trích ly và tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn dd9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


TRÍCH LY VÀ TINH SẠCH ENDOGLUCANASE
TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN DD9



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN TRẦN NGỌC QUÍ
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3112527
LỚP: CNSH K37



Cần Thơ, Tháng 12/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


TRÍCH LY VÀ TINH SẠCH ENDOGLUCANASE
TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN DD9



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN TRẦN NGỌC QUÍ
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3112527
LỚP: CNSH K37



Cần Thơ, Tháng 12/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1 SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)


Ths. Võ Văn Song Toàn Trần Ngọc Quí
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2
(ký tên)


PGs. Ts. Trần Nhân Dũng

XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
TRƢỞNG BỘ MÔN
(ký tên)



LỜI CẢM TẠ
Sau thời gian học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp Đại học chuyên nghành Công
nghệ sinh học tại viện NC&PT CNSH, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm từ gia
đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình
của bạn bè để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Cám ơn thầy Võ Văn Song Toàn, thầy Trần Nhân Dũng đã tận tâm hướng dẫn,
chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin gửi lời cám ơn đến Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học và quý
thầy cô của Viện đã tạo điều kiện và truyền đạt những kiến thức kinh nghiệm quý báu
giúp tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài.
Cám ơn tổ bảo vệ của Viện đã giúp đỡ, hỗ trợ cho tôi làm việc ngoài giờ ở phòng
thí nghiệm để hoàn thành luận văn đúng thời hạn.
Xin chân thành cám ơn các bạn sinh viên, anh chị học viên cao học ở phòng thí
nghiệm Sinh hóa và phòng Công nghệ Enzyme và toàn thể lớp Công nghệ sinh học
khóa 37 đã nhiệt tình ủng hộ chia sẻ kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời
gian tôi học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!




Cần thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2014


Trần Ngọc Qúi
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

TÓM LƢỢC
Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Bacillus subtilis và có nhiều ứng dụng
quan trọng. Đề tài “Trích ly và tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn dạ
cỏ dê DD9” được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy
vi khuẩn DD9. Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacillus subtilis RC24 ở mức độ
94% . Dịch vi khuẩn DD9 được nuôi cấy trong môi trường có cơ chất là bã mía sau đó
ủ kỵ khí trong 5 ngày ở 38
0
C để thu nhận enzyme ngoại bào. Từ một lít dịch enzyme
thô ban đầu có hàm lượng protein tổng 54,3 mg, hoạt tính tổng 4311 U, đánh giá qua
ba phương pháp tinh sạch: tủa phân đoạn với ammonium sulphate, tủa với ethanol và
tủa với acetone. Endoglucanase thể hiện hàm lượng và hoạt tính protein cao nhất

(1,012 mg và 908 U) khi tủa với 40-80% ammonium sulphate. Bốn phân đoạn tủa 40-
70% ammonium sulphate được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion trên gel Uno Sphere
Q. SDS-PAGE kết hợp với phương pháp nhuộm bạc xác định được hai endoglucanase
với trọng lượng phân tử xấp xỉ nhau (có thể là hai đồng phân) 51 kDa và 53 kDa với
hiệu suất tinh sạch 6% và độ tinh sạch 7 lần.
Từ khóa: Vi khuẩn dạ DD9, endoglucanase, tủa phân đoạn, sắc ký trao đổi ion.










Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH HÌNH vi
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1

1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện 3
2.1.2. Phân loại 3
2.2. Tổng quan về Endoglucanase 4
2.2.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase 4
2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase 6
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6
2.2.2.2. Ảnh hưởng của pH 6
2.2.2.3. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase 7
2.2.2.4. Ảnh hưởng của một số chất ức chế và hoạt hóa 7
2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu 7
2.3.1. Phương pháp kết tủa protein 7
2.3.1.1. Phương pháp tủa bằng muối 7
2.3.1.2. Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ 9
2.3.1.3. Phương pháp tủa bằng điểm đẳng điện 9
2.3.1.4. Tủa bằng ion kim loại 10
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

2.3.3. Một số phương pháp sắc ký 11
2.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion 11
2.3.3.2 Sắc ký lọc gel 12
2.3.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate –
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) 13

