phân lập và tuyển chọn một số dõng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải sinh hoạt

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.69 MB, 57 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
DÕNG VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE
TỪ RÁC THẢI SINH HOẠT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN DIỆP MINH TÂN
MSSV: 3102681
LỚP: CNSHTT K36

Cần thơ, tháng 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG
VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE
TỪ RÁC THẢI SINH HOẠT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN DIỆP MINH TÂN
MSSV: 3102681
LỚP: CNSHTT K36

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)

PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Diệp Minh Tân

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
– trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được không ít sự động viên chân thành từ phía
các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Điều đó đã giúp cho tôi rất nhiều, góp phần giúp
cho tôi hoàn thành khóa học và đặc biệt là trong quá trình thực hiện luận văn tốt
nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Quý thầy cô thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học đã quan tâm, tận tình dạy
bảo và truyền thụ kiến thức giúp cho tôi tự tin và hiểu biết chuyên môn nhiều hơn.
Thầy PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi
sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn tận tình,
truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu trong lĩnh vực chuyên môn để
giúp tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp.
Cô ThS. Trần Thị Xuân Mai đã rất quan tâm, động viên và theo sát tôi trong suốt
quá trình làm cố vấn học tập.
Các anh chị và các bạn sinh viên cùng làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật,
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ và ủng hộ về
mặt tinh thần cho tôi.
Đặc biệt là sự quan tâm, chia sẻ những khó khăn về cả vật chất lẫn tinh thần của
gia đình và người thân trong khoảng thời gian xa nhà để học tập và hoàn thành luận
văn này.
Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý thầy cô và tất cả
bạn bè của tôi.
Cần thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2014

Nguyễn Diệp Minh Tân
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
TÓM LƢỢC
Ô nhiễm rác thải sinh hoạt đang là vấn đề được xã hội quan tâm hiện nay. Thành
phần chính trong rác thải hữu cơ là cellulose. Nếu không có biện pháp xử lý tốt sẽ ảnh
hưởng xấu đến môi trường. Việc sử dụng vi khuẩn để xử lý rác thải hữu cơ là biện
pháp hiệu quả cao, thân thiện với môi trường và đem lại nhiều lợi ích khác. Từ phần
đất và dịch rác thu được ở bãi rác huyện Ngã Năm tỉnh Sóc Trăng, các dòng vi khuẩn
được phân lập và khảo sát nhằm mục tiêu tuyển chọn một vài dòng vi khuẩn có khả
năng tổng hợp enzyme cellulase cao. Mười tám dòng vi khuẩn phân lập được trên môi
trường chứa 1% CMC như một nguồn carbon duy nhất. Phần lớn các dòng vi khuẩn
có dạng que, Gram âm và phản ứng dương tính với catalase. Kết quả khảo sát khả
năng phân hủy cellulose nhờ phương pháp đục lỗ thạch và nhỏ giọt vi khuẩn kết hợp
với việc đo đường kính thủy phân sau khi đã nhuộm lugol trên trên môi trường thạch
với 2 nguồn cellulose là CMC và bột giấy. Qua đó, tuyển chọn được 2 dòng có khả
năng tổng hợp cellulase để thủy phân cellulose tốt nhất là dòng vi khuẩn C.D.9 và
C.D.10. Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp
sử dụng công cụ Blast nucleotide trên ngân hàng gen NCBI cho thấy 2 dòng vi khuẩn
C.D.9 và C.D.10 này được nhận diện lần lượt là Bacillus flexus và Bacillus subtilis với
cùng độ tương đồng là 98%
Từ khóa: Bacillus flexus, Bacillus subtilis, bột giấy, cellulase, cellulose.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
MỤC LỤC
Trang
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 Sơ lược về cellulose và enzyme cellulase 2
2.2 Cơ chế phân hủy cellulose 5
2.2.1 Quá trình phân hủy hiếu khí cellulose 5
2.2.2 Quá trình phân hủy kỵ khí cellulose 5
2.3 Giới thiệu một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 5
2.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis. 5
2.3.2 Vi khuẩn Bacillus flexus. 6
2.3.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp. 7
2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 7
2.3.1 Nghiên cứu ngoài nước 7
2.3.2 Nghiên cứu trong nước 8
2.4 Kỹ thuật PCR 8
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
3.1. Phương tiện nghiên cứu 10
3.1.1 Thời gian, địa điểm 10
3.1.2 Nguyên vật liệu 10
3.1.3 Thiết bị, hóa chất 10
3.2 Phương pháp nghiên cứu 12
3.2.1 Chuẩn bị mẫu vật 12
3.2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ đất và dịch rác thải:
13
3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase và đặc điểm sinh hóa của các
dòng vi khuẩn trên môi trường CMC. 16

