Biến nạp plasmid pGII0229 trgus cp148 luc vào vi khuẩn agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây jatropha curcas l

LỜI CẢM ƠN
Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin gửi
lòng biết ơn sâu sắc đến Ba-Mẹ và hai em đã luôn bên cạnh, động viên, cảm ơn cả đại
Gia đình luôn quan tâm, lo lắng cho con. Gia đình luôn là động lực giúp con vượt qua
những khó khăn trong cuộc sống.
Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí đã quan tâm, tận tình chỉ
bảo và cho em những ý tưởng, định hướng đề tài, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em
trong quá trình làm đề tài.
Em cũng xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hướng dẫn tận
tình và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu.
Xin cảm ơn những người bạn trong nhóm nghiên cứu: Tuấn, Tài, Quyết, Linh,
Hiền đã hỗ trợ tôi trong quá trình làm đề tài.
Cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ những niềm vui,
nỗi buồn cùng tôi trong suốt bốn năm đại học.
Cảm ơn tập thể lớp DH08SH đã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh viên
và luôn quan tâm, động viên nhau trong lúc làm đề tài.
Cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho
em trong bốn năm học tập tại trường. Các Thầy-Cô đã từng dạy dỗ và Quí Thầy-Cô
thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên
ngành bổ ích.
Em rất trân trọng sự giúp đỡ của ban lãnh đạo Viện cùng các anh chị làm việc tại
Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi Trường đã tạo điều kiện cho em hoàn
thành khóa luận này.
Xin cảm ơn dự án SIDA/SAREC về Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ kinh phí thực
hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!
1
TÓM TẮT
Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi
khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha cursas
L.” được thực hiện từ 15/1/2012 đến 10/7/2012 tại viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh

Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm với mục đích xác định một kỹ thuật
phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen ở thực vật, trong đó sử dụng
vi khuẩn đất Agrobacterium để chuyển gen là một trong những phương pháp hiệu quả
và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn gen ngoại lai vào tế bào một cách chính
xác và ổn định. Bằng cách đó có thể nhanh chóng tạo ra những giống cây trồng mang
tính trạng mong muốn.
Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang do Jabcobsen thiết kế mang các gen bar
kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA được ly trích từ vi
khuẩn và biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580. Vi khuẩn sau khi biến
nạp đã được sàng lọc trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycin và kiểm tra bằng
kỹ thuật PCR khuẩn lạc. Kết quả kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện của
plasmid và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực hiện việc
chuyển gen.
Hạt giống Jatropha của Úc được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển
gen. Mẫu phôi Jatropha được thu nhận từ hạt được tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau
khi biến nạp. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen như nguồn mẫu, thời
gian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone đã được khảo sát với mục đích tìm ra được
quy trình chuyển gen hiệu quả nhất. Kết quả nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính đối
với thuốc thử X-gluc khá cao ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75%.
Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt
70,87% tuy không phải là nghiệm thức cao nhất nhưng lại ít ảnh hưởng đến sức sống
của mẫu. Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn
so với mẫu phôi không tiền nuôi cấy (54,17%) và ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu
hơn.
2
Phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha đang nảy mầm với ưu điểm
không trải qua bước nuôi cấy in vivo được thực hiện bằng ba cách: tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn. Kết quả
bước đầu sau khi nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu hiện GUS từ 40 – 60%, sau khi sàng

lọc với PPT ở nồng độ 400 mg/l, thu được 5% cây giả định được chuyển gen (15 cây).
Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi lây nhiễm với mẫu chưa hiệu quả. Các loại
kháng sinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin không có khả năng loại bỏ vi khuẩn
một cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm.
3
SUMMARY
The topic: “Transfomation of plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc into
Agrobacterium tumefaciens and establishment of gene transformation protocol for
Jatropha curcas L.”.
A. tumefaciens is established as a vector for gene transfomation in many plants.
The use of Agrobacterium to transfer genes into plants could simplify the
transformation and improvement of important crop plants.
A. tumefaciens harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying β-
glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos
resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was
provided by Jacobsen. Plasmid was isolated and transformed into A. tumefaciens
strain GV3580. The presence of binary plasmid and bar gene were screened by
clonies selection on LB media supplemented with kanamycin and confirmed by
colony
’
PCR.
An efficient system for A. tumefaciens mediated transformation of Jatropha
curcas was developed in this study. Several factors affecting the transformation
efficiency were optimized, including preculture periods, usage of acetosyringone and
dipping time of explant in Agrobacterium suspension. A genetic transformation
procedure for J.curcas was established via Agrobacterium tumefaciens infection of
embryo explants. Trangenic embryo were confirmed by the GUS assay. The percent
tage of transient GUS expression was higher in 2-day precultured embryo explant
(66,67%) as compared to embryo explant (54,17%) and less impact on the vitality of
explants.