2.3.4.1. Điện di trên gel trong điều kiện có chất gây biến tính SDS và β-
mercaptoethanol 14
2.3.5. Một số phương pháp khác 15
2.3.5.1. Phương pháp Bradford 15
2.3.5.2. Phương pháp Nelson Smogyi 17
2.3.5.3. Phương pháp định tính bằng đường kính vòng tròn thủy phân 17
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 17
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 17
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 18
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 20
3.1.1. Thời gian và địa điểm 20
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị 20
3.1.3. Nguyên vật liệu 20
3.1.4. Hóa chất 20
3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 22
3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp kết tủa 22
3.2.1.1. Kết tủa phân đoạn endoglucanase với Ammonium Sulfate bãohòa . 22
3.2.1.2. Kết tủa endoglucanase với ethanol 22
3.2.1.3. Kết tủa endoglucanase với acetone 23
3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 23
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
4.1. Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 25

4.1.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium
sulphate 25
4.1.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol 27
4.1.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa evới acetone 28
4.1.4 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm 30
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
5.1. Kết luận 35
5.2. Kiến nghị 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2















Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Thành phần môi trường cải tiến (M1) 21
Bảng 2. Thành phần môi trường cải tiến (M2) 21
Bảng 3. Kết quả tủa phân đoạn với ammonium sulphate 25
Bảng 4. Kết quả tủa với ethanol 27
Bảng 5. Kết quả tủa với acetone 28
Bảng 6. So sánh hiệu quả của ba phương pháp tủa 30
Bảng 7. Kết quả sắc ký trên gel Uno Sphere Q 31


















Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT

___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.Vi khuẩn Bacillus subtilis 3
Hình 2. Mô hình một cấu trúc của endoglucanase 5
Hình 4. Tủa phân đoạn protein với Ammonium sulfate 8
Hình 5. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của prtotein biến thiên theo nồng độ muối
8
Hình 6. Tỷ lệ protein tủa theo pH 10
Hình 7. Các quá trình của phương pháp sắc ký sinh học 12
Hình 8. Sắc ký lọc Gel 13
Hình 9. Sự phân tách protein bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 14
Hình 10. Minh họa phản ứng của Coomassie G-250 với protein 16
Hình 11. Kết quả đường kính vòng halo giữa các phân đoạn tủa AS 26
Hình 12. Kết quả đường kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa ethanol 27
Hình 13. Kết quả đường kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa acetone 29
Hình 14. Sắc ký đồ trên gel Uno Sphere Q 30
Hình 15. Kết quả định tính endoglucanase đã tinh sạch phân đoạn sắc ký 31
Hình 16. Kết quả điện di SDS-PAGE phân đoạn tủa AS 32
Hình 17. Kết quả điện di SDS-PAGE phân đoạn sắc ký 33

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

TỪ VIẾT TẮT
APS Ammonium persulfate
Ammonium sulfate
BSA Bovine serum albumin
CD Catalytic domain
CBM Carbohydrate-binding molecule
CMC Carboxy methyl cellulose
DTT Dithiotheitol
IEF Isoelectric focusing
pI Isoelectric point
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel
SDS Sodium dodecyl sulfate
TCA Trichloroacetic acid
TEMED Tetramethylethylenediamine
OD Optical density
ĐC Đối Chứng





Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT

___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cellulose được xem là hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên thế giới, chủ yếu là từ
thực vật, là sản phẩm cơ bản của quá trình quang hợp trong lượng sinh khối thực vật,
là nguồn carbon và năng lượng tái tạo dồi dàu. Theo ước tính hằng năm có khoảng
4,0x10
7
tấn cellulose được sản xuất (Singh et al, 1995). Các chất thải nông nghiệp bao
gồm rác thực vật, phân động vật và chất thải cây trồng chế biến, lượng lớn được tạo ra
trong khai thác gỗ, mùn cưa tạo ra một lượng dư thừa sản phẩm cellulose. Vì vậy việc
tận dụng nguồn phế phẩm cellulose, đặc biệt là ứng dụng nguồn enzyme phân giải
cellulose đã và đang được nghiên cứu. Nhiều vi sinh vật bao gồm nấm và vi khuẩn đã
được nghiên cứu để phân hủy cellulose và vách tế bào thực vật khác. Trong tự nhiên,
sự phân hủy của sinh khối cellulose được thực hiện bởi hỗn hợp các enzym thủy phân
được gọi chung là cellulase.
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-
glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất
tương tự khác, là một enzyme đa thành phần xúc tác chuyển hóa cellulose thành
glucose qua một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của endoglucanase, exoglucanase
và β-glucosidase,
Cellulase là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng nhất thu hút sự
quan tâm vì sự đa dạng trong các ứng dụng của nó. Thị trường tiêu thụ cellulase ở Hoa
Kỳ ước tính khoảng 400 USD mỗi năm (van Beilen và Li, 2002; Wolfson, 2005;
Zhang et al., 2006), chiếm khoảng 33% thị trường enzyme công nghiệp của Hoa Kỳ.
Các ứng dụng của cellulase đã được nghiên cứu, trong lĩnh vực nông nghiệp các chế
phẩm của cellulase, hemicellulase và pectinase có tiềm năng ứng dụng trong việc kích

