khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn bacillus megaterium vl2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM
CỦA VI KHUẨN Bacillus megaterium VL2







CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN HỒNG THẢO
MSSV: 3102863
LỚP: CNSH K36



Cần Thơ, Tháng 5/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM
CỦA VI KHUẨN Bacillus megaterium VL2

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN HỒNG THẢO
MSSV: 3102863
LỚP: CNSH K36





Cần Thơ, Tháng 5/2014

PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN



Bùi Thị Minh Diệu Trần Hồng Thảo

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)










LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh
đạo Vện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
học tập suốt bốn năm qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, bổ sung
kiến thức và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp này.
Xin gửi lời chân thành cảm ơn đến các Thầy cô, cán bộ của Viện và các anh chị
cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Phòng thí nghiệm Hóa sinh Thực

phẩm - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ
đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài này.
Xin cảm ơn ba mẹ, anh chị và các bạn lớp công nghệ sinh học khóa 36, đã động
viên, khuyến khích, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ, ngày 4 tháng 5 năm 2014


Trần Hồng Thảo










Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


TÓM LƢỢC
Lông gia cầm là phế phẩm được sinh ra từ hoạt động chăn nuôi và giết mổ. Là
một chất thải khó phân hủy bởi thành phần chính là keratin, lông gia cầm có ảnh
hưởng xấu tới môi trường. Sử dụng vi sinh vật để phân hủy keratin có trong lông gia
cầm là một hướng đi mới, không những giải quyết được vấn đề môi trường mà còn sử

dụng sản phẩm tạo thành để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Kết quả nghiên cứu “
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm
của vi khuẩn Bacillus megaterium VL2” cho Bacillus megaterium VL2 có khả năng
phân hủy tốt bột lông ở những điều kiện môi trường phù hợp. Thời gian nuôi cấy tối
ưu của dòng vi khuẩn này là 3 ngày. Tại mức nhiệt 50
o
C và pH 9 vi khuẩn có khả năng
phân hủy bột lông cao nhất so với các mức còn lại. Vi khuẩn phát triển tốt khi môi
trường nuôi chứa rỉ đường, bột đậu nành, nhưng khả năng phân hủy lông lại không
cao. Khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác như sucrose, NH
4
Cl, Yeast extract vào
môi trường nuôi cấy thì đều làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột
lông của vi khuẩn so với việc môi trường chỉ chứa nguồn dinh dưỡng duy nhất là bột
lông.
Từ khóa: Bacillus megaterium, keratin, lông gia cầm











Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1
1.1.Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lƣợc về chất thải lông vũ 2
2.2. Keratine 4
2.3. Enzyme keratinase 5
2.4. Vi sinh vật phân giải keratin 6
2.4.1. Sơ lược vi sinh vật phân giải keratin 6
2.4.2. Vi khuẩn Bacillus megaterium 7
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của vi
sinh vật 8
2.5.1. Các yếu tố vật lý 8
2.5.2. Thành phần môi trường nuôi cấy 9
2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 11
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 11
2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. 11
CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 14
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

3.2. Phương tiện nghiên cứu 14
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 14
3.2.2. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân hủy keratin 14
3.2.3. Hóa chất 16
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn 16
3.3.2. Chuẩn bị lông gia cầm 16
3.3.3 Thí nghiệm 1. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 17
3.3.4 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và
khả năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 17
3.3.5 Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự phát triển và khả
năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 18
3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả
năng phân huỷ bột lông của vi khuẩn 19
3.3.7 Phương pháp xác định tỉ lệ bột lông bị phân huỷ 20
3.3.8. Phương pháp xác định mật số vi khuẩn 20
3.3.9. Phương pháp xử lý số liệu 21
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1. Sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 22
4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông
của vi khuẩn 23
4.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự phát triển và khả năng phân huỷ bột lông
của vi khuẩn 27

4.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của
vi khuẩn. 29
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
5.1. Kết luận 31
5.2. Đề nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