2-day precultured embryo explants were transformed by co-cultivation with
Agrobacterium. After 2 days of co-cultivation, the transient GUS expression shown in
all treatments. Results showed that positive rate for X-gluc reagent was high in all
treatments ranged from 41,67 – 75%. Concentration of acetosyringone 100 μM, co-
incubated in Agrobacterium suspension for 30 mins resulted transient GUS activity
(70,83%), was found the best treatment.
4
The germinating seeds were injected with A. tumefaciens, followed by sonication,
co-cultivation with shaking, and injection. Compared with transformation of embryo,
that of germinating seeds was simple and repeatable, since it required no prior tissue
culture steps and produced transgenic plants more efficiently. The embryo of the
germinating seed was demonstrated by the detection of β-glucuronidase activity in the
primary transformants. T
0
seedlings were screened by PPT selection at 400 mg/l.
About 5% of T
0
seedlings examined were found to be transgenic.
The elimination of the bacteria after cocultivation process was not efficient. The
antibiotic cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin could not remove bacteria effectively
lead to re-infection.
5
MỤC LỤC
Lời cảm ơn i
Tóm tắt ii
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các bảng xi
Danh sách các hình và sơ đồ xii
Phần 1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Yêu cầu 2
1.3. Nội dung thực hiện 2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về các đặc điểm cây Jatropha 3
2.1.1. Phân loại 3
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái – đặc tính sinh học 3
2.1.4. Các ưu điểm sinh học và giá trị cây Jatropha 4
2.1.4.1.Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội 4
2.1.4.2. Ý nghĩa về mặt môi trường 5
2.1.4.3. Sử dụng làm phân bón và thức ăn gia súc 5
2.1.4.4. Công dụng trong chữa trị bệnh 5
2.2. Hiện tượng biến nạp 5
2.2. Phương pháp biến nạp ở vi khuẩn 5
2.2.1. Giới thiệu về phương pháp biến nạp 6
2.2.2. Cơ chế biến nạp 6
2.2.3. Vai trò của biến nạp 6
2.3. Giới thiệu chung về phương pháp chuyển gen ở thực vật 6
2.3.1. Khái niệm 6
2.3.2. Thành phần gen chuyển nạp 7
2.3.2.1. Promoter và terminator 7
2.3.2.2. Gen thông báo 8
6
2.3.2.3. Chỉ thị chọn lọc 8
2.3.3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật 8
2.3.3.1. Chuyển nạp gen bằng phương pháp PGE 9
2.3.3.2. Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện 9
2.3.3.3. Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen 9
2.3.3.4. Chuyển gen bằng vi tiêm 10

2.3.3.5. Chuyển gen bằng phương pháp SAAT – chuyển gen gián tiếp sử dụng
Agrobacterium với sự hỗ trợ sóng siêu âm 10
2.3.3.6. Một số phương pháp chuyển gen in vivo 11
2.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và phương pháp chuyển gen thông qua vi
khuẩn Agrobacterium 12
2.4.1. Phân loại 12
2.4.2. Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh 12
2.4.3. Ti plasmid 13
2.4.3.1. Vùng T-DNA 13
2.4.3.2. Vùng gen vir 14
2.4.4. Cơ chế phân tử của quá trình xâm nhiễm và chuyển gen vào thực vật 14
2.4.5. Acetosyringone và vai trò trong quá trình xâm nhiễm 16
2.4.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen 16
2.4.6.1. Vật liệu chuyển gen 17
2.4.6.2. Dòng vi khuẩn 17
2.4.6.3. Nhiệt độ 18
2.4.6.4. Chất hoạt động bề mặt 18
2.4.6.5. Kháng sinh 18
2.4.6.6. Thời gian đồng nuôi cấy và mật số vi khuẩn 19
2.4.6.7. Các yếu tố ảnh hưởng khác 20
2.5. Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen 20
2.5.1. Phương pháp thử GUS 20
2.5.2. Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ PPT 20
2.5.3. Sử dụng PCR đánh giá kết quả chuyển gen ở thục vật 21
2.5.4. Phương pháp Southern blot xác định các gen ngoại lai trong bộ gene cây 21
2.6. Tình hình nghiên cứu cây chuyển gen tại Việt Nam 22
7
2.7. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển gen vào cây Jatropha 24
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
3.1. Thời gian và địa điểm 27

3.2. Vật liệu thí nghiệm 27
3.2.1. Giống 27
3.2.2. Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen 27
3.2.3. Hóa chất 28
3.2.3.1. Hóa chất dùng trong hệ thống tái sinh 28
3.2.3.2. Hóa chất dùng trong biến nạp và chuyển gen 28
3.2.3.3. Hóa chất phản ứng PCR 28
3.2.4. Thiết bị dùng trong thí nghiệm 28
3.3. Phương pháp thí nghiệm 29
3.3.1. Khảo sát khả năng diệt khuẩn của 3 loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và
ciprofloxacin lên chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 29
3.3.2. Tạo dòng vi khuẩn mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 30
3.3.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 30
3.3.2.2. Chuẩn bị tế bào khả nạp 31
3.3.2.3. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 31
3.3.2.4. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid và gen bar trong chủng vi khuẩn GV3580
sau khi biến nạp 32
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến sự sinh trưởng của cây Jatropha in vivo 33
3.3.4. Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn A. tumefaciens 34
3.3.4.1. Chuẩn bị vi khuẩn 34
3.3.4.2. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phôi J.curcas 34
3.3.4.3. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm 36
3.3.5. Xử lý số liệu 37
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
4.1. Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của ba loại kháng sinh 38
4.2. Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang gen bar 41
4.2.1. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong vi khuẩn 41
4.2.2. Kết quả biến nạp plasmid vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 42
4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng cây Jatropha in vivo 43
8