thích sự tăng trưởng và kiểm soát dịch bệnh cho cây trồng (Bhat, 2000; Chet et al.,
1998), cải thiện nguồn dinh dưỡng trong đất bằng cách thúc đẩy nhanh sự phân hủy
của rơm rạ trong đất, trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp, phá vở thành tế bào thực vật
giúp cho việt ly trích các chất từ thực vật được dể dàng. Điều này còn giúp việc nghiên
cứu nuôi cấy tế bào “trần” lai tạo những tế bào khác nhau tạo ra tế bào mới theo mong
muốn (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Trong công nghiệp cellulase có nhiều ứng dụng
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp chất tẩy
rửa bột giặt (Kuhad et al., 2011), đặc biệt là trong chuyển đổi vật liệu cellulose thành
ethanol có nhiều ứng dụng trong công nghiệp năng lượng và công nghiệp sản xuất
hàng tiêu dùng, ngoài ra cellulase còn có nhiều ứng dụng trong quá trình lên men cải
thiện malt trong bia, chất lượng, mùi vị của rượu, cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức
ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm, sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật…
Nguồn enzyme cellulase sử dụng thu được từ vi sinh vật chủ yếu trên vi khuẩn và
nấm (Lynd et al., 2002). Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ
tăng sinh khối ở vi sinh vật cao gấp ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật
và thực vật, vì vậy lượng enzyme do vi sinh vật tổng hợp được là rất lớn. Trong lịch sử
nghiên cứu, các vi khuẩn Bacillus là một nguồn phong phú sản xuất các enzyme công
nghiệp (Horikoshi và Alkaliphiles, 1999; Priest, 1977), Bacillus subtilis là một trong
các loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào khá cao có khả năng phân
hủy cellulose (Tjalsma et al., 2004; Yamane et al., 2004; Schumann, 2007; Zhang và
Zhang, 2010). Nhưng trên thực tế các nghiên cứu về cellulase từ Bacillus vẫn còn hạn
chế so với các nghiên cứu được thực hiện trên nấm.
Các enzyme chỉ thể hiện đầy đủ hoạt tính và chức năng sinh học khi không có lẫn
tạp chất, tinh sạch là bước đầu cần thiết trong việc tìm hiểu chức năng của protein

(Berg et al., 2002). Do đó đề tài “trích ly tinh sạch endoglucanase từ Bacilus subtilis
RC24” được thực hiện, mở ra hướng nghiên cứu mới về cellulase trên đối tượng vi
khuẩn.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi
khuẩn DD9 bằng sắc ký trao đổi ion âm.





Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên bởi C.G. Ehrenberg vào năm 1835
với tên gọi là Vibrio subtilis, sau đó được đổi tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872
bởi F.Cohn. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế
giới. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như loài vi sinh
vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại
tràng, tiêu chảy…
Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm
năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…
2.1.2. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc

Giới (Kingdom) : Bacteria
Nghành (Division) : Firmicutes
Lớp (Class) : Bacilli
Bộ (Oder) : Bacillales
Họ (Family) : Bacillaceae
Giống (Genus) : Bacillus


