từ rong biển.
Từ những phân tích ở trên thấy rằng, trên thế giới chưa có bất kỳ
công trình nào về nghiên cứu chiết tách, tối ưu, sấy phun tạo bột ứng
dụng, xác định cấu trúc của phlorotannin từ rong nâu Sargassum
serratum sinh trưởng ở bờ biển Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam hay

sàng lọc đánh giá hàm lượng trữ lượng theo mùa vụ thời gian sinh
trưởng cũng như sự tích lũy và phân bố ở từng phần cây rong hay
theo thời gian bảo quản. Do vậy Luận án tập trung nghiên cứu những
vấn đề trên.

7
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Rong mơ (Sargassum serratum) thuộc: Ngành (Phaeophyta),
Lớp (Phaeophyceae), Bộ (Fucales), Họ (Sargassaceae),
Chi (Sargassum).
Rong mơ (Sargassum serratum) sinh trưởng ở vùng biển Nha
Trang - Khánh Hòa được thu mẫu, rửa sạch bằng nước mặn, sấy khô
đến độ ẩm 19% và bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng trong suốt quá
trình nghiên cứu.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp phân tích
2.2.1.1. Phƣơng pháp định lƣợng phlorotannin: theo Swanson
và cộng sự, 2002, với phloroglucinol là chất chuẩn.
2.2.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
+ Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): theo phương pháp của
Prieto và cộng sự, (1999) với chất chuẩn là acid ascorbic.
+ Hoạt tính khử Fe (RP): xác định theo Zhu và cộng sự, (2002)
với chất chuẩn là FeSO
4
.
+ Hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH): xác định hoạt tính bắt gốc tự
do (DPPH) theo Blois M. S. (1958)
Sử dụng máy UV-Vis Spectrophotometer JenWay 6400/6405 để
đo độ hấp thụ.

2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định độ màu sản phẩm: theo phương
pháp xử lý UF của Neslihan và cs (2005).
2.2.1.4. Phƣơng pháp định lƣợng một số thành phần khác
- Định lượng carbohydrate: Xác định hàm lượng carbohydrate theo
AOAC (1990).

8
- Định lượng hàm lượng Pb: theo TCVN 7602:2007 Thực phẩm.
- Định lượng hàm lượng acid citric: Theo phương pháp AOAC (1932)
.
- Định lượng hàm lượng đường sucrose: Theo phương pháp AOAC (2000).
2.2.2. Phƣơng pháp tinh chế
Mỗi phân đoạn này được tiến hành chạy sắc ký bản mỏng với hệ
dung môi rửa giải là chloroform: methanol: acid formic (90: 9: 1).
Thuốc thử phát hiện phlorotannin là FeCl
3
5% trong cồn ethanol 96%.
Sau đó kiểm tra lại độ tinh sạch của mẫu trên bản mỏng bằng LC/MS
và phân tích phlorotannin theo phương pháp Swanson và cộng sự.
Phân đoạn phlorotannin sạch nhất được chạy qua sắc ký cột Sephadex
LH 20 với dung môi chạy sắc ký là chloroform : methanol : acid
formic theo tỷ lệ (90 : 9: 1). Phân đoạn phlorotannin sạch thu từ cột
LH 20 được chạy NMR
1
H và
13
C. (pha động gồm pha A H
2
O 0,1%
acid formic, pha B Acetonitril 0,1% acid formic). Phương pháp chạy

là HPLC-MS, nhận biết chất qua tỉ lệ m/z.
- Chạy LC/MS: Chương trình gradient như sau:
Bảng 2.1. Chƣơng trình gradient trên LC/MS


Thời gian
Pha B (%)
0
10
10
10
40
90
60
90
61
10
70
10

9

2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan: theo phương pháp cho
điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79 với thang điểm 20 để đánh
giá chất lượng cảm quan của sản phẩm.
2.2.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ ml) theo TCVN
4884:2005.
- Xác định E. coli theo TCVN 6848:2007.
- Xác định Coliforms theo TCVN 6846:2007.

- Xác định C. perfringens theo TCVN 4991:2005
- Xác định Streptococci faecal theo TCVN 6189-2:1996.
- Xác định Pseudomonas aeruginosa theo ISO 16266:2006.
- Xác định Staphycus aureus theo TCVN 4830-1:2005.
- Xác định tổng số bào tử NM - NM (BT/ml) theo TCVN
5166:1990.
2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Bố trí thí nghiệm tổng quát của quá trình nghiên cứu thể hiện ở
hình 2.1.