4.4. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào phôi 44
4.4.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy lên
hiệu quả chuyển gen 44
4.4.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và nồng độ
acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens 46
4.5. Kết quả chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm 49
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52
5.1 Kết luận 53
5.2. Đề nghị 53
TÀI LIÊU THAM KHẢO 55
Phụ lục
9
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
J. curcas Jatropha curcas Linn
bxn bromoxynil nitrilase
nptII neomycin phospho transferase
AS Acetosyringone
PAT phosphinothricin acetyl transferase
PEG polyethylene glycol
IBA Indolebutyric acid
BA 6-benzyl adenin
GA3 Gibberellic acid
NT Nghiệm thức
BAP 6-benzyl aminopurine
NAA α-naphthaleneacetic acid
IAA indole-3-acetic acid
Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid
vir Virulence
OD Mật độ quang (Optical density)

PPT DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid
gusA β–glucuronidase
X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide
DNA Deoxiribonucleic Acid
PCR Polymerase Chain Reaction
bp base pair
g gram
mg miligram
l lit
ml mililit
µl microlit
mM miliMol
µM microMol
10
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR 32
Bảng 3.2 Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 33
Bảng 4.1 Kết quả rửa mẫu với ba loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và
cyprofloxacin ở các nồng độ và thời gian khác nhau 40
Bảng 4.2 Nồng độ plasmid ly trích từ vi khuẩn Agrobacterium chủng EHA101 43
Bảng 4.3 Kết quả biểu hiện GUS ở mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy 45
Bảng 4.4 Kết quả nhuộm GUS ở các nghiệm thức chuyển gen 47
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha nảy mầm 50
11
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L. 3
Hình 2.2 Chuyển gen bằng phương pháp SAAT 11
Hình 2.3 Vi khuẩn A. tumefaciens 12
Hình 2.4 Cấu trúc của Ti Plasmid 13
Hình 2.5 Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens 16

Hình 2.6 Phản ứng tạo màu X-gluc dưới tác dụng của enzyme β–glucuronidase 20
Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 27
Hình 3.2 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 27
Hình 3.3 Quy trình khử trùng hạt Jatropha 29
Hình 3.4 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 32
Hình 3.5 Sơ đồ các bước quy trình nhuộm GUS 35
Hình 4.1 Kết quả điện di plasmid pGII0229 từ vi khuẩn 41
Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 42
Hình 4.3 Kết quả của phản ứng PCR khuẩn lạc khuếch đại gen bar 43
Hình 4.4 Kết quả thử PPT trên cây Jatropha 3 tuần tuổi 44
Hình 4.5 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy 45
Hình 4.6 Mẫu phôi Jatropha đồng nuôi cấy 2 ngày với vi khuẩn 46
Hình 4.7 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày 48
Hình 4.8 Mẫu phôi Jatropha ở nồng độ acetosyringone và thời gian khác nhau 49
Hình 4.9 Biểu hiện GUS khi tiến hành xâm nhiễm vào hạt 51
Hình 4.10 Cây Jatropha sau khi được sàng lọc bằng ở nồng độ PPT 400 mg/l 52
12
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 . Đặt vấn đề
Bước vào thế kỷ 21, thế giới phải đối diện với hai mối lo lớn là lương thực và
năng lượng. Kỹ thuật tạo giống cổ điển kiểu Mendel đòi hỏi nhiều thời gian và phải
trải qua nhiều thế hệ mới có thể chọn lọc được những tính trạng mong muốn. Công
nghệ biến đổi gene trên cây trồng ra đời cho phép nhanh chóng tạo ra giống mới có
năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt bằng cách cùng
lúc đưa vào những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ hàng gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen ở thực vật như: bắn gen, vi
tiêm, phương pháp polyethylene glycol, v.v. mỗi phương pháp có ưu điểm riêng tùy
vào loại cây. Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen vào thực vật là một
trong những phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn gen