(*Nguồn: ngày 11/03/2014)
Bacillus subtilis thuộc nhóm trực khuẩn, hình que Gram dương, có kích thước
khoảng 3-5 μm tùy vào môi trường nuôi cấy (Sargent, 1975). Bacillus subtilis được
xem là vi sinh vật ưa khí bắt buộc, nhưng cũng có thể hoạt động kỵ khí khi có sự hiện
diện của nitrat hoặc glucose. Bacillus subtilis được xem là loài vi sinh vật không độc
hại, không phải là một tác nhân gây bệnh. phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên,
phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông
Hình 1.Vi khuẩn Bacillus subtilis
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

thường trong đất trồng trọt, đất nghèo dinh dưỡng ở vùng xa mạc, đất hoang thì sự
hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản
xuất như bột mì, bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao…Bacillus
subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ vừa phải, nhiệt độ tối ưu là 30-37
o
C (Korsten
và Cook, 1996). Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát
triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (trong môi trường nghèo dinh

dưỡng, nhiệt độ khắc nghiệt…) (Tô Minh Châu, 2000). B.subtilis có thể sản xuất và
tiết ra một lượng lớn enzyme vào môi trường nuôi cấy. Các enzyme ngoại bào của
Bacillus subtilis có những đặc tính vượt trội hơn hẳn các enzyme của vi sinh vật khác
như khả năng chịu được nhiệt độ tương đối cao, pH hoạt động từ trung tính đến kiềm,
khả năng thủy phân cơ chất cao…( />enzyme-ngoai-bao-bacillus-subtislis-11277/ngày 11/02/2014).
Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease,
amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Do đó, sinh vật này
được coi là một "nhà máy sản xuất di động" phong phú cho các enzyme công nghiệp
và sinh dược học (Westers et al., 2004).
Bacillus subtilis có khả năng sử dụng hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi
một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và acid amin cho sự sinh trưởng. Bacillus subtilis được ứng dụng trong lĩnh
vực, bao gồm cả nghiên cứu di truyền, các ứng dụng công nghiệp và làm thuốc diệt
nấm. Hơn nữa Bacillus subtilis có thể dễ dàng phân lập và phát triển trong phòng thí
nghiệm. Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp
đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase Đã có nhiều công
trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly
các chất từ thực vật, từ cây thuốc… (Phạm Thi Hồng Thắm, 2013).
2.2. Tổng quan về Endoglucanase
2.2.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase
Còn được gọi là β-1,4-endoglucan hydrolase, β-1,4-glucanase, Carboxymethyl
cellulase, Celludextrinase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanohydrolase,
Endo-1,4-β-glucanase thuỷ phân lên kết β-1,4-glycoside trong vùng vô định hình của
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide với kích thước khác nhau và tạo

ra các đầu mút mới có thể lần lượt bị tấn công bởi exoglucanase. Các endoglucanase là
các enzyme đơn phân với trọng lượng phân tử khác nhau khoảng 22-45 kDa, mặc dù
có các biến thể lớn hơn trên nấm như Sclerotium rolfsii và Gloeophyllum sepiarium có
endoglucanases gấp hai lần kích thước này (Sadana et al., 1984), pH tối ưu trong
khoảng 7-8 và nhiệt độ tối ưu 50- 70
o
C (Valásková et al., 2006; Ding et al., 2001).
Endoglucanase điển hình có cấu trúc gồm hai tiểu đơn vị (sub-domains): domain
xúc tác (catalytic domain-CD), domain bám vào gốc đường (carbohydrate binding
molecule-CBM), một đoạn peptide nối hai domain này với nhau (linker pepride).

Hình 2. Mô hình một cấu trúc của endoglucanase
(*Nguồn:
Domain CD chịu trách nhiệm thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic trong vùng vô
định hình của phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide có chiều dài khác
nhau. Domain CBM có vai trò tương tác với cơ chất thông qua sự tham gia của các
acid amin nhân vòng thơm như tryptophan (Kawaminami et al., 1998). Domain này
cải thiện khả năng bám và hỗ trợ hoạt tính của CD trên các cơ chất không hòa tan
nhưng không tác động trên các cơ chất hòa tan (Linder và Teeri, 1997). Các CBM,
thường là các O-glycosyl hóa có từ 30 đến khoảng 200 acid amin, có cấu tạo gồm 1, 2
hoặc 3 tiểu domain trong một protein. Các domain bám có thể ở cả hai đầu mút C hoặc
N và đôi khi là vị trí trung tâm của protein. Đoạn peptide liên kết là một chuỗi các acid
amin kết nối domain xúc tác và domain bám, đoạn này có từ 6-59 acid amin và có
chức năng như một bản lề linh hoạt cho phép các domain CBM và CD hoạt động với
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

chức năng độc lập (Wilson và Irwin, 1999).