10

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Trên cơ sở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chúng tôi tiến hành
nghiên cứu xác định các thông số phù hợp cho từng công đoạn.

11
2.3. HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ
DỤNG
2.3.1. Hóa chất
- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: HCl, Na2CO3, H2SO4,
sodium phosphate, ammonium molybdate, đệm phosphate,
K3[Fe(CN)6], CCl3COOH, FeCl3, chất chuẩn là FeSO4 và acid
ascorbic, phloroglucinol,…, DPPH, ethanol, n-hexan, ethyl acetate,
chloroform, đều là các hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho
phân tích do Merck - Đức và Sigma - Mỹ cung cấp. Ethanol 96% do
Việt Nam sản xuất.
- Các loại phụ gia thực phẩm: acid citric, acid ascorbic,
carrageenan, sacharose, đều là phụ gia tinh khiết đạt tiêu chuẩn sử
dụng làm dược phẩm và thực phẩm do Merck - Đức cung cấp.

2.3.2. Thiết bị chủ yếu đã sử dụng
Sử dụng các thiết bị chủ yếu hiện có trong các phòng thí nghiệm
Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ của Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang và phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
- Trung tâm Thực hành phân tích - Trường Đại học Nha Trang gồm:
Thiết bị ổn nhiệt - Memment (Đức), máy đo pH HANA (Mỹ), Thiết bị
Cô quay chân không (Đức), Máy sấy phun Bucchi - Thụy Sỹ, máy so
mầu UV- VIS - Mỹ,…
2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Phân tích dữ liệu và tiên đoán bề mặt đáp ứng bằng phần mềm
Design Expert 8 trial, Nemrodw và Excell. Nghiệm thức được lặp lại 3
lần. Giá trị bất thường được loại bỏ bằng phương pháp Dulcan.





12
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ
RONG MƠ S. SERRATUM
3.1.1. Xác định dung môi chiết rút phlorotannin
Kết quả cho thấy dung môi chiết ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng
phlorotannin (Phc) và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết. Đối
với cả 2 phương pháp chiết (hồi lưu và ngâm chiết) thì hàm lượng Phc
và hoạt tính chống oxy hóa thu được đều giảm dần theo thứ tự dung
môi chiết như sau: ethanol > acetone > ethyl acetate > chloroform > n-
hexan.

Kết quả phân tích cũng cho thấy chiết rút phlorotannin từ rong

mơ bằng phương pháp ngâm chiết luôn cho dịch chiết có hàm lượng
phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt cao
hơn so với dịch chiết thu nhận bằng phương pháp hồi lưu. Cụ thể, hàm
lượng phlorotannin, hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA), hoạt tính khử
sắt (RP) của dịch chiết ethanol theo phương pháp hồi lưu chỉ bằng
tương ứng 98,19%, 91,12% và 93,89% so với dịch chiết phlorotannin
bằng ethanol theo phương pháp ngâm chiết.
Vì vậy, ethanol được lựa chọn làm dung môi chiết và phương pháp
ngâm chiết cũng được lựa chọn để chiết phlorotannin từ rong mơ.
3.1.2. Xác định nồng độ dung dịch ethanol sử dụng chiết rút

phlorotannin

Kết quả phân tích cho thấy sử dụng ethanol ở nồng độ 96% để
chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum thì dịch chiết thu được có
hàm lượng Phc, TA và RP cao nhất. Phân tích ANOVA và hồi quy
cho thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa Phc, TA và RP ở
các điều kiện chiết khác nhau và có sự tương tác qua lại rất chặt chẽ
(R
2
> 0,8) đồng thời đều thay đổi theo mô hình hồi quy phi tuyến bậc
2. Do vậy ethanol ở nồng độ 96% được lựa chọn để chiết rút
phlorotannin từ rong mơ S. serratum.

13
3.1.3. Xác định tỷ lệ dung dịch chiết so với nguyên liệu rong
Khi chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum bằng dung môi
ethanol 96% với tỷ lệ DM:NL 40:1 (v/w) thì hàm lượng Phc, TA và
RP của dịch chiết thu được cao nhất và đạt tương ứng 4,102 ±
0,005mg phloroglucinol/g trọng lượng khô (DW), 4,279 ± 0,001 mg