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng phân hủy bột giấy của các dòng vi khuẩn có khả
năng tổng hợp enzyme cellulase. 17
3.2.5 Nhận diện một số dòng vi khuẩn 18
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20
4.1 Kết quả phân lập 20
4.2 Đặc tính khuẩn lạc của 18 dòng vi khuẩn đã phân lập 21
4.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn 23
4.4 Hoạt tính catalase của các dòng vi khuẩn đã phân lập 25
4.5 Kết quả kiểm tra Methyl red 26
4.6 Hoạt tính enzyme cellulase trên môi trường CMC 28
4.7 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase trên môi trường bột giấy 30
4.8 Nhận diện một số dòng vi khuẩn 31
4.8.1 Dòng vi khuẩn C.D.9 31
4.8.2 Dòng vi khuẩn C.D.10 32
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33
5.1 Kết luận 33
5.2 Đề nghị 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn 12

Bảng 2. Môi trường thử khả năng phân hủy bột giấy 12
Bảng 3. Môi trường glucose-phosphate 13
Bảng 4. Tóm tắt các giai đoạn nhuộm Gram của vi khuẩn 16
Bảng 5. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập được 21
Bảng 6. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 22
Bảng 7. Tỷ lệ về hình thái khuẩn lạc 23
Bảng 8.Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường CMC24
Bảng 9. Tỷ lệ về đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn 25
Bảng 10. Kết quả kiểm tra Methyl red của các dòng vi khuẩn 27
Bảng 11. Hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn trên môi trường CMC 30
Bảng 12. Hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn trên môi trường bột giấy31

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Sơ đồ biểu diễn chuỗi cellulose 2
Hình 2. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 4
Hình 3. Vi khuẩn Bacillus subtilis 6
Hình 4. Vi khuẩn Bacillus flexus 6
Hình 5. Vi khuẩn Cellulomonas flavigena 7
Hình 6. Khuẩn lạc phát triển trên môi trường CMC sau 48 giờ 24

Hình 7. Tế bào vi khuẩn đã nhuộm Gram quan sát ở vật kính X40 26
Hình 8. Khả năng tổng hợp catalase của vi khuẩn 27
Hình 9. Kết quả kiểm tra methyl red của các dòng vi khuẩn 28
Hình 10. Vi khuẩn tạo vòng thủy phân khi nhuộm Lugol 29
Hình 11. Vi khuẩn tạo vòng thủy phân trên môi trường bột giấy 32
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
TỪ VIẾT TẮT
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
mm milimet
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Đất nước ta ngày nay đang phát triển một cách mạnh mẽ về kinh tế và xã hội, song
song đó thì trình độ dân trí ngày càng được cải thiện. Chính vì những yếu tố trên mà ý
thức bảo vệ môi trường của người dân ngày càng được nâng cao. Ngày nay, việc áp
dụng những phương pháp xử lý rác thải khác nhau cũng góp phần vào việc cải thiện
tình trạng ô nhiễm môi trường.
Một trong những thành phần chính trong rác thải hữu cơ đó là cellulose. Cellulose
thường tồn tại trong rác thải ở dạng:
 Phế phẩm nông nghiệp: rơm rạ, thân bắp, vỏ trấu…

 Phế phẩm công nghiệp: vỏ các loại quả, mùn cưa, gỗ vụn…
 Rác thải gia đình: vải, giấy vụn…
Các loại rác thải này có thể xử lý bằng cách đốt đi nhưng sẽ gây ô nhiễm môi
trường rất lớn. Vì vậy cần tìm ra phương pháp xử lý chất thải một cách hợp lý và hiệu
quả nhằm góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng.
Đã có nhiều nghiên cứu xử lý cellulose bằng các phương pháp lý-hóa và sinh học
cho hiệu quả tương đối tốt. Trong đó, việc ứng dụng vi sinh vật để phân hủy cellulose
tỏ ra an toàn và tương đối hiệu quả, đồng thời cũng có thể tận dụng được nguồn
cellulose để làm phân bón giúp giảm chi phí phân bón cho nông nghiệp. Từ đó, đề tài
phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải sinh hoạt
được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ nguồn rác
thải sinh hoạt.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lƣợc về cellulose và enzyme cellulase
Cellulose là thành phần chính trong tế bào thực vật (trong gỗ chứa khoảng 50% và
trong sợi bông vải chứa khoảng 97-98%, sợi đay 75%, cây họ coi và lúa 30-40%)
( Chúng là nguyên liệu được tái tạo
nhiều nhất của thực vật từ CO
2
và nước (Claus, Feldby. 2012).
Cellulose có cấu tạo phức tạp từ các đơn phân là glucose, trong đó các gốc glucose
kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4- glycoside
( Công thức tổng quát của cellulose là