Hình 3. Cơ chếphân cắt của endoglucanase
(*Nguồn:
2.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến enzyme theo hai hướng: ảnh hưởng trực tiếp hằng số tốc
độ phản ứng và ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme. Tùy vào từng chủng
loài vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy cụ thể mà nhiệt độ tối ưu của endoglucanase có thể
khác nhau. Nhiệt độ tố ưu của endoglucanase khảo sát ở dòng Bacillus phân lập từ
phân bò khoảng 50
o
C (Sadhu et al., 2013), ở Bacillus circulans là 45
o
C (Nirmala et al.,
2011), trong khi ở dòng Bacillus M-9 endoglucanase có hoạt tính tốt nhất ở 60
o
C
(Bajaj et al., 2009).
2.2.2.2. Ảnh hƣởng của pH
pH ảnh hưởng đến các hoạt tính của enzyme, pH tối ưu cho các hoạt động của
enzyme từ 5-9, một số yếu tố bị ảnh hưởng bởi pH như liên kết của cơ chất với
enzyme, trạng thái ion hóa của các acid amin tham gia vào hoạt động xúc tác của
enzyme, khả năng ion hóa của cơ chất, làm thay đổi cấu trúc phân tử của enzyme.
Endoglucanase từ các loài Bacillus khác nhau thường có hoạt tính cao nhất trong
khoảng pH dao động 5-9, ví dụ, endoglucanase của Bacillus licheniformis có hoạt tính
cao nhất ở pH 6 (Bischoff et al., 2006), trong khi ở Bacillus cereus endoglucanase có
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT

___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

hoạt tính cao nhất ở pH 8 (Yang et al., 2011) và pH 9 ở Bacillus circulans (Nirmala et
al., 2011).
2.2.2.3. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase
Endoglucanase thể hiện hoạt tính cao nhất với carboxmethyl cellulose (CMC) và
β-glucan. Ngoài ra, endoglucanase cũng thể hiện hoạt tính với một số cơ chất khác như
avicel, cotton, giấy lọc, xylan nhưng hoạt tính không cao (Yin et al., 2010; Mawadza
et al., 2000).
2.2.2.4. Ảnh hƣởng của một số chất ức chế và hoạt hóa
Hoạt tính của endoglucanase được tăng cường bởi một số chất hoạt hóa như ion
Mn
2+
, Co
2+
và β-Mercaptoethnol, và bị ức chế bởi Hg
2+
, Fe
3+
, Cd
2+
, Sodium dodecyl
sulfate hay Iodoacetic acid làm giảm hoạt tính của endoglucanase. Các ion K
+
, Na
+
,
Ca
2+

, NH
4+
không ảnh hưởng đến hoạt tính của endoglucanase khi được thêm vào phản
ứng (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000).
2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp kết tủa protein
Phương pháp tủa được sử dụng tương đối phổ biến để thu nhận protein. Protein
có thể được kết tủa theo nhiều cách khác nhau như: tủa bằng muối, tủa bằng dung môi
hữu cơ, thay đổi pH của dung dịch có chứa protein hay có thể tủa bằng nhiệt.
2.3.1.1. Phƣơng pháp tủa bằng muối
Phương pháp này dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của protein ở
nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để
loại bỏ bước đầu các protein tạp chất trong dung dịch enzyme. Nồng độ muối tăng cao
sẽ là nguyên nhân gây kết tủa protein mà không gây biến tính. Phần lớn các phân tử
protein có tính lưỡng cực, một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước, phần ưa nước trên bề
mặt phân tử tạo thành lớp áo nước bao quanh, phần kỵ nước co cụm lại bên trong lòng
phân tử. Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) do lượng muối
được thêm vào làm trung hòa các điện tích bề mặt của protein, làm giảm tính trật tự
của lớp áo nước bên ngoài nên sẽ làm tăng entropy của hệ thống. Tuy nhiên, ở nồng độ
muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out). Lượng ion dư thừa trong giai
đoạn salting out sẽ tranh giành dung môi với protein và làm giảm hiện tượng solvat
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

hóa, đồng thời trung hòa các điện tích trái dấu trên protein nên sẽ cho phép protein kết
tủa.