acid ascorbic/g DW và 24,228 ± 0,014 mg FeSO
4
/g DW. Trong khi đó
nếu chiết với tỷ lệ dung môi (DM): nguyên liệu (NL) 10:1 (v/w) thì
hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP của dịch chiết chỉ đạt tương ứng
57,80%, 73,63%, 86,50% so với khi chiết với tỷ lệ DM:NL 40:1
(v/w). Nếu chiết với tỷ lệ DM/NL 30:1 (v/w) thì Phc, TA và RP của
dịch chiết chỉ đạt 86,57%, 96,79%, 86,89% so với khi chiết ở tỷ lệ
DM:NL 40:1 (v/w). Nếu chiết tỷ lệ DM/NL 50/1 (v/w) hàm lượng
phlorotannin (Plc), hoạt tính oxy hóa tổng (TA), hoạt tính khử sắt
(RP) của dịch chiết đạt 96,32%, 96,61%, 96,65% so với khi chiết ở tỷ
lệ DM:NL 40:1 (v/w). Do vậy, tỷ lệ giữa dung môi chiết so với
nguyên liệu rong là 40:1 (v/w) được lựa chọn để nghiên cứu chiết rút
phlorotannin từ rong mơ S. serratum.
3.1.4. Xác định nhiệt độ chiết
Kết quả phân tích ANOVA và hồi quy cho thấy khi chiết rút
phlorotannin từ rong mơ (S. serratum) ở 50
0
C thì dịch chiết thu được
có hàm lương phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt
tính khử sắt cao nhất. Do vậy, nhiệt độ được lựa chọn cho quá trình
chiết phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum
serratum là 50
0
C.
3.1.5. Xác định thời gian chiết
Kết quả phân tích cho thấy sự thay đổi hàm lượng Phc theo thời
gian chiết tuân theo phương trình phi tuyến bậc 2, kết quả này cũng
tương đồng với nghiên cứu chiết rút phlorotannin từ rong mơ S.
mcclurei của Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội,

Bùi Minh Lý công bố năm 2014 [10]. Hoạt tính RP của dịch chiết ở
các thời gian chiết khác nhau có sự khác biệt mang tính thống kê và

14
giữa thời gian chiết với hoạt tính TA có mối tương quan mạnh. Mặt
khác, giữa hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP có mối tương quan
chặt chẽ, trong đó hàm lượng Phc và hoạt tính TA có mối tương quan
cao mạnh mẽ hơn cả. Mối tương quan này thể hiện ở chỗ khi thời gian
ngâm chiết dài thì quá trình khuếch tán của phlorotannin từ nguyên
liệu ra môi trường đạt mức cao nhất thể hiện qua hàm lượng
phlorotannin hòa tan trong dung dịch tăng và đạt mức cực đại khi thời
gian chiết đủ dài. Kết quả phân tích còn cho thấy thời gian chiết 32
giờ thì hàm lượng hàm lượng Phc, hoạt tính TA và RP của dịch chiết
cao nhất. Do vậy thời gian chiết 32 giờ được lựa chọn để chiết
phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ S. serratum.
3.1.6. Xác định pH dung dịch chiết
Kết quả phân tích ANOVA và hồi quy cũng cho thấy pH của dung
dịch chiết và hoạt tính chống oxy hóa có sự tương quan dương rất lớn
(R > 0,9). Đồng thời hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy
hóa tổng cũng có mối tương quan rất mạnh (R
2
= 0,95) và tuân theo
phương trình phi tuyến bậc 2 với sự ảnh hưởng mạnh mẽ của pH môi
trường chiết. Tuy nhiên, hàm lượng phlorotannin chỉ tương quan với
hoạt tính khử sắt ở mức trung bình (R
2
= 0,65). Kết quả nghiên cứu
này cũng tương tự nghiên cứu chiết rút phlorotannin từ rong mơ S.
mcclurei của Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội,
Bùi Minh Lý công bố năm 2014.

Kết quả phân tích cho thấy pH 7 phù hợp với quá trình chiết rút
phlorotannin từ rong mơ S. serratum. Do vậy, chúng tôi lựa chọn pH
của dung môi để chiết phlorotannin từ rong mơ S. serratum là 7.
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép lựa chọn một số thông số phù
hợp cho quá trình chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ
rong mơ Sargassum serratum làm cơ sở cho việc tối ưu hoá quá trình
chiết rút sau này như sau: Nhiệt độ: 50
0
C, thời gian chiết 32 giờ, dung
môi chiết là ethanol 96%, tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu (DM:NL)
là 40:1 (v/w).