(C
6
H
10
O
5
)
n
với n có thể từ 5000-14000, tạo thành một chuỗi thẳng. nhóm hydroxyl
của chuỗi tạo liên kết hydro với oxy của chuỗi bên cạnh nhau hình thành cấu trúc tinh
thể chắc chắn khó thủy phân (Schwarz, W.H. 2001).

Theo Nguyễn Đức Lượng, (2004). Một phân tử cellulose có cấu trúc không đồng
đều nhất gồm 2 vùng: vùng kết tinh và vùng vô định hình.
+ Vùng kết tinh: cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững. Enzyme
cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này.
+ Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các
yếu tố bên ngoài. Enzyme cellulase có thể thủy phân vùng này dễ dàng và làm thay đổi
toàn bộ cấu trúc của chúng. Chiều dài phân tử cellulose trong vùng này thường lớn gấp
hàng chục lần so với vùng kết tinh.
Enzyme cellulase là enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân cellulose
thành glucose. Nó là enzyme được tổng hợp từ vi sinh vật trong suốt quá trình sinh
trưởng và phát triển trên nguồn vật liệu là cellulose (Lee và Koo, 2001). Trong tự
nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật tổng hợp được enzyme cellulase như: nấm, vi khuẩn,
xạ khuẩn… bằng cách lên men kỵ khí hoặc hiếu khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt. Tuy
nhiên để phân hủy hoàn toàn cellulose thì cần có sự phối hợp giữa nhiều loại enzyme
Hình 1. Sơ đồ biểu diễn chuỗi cellulose (Claus, Feldby. 2012)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
cellulase khác nhau như: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase; EC
3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D-glucan glucohydrolase; EC 3.2.1.91) và β-
glucosidase (β-D-glucoside glucohydrolase; EC 3.2.1.21) (Yi et al., 1999).
Enzyme endoglucanase (tên gọi khác: 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, endo
1,4-β-glucanase, CMCase, enzyme Cx) chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử
42-49 KDa, chúng tham gia thủy phân một cách ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glycosid
trong phân tử cellulose (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Endoglucanase cắt ngẫu nhiên tại
các vị trí không đồng dạng nên tạo ra các đoạn oligosaccharid có chiều dài khác nhau
(Teeri, 1997). Hoạt tính của endo 1,4-β-glucanase được xác định khi ủ với 900μl cơ
chất CMC 1% trong 20mM dung dịch đệm phosphate (Li-Jung et al., 2010).
Exoglucanases bao gồm 1,4-β-D-glucan gluconohydrolases (cellodextrinases) và
1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (exoglucanase, enzyme C1 hoặc avicelase), enzyme
cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose và giải phóng từng đơn
vị glucose (glucanohydrolases) hoặc cellulobiose (cellobiohydrolase) (Teeri, 1997).
Enzyme này không có khả năng phân hủy cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi
tính chất hóa lý của chúng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trọng lượng phân tử của
enzyme này từ 53 – 75 kDa. Để xác định hoạt tính hệ enzyme exoglucanases, ủ dịch
enzyme cellulase với cơ chất cellulose (Li-Jung et al., 2010).
Enzyme β-D glucoside glucohydrolase (còn có tên là cellobiase và β-glucosidase),
có khả năng họat động ở pH từ 4,4 – 4,8; trọng lượng phân tử khoảng 50 – 98 kDa, pI
= 8,4 và có thể họat động ở nhiệt độ cao. Cellobiase tham gia phân hủy cellobiose, tạo
thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

Hình 2. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase (Vladut-Talor, 1986)