a) Protein hòa tan trong nƣớc b) Protein tủa trong Ammonium sulfate
Hình 4. Tủa phân đoạn protein với Ammonium sulfate
(*Nguồn: />lay=Lectures&-recid=5450&-find=)








(*Nguồn:
Các muối thường được dùng để tủa protein (NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
, MgSO
4
Tuy
nhiên, người ta đã nhận thấy muối Ammonium Sulfate (AS) là tốt nhất vì phần lớn
protein kết tủa ở nồng độ bão hòa (4M, AS), không tạo nhiệt khi hòa tan, tỷ trọng thấp
ở nồng độ bão hòa (1,25 g/cm
3
) (Dương Thị Hương Giang, 2013), có thể thu nhận

Hình 5. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của prtotein biến thiên
theo nồng độ muối
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

protein kết tủa bằng ly tâm, protein tủa bằng AS không bị nhiễm khuẩn, protein không
bị biến tính, các protein khác nhau kết tủa ở các nồng độ AS bão hòa khác nhau.
2.3.1.2. Phƣơng pháp tủa bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ chủ yếu dựa vào hằng số điện môi của
dung dịch, quá trình solvate hóa của nước đối với những protein mang điện tích và ưa
nước sẽ giảm khi nồng độ dung môi tăng do sự giảm hằng số điện môi của dung dịch.
Do các dung môi hữu cơ thường có đặc tính háo nước vì vậy các phân tử nước xung
quanh vùng kỵ nước của protein sẽ bị thay thế bởi các phân tử dung môi, protein bị
mất lớp áo nước sẽ có xu hướng tương tác với nhau do ảnh hưởng của các lực tương
tác tĩnh điện và các vùng kỵ nước nằm gần bề mặt của protein. Lực đẩy do các nhóm
kỵ nước trên phân tử protein không đáng kể do chúng bị bao quanh bởi các phân tử
dung môi.
Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi:
ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D)
Trong đó
S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ
Sw: độ hòa tan của protein trong nước
D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào
Dw: hằng số điện môi của nước
R: hằng số khí lý tưởng
T: nhiệt độ tuyệt đối
A: là một hằng số

Dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các
loại rượu. Khi tủa bằng dung môi hữu cơ nhiệt độ thường phải giữ thấp hơn 5
o
C.
2.3.1.3. Phƣơng pháp tủa bằng điểm đẳng điện
Điểm đẳng điện (pI) của protein là pH mà tại đó protein không mang điện tích do
nồng độ của cation bằng với nồng độ của anion. Ở pH < pI protein tích điện dương,
pH> pI protein tích điện âm. Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein
cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân
tử protein bị mất đi proton (mất H
+
). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện),
protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn
khả năng tương tác với môi trường.

Hình 6. Tỷ lệ protein tủa theo pH
(*Nguồn:
Để xác định được điểm đẳng điện của protein bất kỳ, ta tiến hành kết tủa protein
ở nhiều pH khác nhau và so sánh lượng kết tủa thu được. Ở pH nào lượng kết tủa thu
được nhiều nhất thì pH đó chính là điểm đẳng điện của protein pI.
2.3.1.4. Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử
protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung

dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn
2+
, Fe
2+
,
Co
2+
, Ni
2+
, Zn
2+
và Cd
2+
sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa
nitrogen. Các ion như Ca
2+
, Ba
2+
, Mg
2+
và Pb
2+
sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic.
Các ion như Ag
2+
, Hg
2+
, và Pb
2+
sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh.