PHỤ LỤC 1

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần acid amin có trong lông vũ………………………………………4
Bảng 2: Thành phần môi trường tăng sinh khối………………………………………15
Bảng 3: Thành phần môi trường lỏng……………………………………………… 16
Bảng 4: Thành phần môi trường đặc………………………………………………….16
Bảng 5: Mật số và % bột lông bị phân hủy của vi khuẩn theo các mức pH và nhiệt độ
khác nhau. 25
Bảng 6: Kết quả thí nghiệm 1 ……………………………………………………… 40
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm 2 ……………………………………………………… 41
Bảng 8: Kết quả thí nghiệm 3 ……………………………………………………… 42
Bảng 9: Kết quả thí nghiệm 4…………………………………………………………42

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


TỪ VIẾT TẮT

B. Bacillus
BSM Basal salt medium
CFU colony-forming unit
EDTA Ethylene Diamin Tetra Aceticacid
PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
PTN Phòng thí nghiệm
rpm Rotation per minute
rRNA Ribosomal ribonucleotide acid
w/v Weight/volum
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Chăn nuôi là một trong những ngành sản xuất chủ đạo của nước ta. Việc phát

triển chăn nuôi không những đảm bảo được vấn đề thực phẩm mà còn mang lại cho
người dân một cuộc sống tốt hơn. Tuy nhiên, đi cùng với sự phát triển thì chăn nuôi
cũng mang đến một vấn đề rất đáng quan tâm đó là môi trường vì lượng chất thải hằng
năm của ngành này rất lớn. Trong các loại chất thải từ ngành chăn nuôi thì chất thải
lông gia súc – gia cầm khó xử lý nhất vì thành phần của chất thải loại này chủ yếu là
keratin, một loại protein cần rất nhiều thời gian để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên.
Ngày nay, thay vì đốt, chôn lấp hay thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường gây ra
những ảnh hưởng tiêu cực như trước đây thì trong công nghiệp người ta đã xử lý phần
lớn lông thải ra ở nhiệt độ và áp suất cao để sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong
thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá
và do quá trình xử lý nhiệt độ và áp suất phá huỷ một số axit amin (như cysteine) làm
mất cân bằng các axit amin thiết yếu. Vì vậy, việc tìm ra một biện pháp vừa có thể xử
lý được môi trường, vừa có thể tận dụng được nguồn chất thải này để thay thế những
protein đắt tiền trong sản xuất thức ăn chăn nuôi là một mục tiêu khả thi và vi sinh vật
chính là chìa khóa cho những nghiên cứu này. Nhiều dòng vi khuẩn phân hủy keratin
đã được phân lập, trong đó dòng vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus megaterium VL2 được
tuyển chọn trong 12 dòng vi khuẩn đã phân lập từ các mẫu chất thải ở lò giết mổ gia
cầm thuộc huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long. Sự phát triển và khả năng phân hủy cơ
chất của chúng chịu ảnh hưởng của các yếu tố có trong môi trường. Do đó, đề tài “
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm
của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2” được thực hiện.

1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định được các yếu tố nhiệt độ, pH, nguồn nitơ, carbon phù hợp cho sự phát
triển và khả năng phân hủy bột lông của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2.


Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về chất thải lông vũ
Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông vũ, trong đó chủ yếu là β-keratin.
Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông vũ được thải ra từ ngành chăn nuôi
và chế biến gia cầm, gây ra vấn đề môi trường đồng thời làm lãng phí nguồn protein
(Gousterova et al., 2005). Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh khiết đồng thời
được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông vũ là nguồn nguyên liệu thay thế tiềm
năng cho các thành phần dinh dưỡng đắt tiền trong thức ăn gia súc. Tuy nhiên, việc
sản xuất lông vũ làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng
rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế.
Không những tiêu tốn nhiều năng lượng và không thân thiện với môi trường, quy trình
sản xuất này phá hủy một số acid amin, làm cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn
về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons, 1997).