ngoại lai vào tế bào một cách chính xác và ổn định. Vì vậy đây là một phương pháp
được lựa chọn cho các nghiên cứu cơ bản về thực vật, là kỹ thuật chính để tạo ra cây
chuyển gen trong lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp (Stafford, 2000; Gelvin,
2003). Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển những gen có ý nghĩa kinh tế vào cây
trồng, kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của
gen. Tuy nhiên hiệu quả chuyển gen vào mô thực vật bằng Agrobacterium chịu ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố, và quy trình tái sinh cây chuyển gen rất khó, tốn thời gian,
cây dễ sinh những biến dị bất thường (Larkin và Scowcroft, 1981) và thường mất khả
năng sinh sản (Scholl và ctv, 1981; Ulianietal và ctv, 1996).
Những năm gần đây, nhu cầu năng lượng ngày càng tăng, trong khi nguồn năng
lượng chính là dầu mỏ đang cạn kiệt dần. Vì vậy cần nghiên cứu phát triển và sớm
đưa vào khai thác cũng như sử dụng các nguồn năng lượng mới.
Diesel sinh học được chiết xuất từ hạt cây cọc rào được xem là một nguồn nhiên
liệu sạch có thể thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt dần. Cây
Jatropha curcas với một số ưu điểm so với các loài cây cho dầu khác vì có thể chịu
được điều kiện khắc nghiệt. Việc phát hiện ra cây Jatropha curcas đã tạo ra một bước
tiến lớn trong lĩnh vực năng lượng và nhiên liệu mới.
13
Tuy nhiên việc phổ biến và ứng dụng dầu của Jatropha còn thấp do giới hạn về
năng suất dầu chứa trong hạt thấp. Đến nay năng suất hạt của Jatropha vẫn còn là vấn
đề khó khăn, phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác nhau như môi trường (Openshaw,
2000), đặc điểm phân nhánh của cây (Achten và ctv, 2009), di truyền học (Ginwal và
ctv, 2004), và chăm sóc (Gour, 2006). Sản lượng hạt bị hạn chế bởi một số yếu tố môi
trường (abiotic stresses), đặc biệt là lạnh và hạn hán. Vì vậy đòi hỏi cần có các công
cụ di truyền, chọn giống hiệu quả.
Từ những lý do trên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium để chuyển gen vào cây Jatropha là hướng đi cần thiết. Đề tài: “Biến
nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy
trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha curcas L.” được thực hiện nhằm xác định kỹ
thuật phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao. Từ nghiên cứu này,

có thể phát triển các nghiên cứu chuyển nạp những gen khác vào cây Jatropha nhằm
cải thiện năng suất, tăng sản lượng dầu trong hạt và tăng tính chống chịu của cây
Jatropha curcas L.
1.2. Yêu cầu
- Biến nạp thành công plasmid pGII0229 cp148 luc vào chủng vi khuẩn A.
tumefaciens GV3580.
- Lây nhiễm chủng vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 đã được biến nạp plasmid
thành công với mẫu cây cọc rào ( J. curcas L.).
- Kiểm chứng kết quả chuyển gen vào mô cây Jatropha bằng kỹ thuật nhuộm GUS.
1.3. Nội dung thực hiện
- Khảo sát khả năng diệt vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA101 của ba loại kháng
sinh cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin.
- Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc.
- Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus
cp148 luc vào mẫu phôi và mẫu hạt nảy mầm, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu
quả biến nạp.
- Phân tích mẫu đã tiến hành chuyển gen bằng phương pháp nhuộm GUS.
- Khảo sát nồng độ PPT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây Jatropha in vivo.
14
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về các đặc điểm của cây Cọc rào
2.1.1. Phân loại khoa học
Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Họ : Euphorbiaceae
Chi : Jatropha
Loài : Jatropha curcas Linn.

Tên tiếng Anh : Physic nut

Tên tiếng Việt : Dầu mè, cọc rào, dầu lai
Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L.
(en.wikipedia.org/wiki/Jatropha_curcas)
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Cây Jatropha curcas L., thuộc chi Jatropha, họ Thầu dầu. Chi Jatropha là một
chi có khoảng 175 loài cây thân mọng, cây bụi hay cây thân gỗ có nguồn gốc từ tiếng
Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) và trophé (thức ăn), thể hiện công dụng làm
thuốc của cây này. Curcas là tên gọi thông thường của cây Physic nut ở Malabar, Ấn
Độ. Tên thông dụng ở các nước hiện nay là Jatropha, ở Việt Nam gọi là cây Cọc giậu,
Cọc rào, Bã đậu nam, Dầu mè, v.v. (Nguyễn Công Tạn, 2008).
Jatropha là một loài cây có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy
nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ. Loài Jatropha dại phân bố nhiều ở vùng
thung lũng á nhiệt đới khô nóng và vùng rừng mưa nhiệt đới ẩm, thường ở vùng đồi
núi, đất dốc thung lũng có độ cao 700 – 1600 m so với mực nước biển. Sau đó chúng
được người Bồ Đào Nha đưa qua Cape Verde, rồi lan truyền sang châu Phi, châu Á,
sau đó được trồng ở nhiều nước, trở thành cây bản địa ở khắp các nước nhiệt đới, cận
nhiệt đới trên toàn thế giới (Nguyễn Công Tạn, 2008).
2.1.3. Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học
Jatropha là cây bụi, gỗ nhỏ, có thể cao đến 5 m. Cành xòe, có nhựa mủ, trên cành
có những vết sẹo. Thân, vỏ, lá có nhựa nhớt, không màu. Lá mọc so le, hình trái xoan,
hơi tròn, chia 5 – 7 thùy nông với chiều dài và rộng khỏang 6 – 15 cm. Phiến lá dạng
15
giấy lụa (Nguyễn Công Tạn, 2008). Cụm hoa tận cùng có màu vàng. Hoa đơn tính,
cùng gốc, đôi khi có hoa lưỡng tính. Bộ nhị 10, xếp thành hai vòng riêng biệt, mỗi
vòng 5, tạo thành cột đơn gần nhau. Bộ nhụy có 3 vòi nhụy, dính với nhau ở khoảng
2/3 chiều dài, phần trên rời nhau và núm nhụy rẽ đôi (Dehgan và Webster, 1979). Quả
non hình trứng, lúc chín màu vàng, sau nâu xám, chứa hạt màu đen.
Cây Jatropha ưa ánh sáng, ưa khí hậu ấm áp, chịu khô hạn, có thể sống trong môi
trường có lượng mưa trung bình năm 520 - 2000 mm, nhiệt độ bình quân năm 11 – 28
o