2.3.1.5. Phƣơng pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký do nhà bác học người Nga Mikhail Tewett phát minh vào
năm 1903. Sắc ký đề cập đến một tập hợp các kỹ thuật sử dụng để tách các hợp chất
khác nhau. Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự dịch chuyển hỗn hợp phân tích qua một
lớp chất cố định (được gọi là pha tĩnh) nhờ vào chất mang thường là khí hoặc lỏng
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

(được gọi là pha động). Phương pháp sắc ký ngoài khả năng tách còn là một trong
những phương pháp định tính và định lượng các hợp chất có độ chính xác. Dựa vào
trạng thái của pha động mà chia thành hai loại chính: sắc ký lỏng và sắc ký khí, dựa
vào cơ chế trao đổi của các hợp chất với pha tĩnh và pha động.
Pha tĩnh hạn chế sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần
này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau
theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng
biệt gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất
lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các
chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Pha động có tác dụng kéo hợp
chất cần tách ra khỏi cột (chất lỏng, khí). Hợp chất có ái lực yếu với pha tĩnh có xu
hướng ra khỏi cột trước, hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn
trong cột và ra sau.
2.3.2. Một số phƣơng pháp sắc ký
2.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion (Janson and Ryden, 1998) dựa trên sự cạnh tranh giữa các ion
của phân tử protein và các ion khác trên một giá thể chứa nhóm chức năng trao đổi ion
tích điện trái dấu. Sự tương tác giữa các phân tử với chất tích điện phụ thuộc nhiều
trên mạng lưới điện tích và lực ion của dung dịch đệm. Khi nồng độ của các ion cạnh

tranh thấp thì protein có thể bám vào được giá thể chứa nhóm chức năng trao đổi ion,
còn ngược lại thì protein sẽ được giải hấp phụ.
Các chất trao đổi ion bao gồm hai loại: chất trao đổi chứa nhóm chức baz tích
điện dương được gọi là chất trao đổi ion âm. Ngược lại chất trao đổi chứa nhóm chức
acid tích điện âm được gọi chất trao đổi ion dương. Mỗi loại trao đổi ion âm và dương
còn được chia làm loại mạnh và yếu. Trao đổi ion âm với một số nhóm chức năng
thường dùng như diethylaminoethyl (DEAE), trimethylhydroxypropyl (QA),
quaternary amine (Q)…Trao đổi ion dương thì có carboxymethyl (CM), sulfonate
(S)…
Có thể chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein dựa vào pI và độ bền pH của
protein.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học



Hình 7. Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
(*Nguồn:
2.3.3.2 Sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel còn được gọi là rây phân tử. Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa
vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và trọng lượng phân tử của protein
enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Gel sắc ký có kích cỡ lỗ khác nhau, khi
cho hỗn hợp dung dịch protein qua cột sắc ký chứa các hạt gel (cross-linked polymer)
các protein được đẩy ra tuần tự theo trọng lượng phân tử, các protein lớn được đẩy ra
trước các protein nhỏ ra sau dựa vào phổ sắc ký lọc gel xác định được từng phân đoạn
với kích thước phân tử khác nhau cho phép dự đoán trọng lượng phân tử của protein
nguyên thủy (native protein).

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học



Hình 8. Sắc ký lọc Gel
(*Nguồn:
2.3.3. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate –
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)
Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide được phát triển mạnh mẽ để phân tách
các đại phân tử dựa trên trọng lượng của chúng. Tốc độ dịch chuyển của một phân tử
trong một điện trường tỷ lệ thuận với điện trường (E), điện tích (Z) và hệ số ma sát (f):
v=Ez/f, tỷ lệ nghịch với hình dáng, kích thước và khối lượng phân tử. Gel
polyacrylamide được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT


___________________________________________________________________________________________________
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì nó có tính trơ về
mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng.
2.3.4.1. Điện di trên gel trong điều kiện có chất gây biến tính SDS và β-
mercaptoethanol
Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện
của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong

kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc
bậc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) trên bề mặt sẽ tích hoàn toàn
điện tích âm (1 phân tử SDS sẽ liên kết với 2 gốc acid amin). Nhờ đó, sự di chuyển
trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích
thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ
gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ
di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein,
người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các
protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.

Hình 9. Sự phân tách protein bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE
(* Nguồn:
Hệ thống gel được sử dụng rộng rãi nhất để tách một loạt các protein bằng điện
di SDS-PAGE là hệ thống Laemmli (1970) trong đó sử dụng tris-glycine gel bao gồm