15
3.2. TỐI ƢU HÓA QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT
PHLOROTANNIN THEO PHƢƠNG PHÁP BOX-BEHNKEN
Sau khi xác định được một số điều kiện phù hợp để chiết
phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ S. serratum.
Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa quá trình chiết rút phlorotannin từ rong
mơ S. serratum các biến số như sau: Nhiệt độ chiết (U
1
: 24 - 60
0
C),
thời gian chiết (U
2
: 16 - 42 giờ) và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w)
(U
3
: 10 - 50). Các hàm mục tiêu Y
1

: Hàm lượng phlorotannin (mg/g),
Y
2
: Hoạt tính chống oxy hóa tổng (mg acid ascorbic/g), Y
3
: Hàm lượng
FeSO
4
(mg FeSO
4
/g). Kết quả tối ứu hóa được trình bày ở các bảng
3.1 và 3.2, hình 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả tối ƣu hóa công đoạn chiết rút phlorotannin từ
rong mơ S. serratum theo mô hình Box-behnken
U
1

U
2

U
3

X
1

X
2

X

3

Y
1

Y
2

Y
3

24
16
30
-1
-1
0
1,607
1,652
1,575
60
16
30
1
-1
0
1,292
3,640
6,650
24

42
30
-1
1
0
1,071
1,666
7,630
60
42
30
1
1
0
1,607
5,180
10,080
24
29
10
-1
0
-1
1,512
2,100
11,200
60
29
10
1

0
-1
1,670
4,970
10,325
24
29
50
-1
0
1
0,914
1,246
6,020
60
29
50
1
0
1
2,394
6,300
11,830
42
16
10
0
-1
-1
2,079

2,772
8,190
42
42
10
0
1
-1
5,796
15,316
44,835
42
16
50
0
-1
1
2,142
1,736
3,780

16
42
42
50
0
1
1
3,087
5,754

18,410
42
29
30
0
0
0
6,017
15,400
45,150
42
29
30
0
0
0
6,080
15,442
45,080
42
29
30
0
0
0
6,048
15,414
45,010

(A) Bề mặt đáp ứng
của hàm mục tiêu Y
1

(B) Bề mặt đáp ứng
của hàm mục tiêu Y
2

(C) Bề mặt đáp ứng
của hàm mục tiêu Y
3

Hình 3.1. Mô hình 3D bề mặt đáp ứng
Bảng 3.2. Kết quả thí nghiệm lặp lại ở điểm tối ƣu
X
1

(
0
C)
X
2

(h)
X
3

(v/w)

Y
1

Y
2

Y
3

DPPH
tb

43
33
27:1
5,92
15,06
45,27
61,55
43
33
27:1
5,98
15,11
45,34
64,66
43
33
27:1
5,96

14,99
45,29
65,75
X
1

(
0
C)
X
2

(h)
X
3

(v/w)
DPPH (%)
0,2 ml
0,4 ml
0,6 ml
0,8
ml
1 ml
43
33
27:1
34,00
58,60
71,50

80,32
82,11
43
33
27:1
33,70
57,40
69,90
79,70
82,59
43
33
27:1
36,00
59,80
70,23
81,40
81,30
Ghi chú: DPPHtb: hoạt tính bắt gốc tự do (DPPH) trung bình

17
Kết quả tối ưu hóa này phù hợp với dữ liệu thực nghiệm đã kiểm
định về quá trình chiết phlorotannin chống oxy hóa từ rong mơ
Sargassum serratum. Từ kết quả này cho phép chọn điều kiện chiết tối
ưu cho quá trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ S. serratum: dung
môi chiết là ethanol 96%, nhiệt độ chiết tối ưu 43
0
C, tỷ lệ dung môi so
với nguyên liệu (DM:NL) 27:1 (v/w) và thời gian chiết 33 giờ
* Xác định số lần chiết

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng Phc của dịch chiết
phlorotannin từ rong mơ S. serratum 3 lần bằng cồn 96% tăng lên không
đáng kể so với hàm lượng phlorotannin của dịch chiết chiết 1 lần. Mặt
khác, nếu chiết 3 lần thì tổng lượng cồn sử dụng quá nhiều và nếu so sánh
hiệu quả giữa lượng phlorotannin thu được khi chiết lần 2 và lần 3 so với
lượng cồn đã sử dụng cho các lần chiết này thì hiệu quả không đáng kể. Do
vậy, để đảm bảo tính kinh tế, luận án quyết định chỉ chiết phlorotannin từ
rong mơ S. serratum 01 lần
.
3.3. NGHIÊN CỨU CÔ ĐẶC DỊCH CHIẾT
PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S. SERRATUM
Kết quả nghiên cứu cô đặc dịch chiết thu nhận từ rong mơ S.
serratum được lọc và cô đặc lần 1 ở các nhiệt độ khác nhau: 40
0
C,
50
0
C, 60
0
C cho thấy khi tăng nhiệt độ cô đặc thì hàm lượng Phc với
hoạt tính chống oxy hóa của dịch sau cô đặc có xu hướng giảm theo
phương trình hồi quy bậc 1 và nhiệt độ cô đặc ở 40
0
C ít gây tổn thất
cho hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa. Do vậy
nhiệt độ 40
0
C, áp suất 3mbar và điều kiện hồi lưu lạnh được lựa chọn