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


Bảng 1. Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ
Protein và các acid amin
Hàm lượng (g/kg)
Protein
Alanine
Glycine
Isoleucine
Leucine
Valine
Phenyalanine
Arginine
Histidine
Lysine
Aspartic acid
Glutamic acid
Serine
Thereonine
Proline
Cystine
Methionine

922,0
28,8
51,8

39,4
56,9
53,0
34,6
67,6
2,3
15,4
41,8
82,2
87,3
34,5
73,9
65,8
7,1
(Latshaw et al, 1994)





Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


2.2. Keratine
Keratin là một loại protein dạng sợi, có khả năng hình thành màng bảo vệ cho
toàn bộ động vật có xương sống. Là thành phần chính cấu tạo nên: da, lông, tóc, vuốt,
móng, sừng, vảy, mỏ. Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin được phân thành hai dạng α-

helix của tóc, len và β-sheets của lông vũ (Akhtar và Edwards, 1997). Các sợi keratin
ở cả hai dạng α-helix và β-sheets xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn định
của sợi (Zerdani et al., 2004). Ngoài ra keratin cũng được nhóm lại thành 2 loại:
keratin cứng (keratin (lông, tóc, móng và móng tay) và mềm (da và mô sẹo) theo hàm
lượng lưu huỳnh. Một trong những đặc điểm chính của keratin là có sự ổn định cơ học
cao và khả năng chống proteolytic suy thoái, mà phụ thuộc vào các liên kết disunphua
và hydro, các liên kết muối và các liên kết khác. Do đó, sừng vật chất không tan trong
nước và cực kỳ khả năng chống suy thoái của các enzym thủy phân protein phổ biến
như trypsin, papain và pepsin
.
(
ngày : 28/12/13
Hình 1. Cấu trúc α- keratine và β- keratine
Xét về cấu trúc không gian, đặc tính làm keratine trở nên rắn chắc phụ thuộc
vào sự tập hợp các cấu trúc siêu phân tử (thành phần và trình tự các amino acid của
những mạch polypeptide thành phần). Sự phối hợp của các cấu trúc α – helix, β- sheet
và cầu nối disulfide sẽ quyết định cấu tạo protein chức năng, một vài trong số đó là
điều khiển tính không hoà tan.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


α- keratine: Là keratine có trong tóc người, sừng, móng, guốc của động vật có vú
có cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng liên kết hydro.
β- keratine: Là keratine có nhiều trong móng tay, và móng vuốt của các loài bò
sát…có trong lông, mỏ, móng vuốt của các loài chim, nhím. Được hình thành chủ yếu
nhờ các phiến β cứng chắc do các phiến này được nối bằng các cầu nối disulfide.
Xét về liên kết hóa học, ngoài những liên kết hydro trong phân tử và giữa các

phân tử, keratin còn có một lượng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, được liên
kết với nhau bởi những cầu nối disulfide. Nối disulfide nhiều tạo nên tính không hòa
tan của keratin, ngoại trừ các tác nhân phân hủy hay tác nhân khử như urea có thể hòa
tan keratin. Keratin của lông có ít cầu nối disulfide hơn keratin ở móng hay guốc của
động vật có vú. Do đó, móng, guốc cứng hơn so với lông. Trong trường hợp cấu hình
ß-sheet, keratin được liên kết bởi những liên kết hydrogen tự do trong không gian giữa
nhóm amino và nhóm carboxyl của những chuỗi peptide, tạo ra những liên kết dày đặc
và chắc chắn. Phân tử keratin dạng sợi có thể bện xung quanh nhau tạo thành dạng sợi
trung gian xoắn.
2.3. Enzyme keratinase
Keratinase là loại enzyme có khả phân hủy cơ chất chứa keratine có trong tự
nhiên và được phân loại là protease với mã số là EC 3.4.21/24/99.11 ( Rani Gupta,
Priya Rammani). Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (-S-S-) của cơ
chất khi tiến hành phân hủy chúng (Bokle et al., 1995). Enzyme này có nhiều đặc
trưng bề mặt như chúng có thể phân giải protein có sợ như fibrin, elastin, collagen và
các protein không có sợ như casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin… (Noval và
Nickerson, 1959; Mukhapadhaya và Chandra, 1990; Dozie et al, 1994; Lin et al, 1995;
Letourneau et al, 1998 và Bressollier et al., 1999).
Keratine từ vi sinh vật có pH nằm trong khoảng từ trung tính đến kiềm (6,0-9,0),
và nhiệt độ tối ưu từ khoảng 30 - 80, có khi đạt tới 100 như chủng vi khuẩn
Fervidobacterium islandium AW-1(Nam et al., 2002). Keratinase được kích thích
trong môi trường có chứa nhiều ion như Ca
2+
, Mg
2+
và Mn
2+
và bị ức chế bởi Cu
2+
,