C. Cây chịu được đất xấu, đất sỏi, đất đá vôi bạc màu, v.v Cây Jatropha nảy chồi rất
dễ, có thể giâm hom, nếu trồng bằng hạt, cây có rễ chính và 4 rễ ngang, nếu giâm hom
thì không có rễ chính (Nguyễn Công Tạn, 2008).
Cây Jatropha sinh trưởng nhanh, sau khi trồng 3 năm, cây cao 3 m, sau trồng 1
năm thì cây bắt đầu ra hoa. Thời gian ra quả bình thường là 6 – 20 năm, ít thấy hiện
tượng ra quả cách năm. Ra hoa từ tháng 3 đến giữa tháng 4, thời gian ra hoa kéo dài 4
– 5 tháng, chín vào tháng 8 – 9, quả khó rụng.
2.1.4. Các ưu điểm sinh học và giá trị của cây Jatropha
Jatropha là loài cây mà hiện nay được các nhà khoa học đánh giá rất cao vì các
ưu điểm sinh học và giá trị của cây.
2.1.4.1. Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội
Phát hiện quan trọng nhất từ Jatropha là lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất dầu
diesel sinh học (biodiesel). Cây Jatropha có chu kỳ sống lâu có thể lên đến 50 năm,
cho quả, hạt sớm, hàng năm năng suất có thể đạt đến 10 – 12 tấn/ha nếu trồng trên đất
tốt và đầu tư cao (chăm sóc, bón phân, tưới tiêu, v.v.), hàm lượng dầu trong hạt cao
trung bình 32 – 35%. Đây là nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học rất tiềm năng để
dần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt. Từ hạt
Jatropha ép ra dầu thô, từ dầu thô tinh luyện được diesel sinh học và glycerin. Mặc dù
diesel sinh học được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: cải dầu, hướng dương, dầu
cọ, mỡ động vật, v.v. nhưng sản xuất từ Jatropha có giá thành rẻ nhất và chất lượng
tốt tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống. Nếu 1 ha Jatropha đạt năng
suất 8 – 10 tấn hạt/ha/năm có thể sản xuất được 3 tấn diesel sinh học. Loại dầu này sẽ
thay thế được một phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu được lượng
khí thải gây hiệu ứng nhà kính, là loại dầu cháy hết và có ít lưu huỳnh, là loại dầu
sạch, thân thiện với môi trường.
16
Jatropha còn tạo ra hiệu ứng xã hội rất lớn. Do trồng ở các vùng miền núi nghèo,
cây Jatropha sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập khả quan cho đồng bào các dân tộc.
Trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chưa tìm kiếm được
bất cứ cây gì khả dĩ trồng được trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trường ổn

định (Nguyễn Công Tạn, 2008).
2.1.4.2. Ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường
Jatropha là cây lâu năm, phủ đất rất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển
được ở hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, gia súc không ăn.
Vì vậy, cây Jatropha trồng trên các vùng đất dốc sẽ được coi là cây “lấp đầy” lỗ hổng
sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực bì dày đặc
chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì của đất. Không những vậy, Jatropha còn
có thể trồng ở những vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần
phục hồi hệ sinh thái các vùng này. Vì vậy, cây Jatropha được đánh giá là “vệ sĩ sinh
thái”, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trường (Nguyễn Công Tạn, 2008).
2.1.4.3. Sử dụng làm phân bón và thức ăn cho gia súc
Hạt Jatropha sau khi ép dầu, hơn 30% là sản phẩm dầu, gần 70% là khô dầu, có
hàm lượng protein khoảng 30%, hàm lượng N 4,14 – 4,78%, P
2
O
5
0,50 – 0,66%, CaO
0,60 – 0,65%, MgO 0,17 – 0,21% dùng làm phân hữu cơ rất tốt, nếu khử hết độc tố có
thể làm thức ăn gia súc cao đạm (www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn).
2.1.4.4. Công dụng trong chữa trị bệnh
Trong thành phần cây Jatropha, đã phân tích được những hợp chất chủ yếu như
tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid. Nhiều bộ phận của cây này có thể
chữa bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Trong cây JCL có một số độc tố, nhất là
phytotoxin (curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể cung cấp cho
chúng ta một loại dược liệu mới (www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn).
2.2. Phương pháp biến nạp ở vi khuẩn
2.2.1. Giới thiệu về phương pháp biến nạp
Biến nạp là phương pháp chuyển gen nhờ sự thu nhận các DNA tự do trong môi
trường xung quanh của thể nhận, đây là phương pháp đơn giản nhất để đưa DNA tái
tổ hợp vào tế bào vật chủ.

Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Ferderrick Griffith mô tả năm 1928, trong
thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Một số vi khuẩn có
17
khả năng hấp thụ DNA một cách tự nhiên. Tuy nhiên, chúng chỉ có thể thực hiện
được điều đó vào một thời kỳ cụ thể trong chu kỳ sinh trưởng khi chúng tạo ra một
loại protein đặc biệt gọi là yếu tố khả biến. Ở giai đoạn này, vi khuẩn được gọi là khả
nạp. Một số loài vi khuẩn không có khả năng thu nhận DNA một cách tự nhiên nhưng
ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro bằng cách ngâm các tế bào vào dung dịch calcium
chloride lạnh đông. Việc biến nạp đoạn DNA vào tế bào khả nạp được thực hiện bằng
nhiều kỹ thuật khác nhau:
- Biến nạp bằng sốc nhiệt
- Biến nạp bằng vi tiêm
- Biến nạp bằng hóa chất
- Biến nạp bằng xung điện
2.2.2. Cơ chế của biến nạp
Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào được là do trong một giai
đoạn tăng trưởng nào đó của tế bào, trên bề mặt tế bào có hiện diện những điểm tiếp
nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (compentent factor). Nhân tố này có khả năng
tiếp nhận đoạn ngắn từ môi trường ngoài để đưa vào trong tế bào vi khuẩn, nhờ đó
xảy ra tái tổ hợp.
Muốn thực hiện được biến nạp phải có đủ 2 điều kiện là trong môi trường phải có
các đoạn DNA và khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận. Quá trình biến nạp
gồm 5 giai đoạn :
- Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận
- Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận
- Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tương đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận
- Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp
- Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp
2.2.3. Vai trò của biến nạp
Biến nạp trong tự nhiên có thể làm gia tăng độc tính. Ngoài ra biến nạp còn được

sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Hiện tượng biến nạp giúp các loài vi khuẩn
có thêm tính mới dễ thích nghi với môi trường sống. Đó là cở sở tiến hóa và đa dạng
của vi sinh vật.
2.3. Giới thiệu chung về phương pháp chuyển gen ở thực vật
2.3.1. Khái niệm
18
Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào cơ thể sinh vật. Những
thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng
đối với việc chuyển nạp gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền
mới (Uchimiya và ctv, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.2. Thành phần của gen chuyển nạp
2.3.2.1. Promoter và terminator
Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình
tự thích hợp đi kèm theo nó. Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng. Hiện
nay, promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một trong những
promoter mạnh và được sử dụng phổ biến nhất. Theo Heldt (1997) (trích dẫn bởi Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) promoter này bao gồm các enhancer có khả
năng phiên mã ở mức độ cao.
Terminator giúp đảm bảo gen được chuyển kết thúc đúng vị trí và không tạo
những protein thể khảm với các protein từ thực vật. Có rất nhiều terminator có tiềm
năng đã được tìm ra nhưng terminator nos (được thu nhận từ gen tổng hợp nopaline
của Ti plasmid trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) vẫn là terminator thông
dụng nhất (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.2.2. Gen thông báo (reporter gene)
Bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp gen gián tiếp bằng vi
khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vẫn cần một
phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai (Jacobsen, 2007).
Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông
báo. Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào
đó rất dễ phát hiện trong cây giúp nhận biết tế bào hoặc thể chuyển gen và cho phép

đo lường mức độ biểu hiện của gen ngoại lai. Gen gusA của vi khuẩn E.coli thường
được sử dụng làm gen thông báo. Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase.
Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành
sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng. Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–
chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc). Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase
19
không tồn tại trong thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen
thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh
hưởng của pH môi trường nên thuận tiện cho việc theo dõi. Ngoài ra còn có gen phát
sáng gfp hoặc gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase (CAT), gen lux mã
hóa cho luciferase được lấy từ đom đóm (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.2.3. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)
Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đã
nhận gen mục tiêu và nuôi cấy trên môi trường tái sinh. Vì vậy tất cả các plasmid đều
phải có ít nhất một gen chọn lọc để giúp quan sát và chọn lọc những cây chuyển gen
thành công. Các gen này thường mã hóa cho một enzyme có khả năng khử độc tính
của chất chọn lọc như kháng sinh (nptII, hpt…) hoặc thuốc diệt cỏ (bar hay pat) trong
quá trình chuyển hóa. Khi các gen chọn lọc biểu hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục
sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh
hay thuốc diệt cỏ. Ngoài ra, chúng còn được dùng để phân tích bộ gen của cây được
chyển gen nhằm xác định việc đoạn DNA đưa vào có hiệu quả hay không.
Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen nptII mã hóa enzyme neomycin
phospho transferase II. Enzyme này sẽ xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh
kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này. Một chỉ thị chọn lọc phổ biến khác là gen
hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng
sinh hygromycin. Gen hph tỏ ra rất thành công trên cây bắp (Walters và ctv, 1992),
cây lúa (Christon và ctv, 1991; Li và ctv, 1993) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 2004).
Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng
thời cũng là một chỉ thị chọn lọc. Gen bar mã hóa cho enzyme phosphinothricin

acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là thành phần chính
trong thuốc diệt cỏ Basta. Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme phospho mannose
isomerase đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc. Gen này hoạt động trên cơ sở phản
ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose. Điều này đã mở ra một triển
vọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt
20
cỏ trong quá trình chọn lọc (Hòa và Bổng, 2002) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật
Có nhiều phương pháp được phát triển để có được cây trồng chuyển gen. Phương
pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn A. tumefaciens ngày càng được sử dụng phổ
biến nhờ vào sự cải tiến không ngừng hệ thống Ti–plasmid. Bên cạnh đó còn có các
phương pháp chuyển gen trực tiếp khác như phương pháp PEG (polyethylene glycol),
phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp sử dụng xung điện
(electroporation), phương pháp bắn gen (biolistic) và một vài kỹ thuật mới.
2.3.3.1. Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)
Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật.
Phương pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA dựa trên
nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập
gen lạ vào tế bào. Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi
4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG,
kết quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp (trích dẫn bởi Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.3.2. Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn
trong một điện trường cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần
chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2004). Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gen
trên cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyết
được về mặt kỹ thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen

thành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và
ctv, 1989), trên cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu (Guerche và ctv,
1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
21
2.3.3.3. Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)
Phương pháp bắn gen được John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein và
ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Đây là phương
pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng. Ưu điểm của phương pháp này là có thể
áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần vector hai
nguồn (binary vector) và quy trình vận hành tương đối đơn giản.
Hiện nay có 3 loại dụng cụ bắn gen khác nhau:
- Loại 1: là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ nhờ một
kim hỏa (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
- Loại 2: hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân tử bằng
vàng cực mịn (DNA–coated gold particles) (Christou và ctv, 1988) (trích dẫn bởi Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
- Loại 3: hoạt động bằng áp suất của khí từ một xi lanh chứa khí trơ như helium hoặc
nitrogen. Vận tốc của vi đạn khi bắn bằng dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với loại
1 nhưng nó tỏ ra rất có hiệu quả trong trường hợp chuyển plasmid DNA vào tế bào
cây trồng (Cao và ctv, 1991) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004) trong quy trình bắn gen trước tiên
bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn lên
viên đạn plastic. Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng các
hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào tế
bào. Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các chất
chọn lọc thích hợp. Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 – 7 ngày nuôi cấy còn các
mô không nhận gen sẽ chết trong môi trường chọn lọc.
2.3.3.4. Phương pháp vi tiêm
Vi tiêm (microinjection) là phương pháp tiêm trực tiếp DNA vào nhân của tế bào
phôi bằng cách sử dụng micropipette để tiêm dung dịch DNA lạ vào tế bào trần dưới

áp lực cao, tạo ra những cây chuyển gen (Neuhaus và ctv, 1987; De la Pẽna và ctv,
22
1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Phương pháp này đòi
hỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao tác dưới kính hiển vi và sự khéo
léo, chính xác tiêm một lượng rất nhỏ dung dịch DNA.
2.3.3.5. Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated
transformation) – chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với sự
hỗ trợ sóng siêu âm
Phương pháp SAAT là phương pháp biến đổi gen dựa trên phương pháp chuyển
gen gián tiếp nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium. Mô đích sẽ được xử lý trong một thời
gian ngắn cùng với sự hiện diện của vi khuẩn. Sóng siêu âm sẽ tạo rất nhiều vết
thương nhỏ và đồng đều trên mô cây, cho phép Agrobacterium xâm nhiễm dễ dàng và
do đó sẽ làm gia tăng hiệu quả biến nạp. Đây là phương pháp khá hữu hiệu, đơn giản,
rẻ tiền làm gia tăng hiệu quả biến nạp vào mẫu mô cây có hiệu quả chuyển gen thấp
(Liu và ctv, 2005).
Theo Trick và Finer (1997), các mô xử lý SAAT cho thấy sự tăng mạnh của biểu
hiện GUS so với các mô chỉ ủ khuẩn thông thường. Tùy theo loại mô, thời gian đáp
ứng cũng khác nhau, có thể từ vài giây đến vài trăm giây. Các mô đáp ứng ở diện
rộng với thời gian xử lý SAAT. Vì thế, thời gian xử lý tối ưu là khi xử lý thời gian
ngắn nhất và cho hiệu quả cao nhất.
23
Hình 2.2 Chuyển gen bằng phương pháp SAAT; A. xử lý mẫu; B. kết quả nhuộm GUS
hạt đầu nành được xử lý bằng SAAT
(www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/sonicate.htm)
Từ năm 1974, Miller và ctv ứng dụng phương pháp chuyển gen SAAT trên mô rễ
cây Vicia faba; đến năm 1990 Joersbo và Brunstedt chuyển vào protoplast của
Nicotiana tabacum và Beta vulgaris, Trick và Finer thực hiện trên cây đậu nành, bắp,
lúa mì vào năm 1997, v.v Gần đây, một số nghiên cứu của Zaochang Liu và ctv
(2005) trên hạt Phaseolus vulgaris L., Byong-Jin Park và ctv (2005) trên Raphanus
sativus L. đã kết hợp SAAT với phương pháp thấm hút chân không, tạo điều kiện cho