18

để cô đặc dịch phlorotannin chống oxy hóa từ rong mơ.
3.4. NGHIÊN CỨU TINH CHẾ PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT
TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADEX LH 20
3.4.1. Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel Sephadex LH 20
Tiến hành tách phân đoạn dịch phlorotannin cô đặc lần lượt bằng
các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Phân
đoạn sạch nhất được chạy qua cột sephadex LH 20, cột 2x25cm, mỗi
phân đoạn thu 10ml. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và 3.3.

Hình 3.2. Hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
của các phân đoạn dịch cô đặc bằng các dung môi khác nhau

Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch phlorotannin từ rong mơ S. serratum cô đặc qua cột lọc
gel Sephadex LH 20, cột 2x25cm, 10ml/phân đoạn

19
Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch phlorotannin
ST
T
Giai đoạn
tinh chế
Hàm lƣợng
phlorotannin
(g
phloroglucinol/g
DW)
Hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính bắt
gốc tự do
DPPH (%)

Hoạt tính chống
oxy hóa tổng
(g acid ascorbic/
g DW)
Hoạt tính khử
sắt
(g FeSO
4
/ g
DW)
I
Dịch chiết
ban đầu
0,3173 ± 0,0050
63,98 ± 0,1
0,7589 ± 0,0042
1,8616 ± 0,0034
II
Cô đặc lần 1
0,3096 ± 0,0040
60,14 ± 0,05
0,7598 ± 0,0037
1,8540± 0,0018
III
Cô đặc lần 2
0,3058 ± 0,0020
58,20 ± 0,09
0,7434 ± 0,0026
1,7524± 0,0021
IV

Phân đoạn bằng dung môi hữu cơ
1
N-hexan
0,2980 ± 0,0032
68,52 ± 0,08
0,3063 ± 0,0017
1,2499 ± 0,0026
2
Chloroform
0,2060 ± 0,0011
70,84 ± 0,16
0,4785 ± 0,0036
2,0169 ± 0,0030
3
Ethyl acetate
0,8179 ± 0,0025
86,53 ± 0,21
2,1444 ± 0,0010
10,5862±0,0016
4
n-butanol
0,5194 ± 0,0030
80,61 ± 0,17
0,5743 ± 0,0026
2,8197 ± 0,0018
5
Dịch trong
nước còn lại
0,1748 ± 0,0050
76,55 ± 0,23

0,1812 ± 0,0040
0,8866 ± 0,0023
V
Tách qua cột lọc gel Sephadex LH 20
1
Đỉnh 1
93,2240 ± 0,0012
91,72 ± 0,25
0,9720±0,0014
4,6274 ± 0,0013
2
Đỉnh 2
93,2964 ± 0,0015
92,08 ± 0,20
0,9462 ± 0,0017
4,2743 ± 0,0011
Kết quả tinh sạch cho thấy phlorotannin từ rong mơ S. serratum
trong phân đoạn ethyl acetate có hàm lượng và độ sạch cao nhất, thuận
lợi cho việc sử dụng để đánh giá, xác định thành phần polyphenol
cũng như nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của chúng.
3.4.2. Đánh giá độ tinh sạch của phlorotannin
Các phân đoạn thu được từ quá trình tách phân đoạn bằng các dung
môi hữu cơ khác nhau và các phân đoạn thu được qua cột gel
sephadex LH 20 được dùng để đánh giá độ sạch trên sắc ký bản mỏng
và LC/MS. Kết quả đánh giá độ sạch được trình bày ở hình 3.4 ÷ 3.12.