Zn
2+
, Ag
2+
, Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), EDTA,…
Keratinase có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc xử lý chất thải trong ngành
công nghiệp chế biến gia cầm và thuộc da. Chúng được sử dụng trong sản xuất chất
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


tẩy rửa, dược phẩm, đồ thuộc da, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp chế biến thức ăn
gia súc, đặc biệt là gần đây trong các lĩnh vực mới như phân hủy prion để điều trị căn
bệnh bò điên. Keratinase được sản xuất bởi chủ yếu là một số loài vi sinh vật bao gồm
vi khuẩn, nấm hoại sinh và ký sinh, actinomycetes.
2.4. Vi sinh vật phân giải keratin
2.4.1. Sơ lƣợc vi sinh vật phân giải keratin
Lần đầu tiên Molyneux đã phân lập một số vi khuẩn có khả năng phân giải
keratin vào năm 1959. Ông phân lập những vi sinh vật này trong u nang trên thân cừu
và đã tìm thấy sự phân hủy của sợi lông cả trong cơ thể và ống nghiệm. Các vi sinh vật
thuộc chi Bacillus có khả năng tấn công các protein lông cừu tự nhiên đã được ông chỉ
ra trong thí nghiệm này. Cũng trong năm 1959, Noval và Nickerson đã xuất bản một
bài viết về sự phân hủy enzyme của keratin tự nhiên bởi Streptomyces fradiae. Họ cho
thấy enzyme ngoại bào được tiết ra bởi vi khuẩn này có khả năng phân hủy tóc người
ở trạng thái tự nhiên của nó.
Những dòng vi khuẩn sản sinh ra keratinase phân giải β-keratin được tìm thấy
trong lông gia cầm. Các dòng này chủ yếu thuộc chi Streptomyces và Bacillus. Trong
đó các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được tìm thấy

là các vi khuẩn Gram dương Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp.
(Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Hầu hết các dòng vi khuẩn
này có thể phân hủy lông gia cầm trong vòng 48 giờ. Những enzyme keratinase giúp
cho vi khuẩn dự trữ carbon, lưu huỳnh và năng lượng nhằm duy trì sự sinh sản và phát
triển từ việc phân hủy β-keratin.
Hoạt tính keratinase giúp phân giải keratin trong nước còn được biểu hiện ở một
số loài vi khuẩn chịu nhiệt như Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và
Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian,
2001), Fervidobacterium islandcum (Nam et al., 2002) và các dòng vi khuẩn ưa kiềm
như Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1
(Shinju Mitsuiki et al., 2004). Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và
Microbispora aerata IMBAS-11A, được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho
thấy khả năng tạo keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu
(Gousterova et al., 2005).
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


Khả năng thủy phân keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến
việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như pronase, đã được
sản xuất thương mại từ vi khuẩn S.griseus (Jurasek et al., 1974). Bên cạnh đó.
S.pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông vũ
(Bokle và Muller, 1997), cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide
reductase để phục vụ sự thủy phân keratin.
Vi khuẩn có khả năng phân giải keratin được nghiên cứu nhiều nhất trên các loại
Bacillus spp., được mô tả có khả năng phân hủy lông gia cầm (Kim et al., 2001; Lin et
al., 1999). Một số dòng B.licheniformis và B.subtilis cùng một số loài khác như
B.pumilus và B.cereus đều có khả năng tạo ra keratinase (Brandelli, 2007). Gene kerA