A. tumefaciens xâm nhiễm, làm tăng khả năng biến nạp. Sự kết hợp các phương pháp
tỏ ra rất hữu hiệu, nhất là trên các loại cây khó chuyển nạp gen (trích dẫn bởi Liu và
ctv, 2005).
2.3.3.6. Một số phương pháp chuyển gen in vivo
Phương pháp Floral-dip: Ở phương pháp này, cây chuyển gen được tạo ra bằng
cách ngâm hoa trực tiếp vào dịch khuẩn A. tumefaciens. Ưu điểm của phương pháp
này là không cần phải nuôi cấy in vitro, do đó có thể loại trừ nguy cơ biến dị sôma
(Clough và ctv, 1998). Phương pháp này còn thành công trên cây Arabidopsis
thaliana với mô mục tiêu là hạt và hạt phấn của hoa chưa trưởng thành. (Ye và ctv,
1999; Desfeux và ctv, 2000) (trích dẫn bởi Sarma và ctv, 2004).
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn: Phương pháp này được xem là một
phương pháp không trải qua nuôi cấy mô. Chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn
đã được nhóm Ray Wu, Đại học Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếp
theo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của hai tác giả Trung Quốc Duan và
Chen (1985). Đây là phương pháp sử dụng ống phấn trong việc chuyển vector mang
gen đi cùng tế bào sinh dục đực (tinh tử) kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang gen
ngoại lai vào tế bào noãn. Sau đó, hợp tử nhận được gen đích sẽ phát triển thành hạt
chuyển gen. Hạt nảy mầm và phát triển thành cây chuyển gen và được di truyền cho
các thế hệ sau. Chuyển gen qua ống phấn tốt nhất thực hiện ngay sau khi quá trình thụ
tinh xảy ra ở noãn, nhưng tế bào sinh dục cái chưa kịp phân chia. Sự chuyển gen sẽ
được thực hiện đối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và sau khi tái sinh cây
24
sẽ tránh xuất hiện thể khảm. Gen sau khi được chuyển được kiểm tra hoạt động của
gen đã chuyển, chọn lọc thể chuyển gen. Sau đó thực hiện giao phấn chéo một vài thế
hệ, kết hợp với chọn lọc tạo các giống chuyển gen có tính ổn định di truyền cao.
Phương pháp chuyển gen vào hạt nảy mầm: Phương pháp xâm nhiễm A.
tumefaciens vào hạt nảy mầm được thực hiện từ rất sớm trên một số đối tượng như
Arabidopsis thaliana (Feldmann và Mark, 1987), đậu nành (Chee và ctv, 1989), ngô
(Wang và ctv, 2007). Cây chuyển gen thu được bằng cách này chính là nhờ vi khuẩn
xâm nhiễm vào vùng tế bào chưa phân hóa như vùng chồi đỉnh, vùng đốt lá mầm của

hạt đang nảy mầm. Chỉ cần một số tế bào được chuyển gen, sau đó sẽ phân chia, biệt
hóa thành cây chuyển gen. Hiệu quả chuyển gen sẽ cao hơn khi trên vùng chưa phân
hóa xuất hiện những vết thương tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm dễ dàng hơn
(Chee và ctv, 1989).
2.4. Vi khuẩn A. tumefaciens và phương pháp chuyển gen thông qua
Agrobacterium
2.4.1. Phân loại
Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Phylum) : Proteobacteria
Lớp (Class) : Alpha Proteobacteria
Bộ (Order) : Rhizobiales
Họ (Family) : Rhizobiaceae
Chi (Genus) : Agrobacterium
Loài (Species) : A. tumefaciens

2.4.2. Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh
Agrotumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que (rộng 0,6 - 1,0 µm, dài
1,5 - 3,0 µm) di động, không sinh bào tử, sống tự do trong đất, tăng trưởng tối ưu từ
25 - 28
o
C. Khi tăng trưởng trên môi trường có carbohydrate thường tạo ra lớp nhầy
polysaccharide ngoại bào dồi dào.
A. tumefaciens có cấu trúc bộ gen đặc biệt gồm 2 nhiễm sắc thể (1 nhiễm sắc thể
vòng và 1 nhiễm sắc thể dạng sợi thẳng) và 2 plasmid dạng vòng, tổng cộng có
khoảng 5400 gen. Trong đó Ti plamid (Ti: tumor inducing) dài hơn 200 kb đóng vai
25