20

Hình 3.4. Dịch chiết
ethanol trên sắc ký bản
mỏng trƣớc khi phun
thuốc thử
Hình 3.5. Dịch chiết ethanol
trên sắc ký bản mỏng sau
khi phun thuốc thử
Hình 3.6. Phân đoạn
ethyl acetate trên sắc ký
bản mỏng sau khi phun
thuốc thử


Hình 3.7. LC/MS của dịch chiết
ethanol ban đầu
Hình 3.8. LC/MS của phân đoạn
n-hexan

21


Hình 3.9. LC/MS của phân đoạn
chloroform
Hình 3.10. LC/MS của phân đoạn
ethyl acetate



Hình 3.11. LC/MS của phân đoạn
n-butanol

Hình 3.12. LC/MS của phân đoạn nƣớc
còn lại sau cùng
Phân tích ANOVA cho thấy các dữ liệu thu từ các phân đoạn 12-16
và 22-34 đều có p < 0,05. Phân đoạn 22-34 chứa hàm lượng
phlorotannin nhiều hơn nên được thu và mang phân tích NMR. Kết
quả cho thấy chất thu được tập trung ở vùng tần số thấp và mẫu thu
được sạch trên 92%. Hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy

22
hóa ở phân đoạn ethyl acetate là cao nhất so với các phân đoạn nghiên
cứu. Hoạt chất chống oxy hóa phlorotannin được chạy qua cột
sephadex LH 20 có độ tinh sạch từ 92% trở lên. Tuy nhiên, để xác
định cụ thể chất gì trong nhóm hợp chất phlorotannin (polyphenol)
cần phải có thêm một số nghiên cứu khác nữa và cần tiếp tục nghiên
cứu sâu hơn nữa ở những nghiên cứu tiếp theo.
3.4.3. Đề xuất quy trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ
S. serratum

Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thu nhận
phlorotannin từ rong mơ S. serratum ở hình 3.13.

Hình 3.13. Sơ đồ quy trình tinh chế phlorotannin từ rong S.
serratum
Nguyên liệu
rong mơ
Chiết
Thời gian: 33 giờ
Nhiệt độ: 43
0
C
Tỷ lệ DM:NL: 27:1 (v/w)
Lọc
Phân đoạn
chloroform

Phân đoạn
EtOAC

Phân đoạn n-
butanol

Phân đoạn lần
1
Cô đặc

Phân đoạn n-
hexan
Phân đoạn lần
2
Phân đoạn lần
3
Phân đoạn lần
4
Dung dịch nước
còn lại
Sắc ký
Sephadex LH
20

Hệ dung môi rửa giải:
Chloroform : methanol : acid
formic: 90:9:1
Phlorotannin
tinh

23
* Thuyết minh quy trình
+ Nguyên liệu
Rong mơ Sargassum serratum được thu mẫu ở vịnh Nha Trang -
Khánh Hòa, Việt Nam. Sau khi thu mẫu, rong mơ được làm sạch, định
danh và sấy khô đến hàm ẩm 19%. Rong mơ khô thường có hàm
lượng phlorotannin chiếm vào khoảng 0,6%.
+ Chiết
Rong mơ khô sau khi xay, được dùng để chiết phlorotannin bằng
ethanol 96%. Quá trình chiết được tiến hành theo phương pháp ngâm

chiết ở nhiệt độ 43
0
C, trong 33 giờ với tỷ lệ DM:NL 27:1 (v/w).
+ Lọc
Dịch chiết được lọc qua giấy lọc để thu dịch lọc. Dịch lọc
phlorotannin được bảo quản trong chai sẫm màu nhằm hạn chế tác
động của ánh sáng làm hư hỏng phlorotannin.
+ Cô đặc
Dịch lọc được cô đặc ở nhiệt độ 40
0
C để thu cao chiết. Sau khi cô
đặc, cao chiết được tái hòa tan bằng ethanol 99,5% và loại bỏ phần
cặn không tan trong ethanol 99,5%. Dịch tái hoà tan thu được, tiếp tục
được tái cô đặc còn lại một phần ba thể tích và bảo quản trong chai
sẫm màu. Phần dịch này sẽ được phân đoạn làm sạch bằng các dung
môi hữu cơ từ không phân cực tới phân cực mạnh ở công đoạn tiếp
theo.
+ Phân đoạn lần 1
Dịch sau khi cô đặc được tách phân đoạn bằng n-hexan để thu phân đoạn
tan trong n-hexan và tách phân đoạn trong n-hexan bảo quản trong chai sẫm
màu
.
+ Phân đoạn lần 2
Dịch còn lại sau khi tách phân đoạn n-hexan được tiếp tục tách
phân đoạn bằng chloroform để thu phân đoạn tan trong chloroform và
tách riêng phân đoạn trong chloroform bảo quản trong chai sẫm màu.
+ Phân đoạn lần 3