của Bacillus licheniformis đã được nhân dòng và giải mã trình tự(Linetal.,1995)
Ngoài Streptomyces và Bacillus còn một số loại vi sinh vật khác như
Lysobacter, Nesternokia, Kocurica, Microbacterium, Stenotrophomonas,
Chysosporium, Aspergillus, Trichurus, Curvularia,
2.4.2. Vi khuẩn Bacillus megaterium
Bacillus megaterium là một vi khuẩn hình que, Gram dương, có bào tử. Đây
được coi như là một vi khuẩn hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển được trong môi
trường kị khí khi cần thiết, là một trong những loại vi khuẩn lớn nhất được tìm thấy
trong đất cát nên gọi là “ mega”. B megaterium thường được tìm thấy ở dạng chuỗi
trong đó các vi khuẩn liên kết với nhau thông qua các phân tử polysacharides trên
thành tế bào để tổng hợp thành lớp vỏ mỏng ở bên ngoài được cấu tạo phối hợp bởi
polypeptide và polysachride. Tiếp theo có rất nhiều lớp peptidoglycan tạo thành các
lớp vách cho vi khuẩn và một lớp protein ở bề mặt ngoài của màng bào tương.
Bacillus megaterium có khả năng chống chịu tốt với môi trường tự nhiên. Bào tử
của chúng đã được chứng minh là dạng bền vững nhất của các dạng tế bào đã được tìm
thấy trong tự nhiên. Bào tử của chúng có khả năng đề kháng cao với tia cực tím và
chúng có thể chống chịu được khí hậu khắc nghiệt như sa mạc. Là một loài có khả
năng tạo bào tử 100% cũng như có khả năng chuyển dạng bào tử sang dạng dinh
dưỡng với cùng tỉ lệ. Chu trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân
hủy, giáng hóa chất hữu cơ để trở thành các hợp chất đơn giản hơn được thực hiện bởi
các loài sinh vật trong đó có B.megaterium . Các loài sử dụng dinh dưỡng từ các vật
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


liệu hữu cơ đã chết hay hoại sinh để duy trì năng lượng cho sự phát triển và tự chuyển
sang dạng bảo tử khi chất dinh dưỡng cạn kiệt. Điều này cho thấy một chiến lược sinh
tồn được sử dụng bởi nhiều loại vi sinh vật . Các nhóm vi sinh vật đó sống trong đất và

tạo ra kháng sinh quần hợp với quy trình tạo bào tử của chúng. Vì có rất nhiều loại vi
sinh vật tạo bào tử có thể có hiệu quả làm giáng hóa nhiều hợp chất polyme sinh học
như protein, tinh bột, pectin chúng có vai trò đác kể trong chu trình sinh học của
carbon và nitrogen. Chính nhờ đặc tính này mà hiện nay B.megaterium là một trong
những loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến trong lĩnh vực môi trường. Tuy được coi
là vi khuẩn không gây bệnh nhưng chúng đóng vai trò lớn trong việc gây nhiễm các
môi trường vô khuẩn thông qua việc tiếp xúc trực tiếp hay các hạt bụi và chúng có thể
là tác nhân gây nên phân hủy, thối rữa. Trong công nghệ sinh học, nhờ kích thước lớn
của vi khuẩn đã cho phép sử dụng B. megaterium trong nghiên cứu về protein cũng
như các nghiên cứu về màng tế bào thành công. Chủng đơn được sử dụng cho nhiều
nghiên cứu trên lĩnh vực sinh lý bào từ và cấu trúc màng tế bào, một số các ứng dụng
của nó trong xử lý môi trường và công nghiệp như sản xuất enzyme, vitamin, và rất
nhiều ứng dụng khác kể cả công nghệ gen và DNA tái tổ hợp
(www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/MOB/BMEG02.pdf ngày 28/12/2013)
2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase
của vi sinh vật
2.5.1. Các yếu tố vật lý
Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải keratin của vi sinh vật bị ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố. Giá trị pH khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase
và sự phân hủy lông vũ ở hầu hết các vi khuẩn giá trị pH kiềm được cho là kích thích
sự phân hủy keratin do làm biến đổi các cysyine thành lathionine khiến cho keratinase
dễ dàng tiếp cận cơ chất. Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng
từ 30-50
0
C ở hầu hết các vi khuẩn. Năm 2006 Geun-Tae Park et al phát hiện vi khuẩn
Bacillus megaterium F7-1 phát triển tối ưu cũng như hoạt tính keratinase cao nhất ở
nhiệt độ 25-40
0
C và pH 7,0 – 11,0. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi
khuẩn thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là

30
0
C, và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực
đại (Sangali et al., 1999). Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp. kr6 phát triển tối ưu ở
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


nhiệt độ 30
0
C và pH 8,0 và hoạt động phân giải lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt
độ này (Riffel et al., 2002). Ngoài những thông số vật lý thì trong hầu hết các trường
hợp, keratin đóng vai trò như chất cảm ứng cho hoạt động phân giải keratin; bên cạnh
đó, bột đậu nành cũng được biết đến như là chất cảm ứng cho sự sinh enzyme (Cheng
et al., 1995; Gradisar et al., 2000). Điều này cho thấy rằng hoạt tính phân giải keratin
có thể được cảm ứng bởi nhiều tác nhân.
2.5.2. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy
Nguồn nitơ
Vi sinh vật có khả năng hấp thụ nhiều nguồn dinh dưỡng nitơ khác nhau. Tùy
theo đặc điểm dinh dưỡng của từng loài mà nó đòi hỏi các dạng nitơ khác nhau. Dạng
nitơ vô cơ như NH
3
, NH
4
+
, NO
3
-

là các nguồn dinh dưỡng đối với nhóm vi sinh vật tự
dưỡng amin. Chúng có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ ở dạng các hợp chất vô cơ
như trên, từ đó tổng hợp nên các acid amin của cơ thể. Trong các hợp chất đó, dễ hấp
thụ nhất đối với vi khuẩn là NH
3
, NH
4
+
, các dạng hợp chất này dễ dàng thâm nhập vào
tế bào và tạo nên các nhóm amin (Nguyễn Như Thanh, 1990). Dạng nitơ hữu cơ như
protein, polypeptit, acid amin là nguồn dinh dưỡng đối với nhóm vi sinh vật dị dưỡng
amin, chúng không có khả năng tự tổng hợp các acid amin của tế bào từ các hợp chất
nitơ vô cơ. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp phân tử protein mà phải
phân hủy chúng thành các polypeptit nhờ men protease. Thường chỉ những polypeptit
không quá 5 acid amin mới được vi sinh vật hấp thụ. Có những loài vi sinh vật đòi hỏi
phải có sẳn những acid amin nhất định trong môi trường nuôi cấy, các acid amin cần
thiết đó khác nhau tùy theo loài vi sinh vật. Các dạng nitơ hữu cơ không những là
nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi sinh vật. Ngoài ra,
nguồn dinh dưỡng khoáng và các chất sinh trưởng cũng rất cần thiết đối với vi sinh vật
(Trần Cẩm Vân, 2001).
Nguồn cacbon
Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO
2
,
NaHCO
3
, CaCO
3
) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các
nguồn thức ăn cacbon khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố : một là thành phần hoá học

và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh
vật. Trên thế giới hầu như không có hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không bị hoặc
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Không ít vi sinh vật có thể
đồng hóa được cả các hợp chất cacbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ,
parafin, khí thiên nhiên.
Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử
quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thuỷ phân
(amilaza, xenlulaza, pectinaza, lipaza, ) để chuyển hoá chúng thành các hợp chất dễ
hấp thụ (đường, axit amin, axit béo, )
Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn cacbon khi nuôi cấy phần lớn
các vi sinh vật dị dưỡng. Cần chú ý rằng đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển
hoá thành loại hợp chất có màu tối gọi là đường cháy rất khó hấp thụ. Trong môi
trường kiềm sau khi sử dụng đường còn dẽ bị acid hóa và làm biến đổi pH môi trường.
Để tránh các hiện tượng này khi khử trùng môi trường chứa đường người ta
thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm (112,5
0
C) và duy trì trong 30 phút. Với các
loại đường đơn tốt nhất là nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp
Tyndal) hoặc lọc riêng dung dịch đường (thường dùng nồng độ 20%) bằng nến lọc
hoặc màng lọc vi khuẩn sau đó mới dùng thao tác vô trùng để bổ sung vào các môi
trường đã khử trùng.
Khi chế tạo các môi trường chứa tinh bột trước hết phải hồ hoá tinh bột ở nhiệt
độ 60 - 70
0

C sau đó đun sôi rồi mới đưa đi khử trùng ở nồi hấp áp lực.
Cellulose được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân
giải xenlulozơ dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các loại bột cellulose (cellulose
powder, avicel, )
Khi sử dụng lipit, parafin, dầu mỏ, để làm nguồn cacbon nuôi cấy một số
loại vi sinh vật phải thông khí mạnh để cho từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với
thành tế bào từng vi sinh vật.
Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường
không giống nhau. Với vi khuẩn, xạ khuẩn người ta thường dùng 0,05 - 0,2% đường
còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3 - 10% đường


Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Các nghiên cứu trong nước về vi sinh vật có khả năng phân hủy keratine còn
hạn chế. Những năm gần đây mới có một vài nghiên cứu về một số loại vi sinh vật có
khả năng phân giải keratin. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Hương (2001) đã
tiến hành phân lập được từ đất cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng vi
khuẩn Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng
Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) cũng đã tiến hành phân lập các chủng vi
khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng phân hủy keratine ứng dụng vào
chế biến thức ăn thủy sản. Điều kiện cho các chủng vi khuẩn này là ở nhiệt độ từ 30-
40 thì khả năng phân hủy lông gia cầm từ 75%- 90% sau một tuần nuôi cấy.

Bùi Thị Minh Diệu et al. (2012) đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn, kết quả
đánh giá khả năng thủy phân lông gà cho thấy 21 dòng vi khuẩn đã làm giảm khối
lượng bột lông gà từ 24,43% đến 58,13% sau một tuần lắc ủ ở 37
o
C. Ngoài ra các dòng
vi khuẩn có khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn sau 10 ngày
lắc ủ. Trong đó, hai dòng vi khuẩn K14 và K15 cho thấy khả năng thủy phân lông gà
hiệu quả nhất. Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn K14 tương đồng với dòng
Chryseobacterium indologenes McR-1 với độ tương đồng 98% và dòng K15 tương
đồng với dòng Bacillus subtilis BE-91 với độ tương đồng 99%.
2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc.
Có rất nhiều dòng vi khuẩn phân hủy lông gia cầm được phân lập từ đất và nước
thải. Trong đó, Bacillus licheniformis PWD1 (Williams et al., 1990; Lin et al., 1995),
Fervidobacterium pennavorans (Friedrich and Antranikian, 1996), Kocuria rosea
LBP-3 (Vidal et al., 2000; Bernal et al., 2006), Bacillus subtilis KS1 (Kim et al., 2001;
Suh and Lee, 2001), Bacillus licheniformis K-508 (Rozs et al., 2001; Manczinger et
al., 2003), Xanthomonas maltophila POA-1 (De Toni et al., 2002), Chryseobacterium
sp. kr6 (Riffel et al., 2003), Bacillus licheniformis RG1 (Ramnani and Gupta, 2004),
Microbacterium arborescens kr10 (Thys et al, 2004), Bacillus licheniformis, Bacillus
subtilis ATCC 6633 (Zerdani et al., 2004).
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


Sangli và Brandelli (2000) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn từ rác thải
chứa chủ yếu là keratin ở Brazil. Trong số đó thì kr2 là dòng có khả năng phân hủy
cao nhất khi phát triển trên môi trường chứa 10 g/l lông gia cầm (là nguồn năng lượng,
cacbon, nitơ duy nhất). Nhiệt độ tối ưu để nuôi vi khuẩn là 30oC và nhiệt độ tối ưu cho

enzyme hoạt động là 55
o
C, pH = 8. Dòng kr2 được xác định là thuộc họ Vibrionaceae.
Gupta và Ramnani (2006) cũng đã tổng hợp các đặc điểm của các dòng vi khuẩn
có khả năng phân hủy keratin được phân lập từ các bài nghiên cứu trước đó. Kết quả
cho thấy, các dòng vi khuẩn phân hủy keratin có dòng Gram âm và có dòng Gram
dương. Các dòng vi khuẩn Gram dương đã được phân lập phần lớn thuộc chi Bacillus:
Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams et al., 1990), Bacillus subtilis S14 (Macedo et
al., 2005), Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, và Bacillus cereus (Kim et al.,
2001), hoặc chi Streptomyces như: Streptomyces flavus (Antarctic soil Gushterova et
al., 2005), Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995), Streptomyces
albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999), Streptomyces thermoviolaceus (Chitte et
al., 1999) và một vài trường hợp khác là các dòng Fervidobacterium pennavoran
(Friedrich, Antranikian, 1996), Microbacterium sp. kr10 (Thys et al., 2004),
Terrabacter terrae (Barrientos et al, 2005) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Các
dòng Gram âm chủ yếu thuộc các chi Vibrio (Sangals, Brandelli, 2000) và chi
Chryseobacterium (Riffel et al., 2003),…
Park và Son (2009) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường
đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium F7-
1. Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày. Nhiệt độ 25
o
C - 40
o
C,
và pH 7,0 – 11,0 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase của dòng vi
khuẩn này. Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không béo là
468 U/ml, cao gấp 9,4 lần so với hoạt tính tạo ra trong môi trường không bổ sung sữa.
Lượng keratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ.
Savitha et al. (2010) đã phân lập 2 dòng vi khuẩn phân hủy keratin từ đất:
(KI8101 và KI8102) và nhận diện 2 dòng này là Bacillus subtilis và B. licheniformis.

Enzyme tinh sạch từ dòng KI8102 có hoạt tính cao (500 U/mg), trọng lượng phân tử là
32KDa. Nhiệt độ tối ưu là 50
o
C và pH = 7,5 thì dòng vi khuẩn này có khả năng phân
hủy chất thải chứa keratin như tóc, móng, lông gia súc.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


Evelise et al. (2010) đã tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn mới được
phân lập từ mẫu đất ở vùng Amazon. Các dòng vi khuẩn này phát triển tốt trên môi
trường FMA (feather meal agar). Các dòng vi khuẩn này được kiểm tra khả năng phân
hủy lông gia cầm và nhận diện bằng đặc điểm sinh hóa. Ngoài ra, chúng còn được định
danh dựa vào trình tự đoạn 16S rRNA. Hầu hết các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus,
ngoài ra còn có Aeromenas, Serratia và Chryseobacterium.
Mazotto et al. (2011) đã phân lập được ba dòng vi khuẩn Bacillus (B. subtilis
LFB-FIOCRUZ 1270, B. subtilis LFB-FIOCRUZ 1273 và B. licheniformis LFB-
FIOCRUZ 1274) từ nguồn chất thải lông gia cầm và tiến hành khảo khả năng tổng hợp
enzyme keratinase khi sử dụng bột lông vũ làm cơ chất. Ba dòng vi khuẩn này sản sinh
ra các enzyme keratinase và peptidase ngoại bào sau 7 ngày. Lông vũ được xác định là
cơ chất tốt nhất cho hoạt động của keratinase và peptidase tạo ra bởi B. subtilis LFB-
FIOCRUZ 1273 và đây cũng là dòng vi khuẩn biểu hiện hoạt động enzyme mạnh nhất.
Cả ba dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải bột lông vũ (62% đến 75%) và lông vũ
(40% đến 95%), tạo ra 3,9 đến 4,4 mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung bột
lông vũ và tạo ra 1,9 đến 3,3 mg/ml protein hòa tan trong môi trường bổ sung lông vũ.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2013-04/2014 tại PTN Sinh học phân tử Thực
vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần
Thơ.
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu lông gia cầm thu ở một số cơ sở giết mổ gia cầm thuộc tỉnh Vĩnh Long,
chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 được cung cấp bởi PTN Sinh học phân tử
Thực vật do Huỳnh Kim Yến phân lập năm 2013
3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn phân hủy keratin
a. Môi trường tăng sinh khối (Riffle et al, 2003)
Bảng 2: Thành phần môi trƣờng tăng sinh khối
Hóa chất
Nồng độ (g/l)
NaCl

0,5
K
2
HPO
4

0,3
KH
2
PO
4

0,4
MgSO
4

0,1
Bột lông vũ
10
NH
4
Cl
0,5
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
0
C



Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học


b. Môi trường lỏng (Bo Xu et al., 2009): đánh giá khả năng phân hủy keratin và
sự hoạt động của enzyme keratinase.
Bảng 3: Thành phần môi trƣờng lỏng
Hóa chất
Nồng độ (g/l)
NaCl
0,5
K
2
HPO
4

0,3
KH
2
PO
4

0,4
MgCl
2
.6H
2
O
0,1

Bột lông vũ
10
NH
4
Cl
0,5
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
0
C
c. Môi trường đặc: đánh giá sự phát triển của vi sinh vật phân hủy keratin
Bảng 4: Thành phần môi trƣờng đặc
Hóa chất
Nồng độ (g/l)
NaCl
NH
4
Cl
0,5
0,5
K
2
HPO
4

0,3
KH
2
PO
4

0,4
MgCl
2
.6H
2
O
0,1
Bột lông vũ
10
Agar
15
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
0
C