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
2.2 Cơ chế phân hủy cellulose
2.2.1 Quá trình phân hủy hiếu khí cellulose
Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) thì quá trình oxy hóa xảy ra bắt đầu bằng sự thủy
phân và sau đó sản phẩm cuối cùng là CO
2
và H
2
O
Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose có trải qua 2 giai đoạn:
- Sự thủy phân cellulose thành cellulobiose dưới tác dụng của cellulase và
quá trình này còn tạo ra một ít glucose.
- Giai đoạn oxy hóa những đường đơn giản. Quá trình này có nhiều bước
trung gian và cuối cùng tạo thành CO
2
và H
2
O
2.2.2 Quá trình phân hủy kỵ khí cellulose
Quá trình phân hủy kỵ khí cellulose được tiến hành qua 2 giai đoạn. Giai đoạn
biến cellulose thành glucose và sử dụng glucose để lên men theo kiểu lên men butyric.
2.3 Giới thiệu một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy cellulose
bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Ở điều kiện hiếu khí, vi khuẩn sử dụng những
enzyme ngoại bào để thủy phân cellulose. Còn trong điều kiện không khí bị hạn chế,
thì các loài vi khuẩn tiến hành phân hủy enzyme nhờ phức hệ trên bề mặt tế bào (Rapp
et al., 1991).

2.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis được mô tả là vi khuẩn Gram dương, dạng que, có sinh nội bào tử
và thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý (Ferguson et al.2000). Hầu hết các
vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp. đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu khí, Gram
dương. Đặc biệt Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn không gây bệnh, có sức sống
cao, dễ nuôi cấy và có khả năng hình thành bào tử chịu nhiệt cao. Ở điều kiện thích
hợp, chúng có khả năng tổng hợp một lượng lớn enzyme cellulase. (Naoko et al.,
2011).

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

Hình 3. Vi khuẩn Bacillus subtilis
(Nguồn:
2.3.2 Vi khuẩn Bacillus flexus.
Bacillus flexus là vi khuẩn hiếu khí, dạng que, Gram dương và có khả năng sinh
nội bào tử. Chúng có thể tồn tại ở môi trường có phổ pH rộng từ 4,0-12,5 và môi
trường tối ưu để chúng phát triển là ở nhiệt độ 37
0
C và pH 10 (Zhao et al. 2008). Khả
năng phân hủy cellulose của Bacillus flexus được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong
thực tiễn như trong nông nghiệp trồng trọt, thực phẩm, công nghiệp dệt, chất tẩy rửa
và các lĩnh vực khác (Ramesh Chander Kuhad, 2011).

Hình 4. Vi khuẩn Bacillus flexus
(Nguồn:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học

2.3.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp.
Là vi khuẩn Gram dương, hình que. Chúng thường phân hủy cellulose bằng cách
tiết ra enzyme endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase (Vladut-Talor, 1986).

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.3.1 Nghiên cứu ngoài nƣớc
Trên thế giới, cellulase là một trong những enzyme được nghiên cứu rất kỹ trong
nhiều năm qua do enzyme này được ứng dụng nhiều, đặc biệt là trong lĩnh vực công
nghệ thực phẩm và xử lý môi trường.
Bên cạnh nấm giữ vai trò phân hủy cellulose chính, vi khuẩn cũng có vai trò quan
trọng trong việc phân hủy cellulose trong thủy vực (Tanaka et al. 2009).
Theo Saraswati Bai et al. (2012), Bacillus subtilis được phát hiện có khả năng tổng
hợp cellulase cao, không gây hại và điều kiện tối hảo để chúng tổng hợp cellulase là ở
nhiệt độ 30
o
C và pH từ 6,5-7.
Khả năng phân hủy cellulose của Bacillus flexus đã và đang được nghiên cứu ứng

dụng nhiều trong thực tiễn như trong nông nghiệp trồng trọt, thực phẩm, công nghiệp
dệt, chất tẩy rửa và các lĩnh vực khác (Ramesh Chander Kuhad, 2011).
Clostridium papyrosolvens được phát hiện có khả năng tổng hợp cellulase.
Clostridium papyrosolvens được nuôi cấy 48h trong điều kiện kỵ khí ở 35
o
C cho
dịch trích có hoạt tính CMCase cao. CMCase có nhiệt độ tối hảo là 35
o
C và pH tối hảo
là 6,5 đến 7,5 (Rani.D.Swaroopa, 2004).
(Nguồn:

Hình 5. Vi khuẩn Cellulomonas flavigena
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
2.3.2 Nghiên cứu trong nƣớc
Bacillus sp. là đối tượng có khả năng sản xuất enzyme cellulase có hoạt tính
cao, sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, phân hón, xử lý môi trường
và y học. Trong khảo sát các điều kiện nuôi cấy và tách chiết enzyme cellulase từ
Bacillus subtilis, kết quả cho thấy ở 40
o
C, pH=7,0. Thời gian nuôi là 30 giờ thì lượng
enzyme sinh ra là lớn nhất và có thể thủy phân mạnh mẽ các nguồn cellulose và đường
kính enzyme thủy phân CMC 1% là 20mm (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc
Huy, 2010).
Cellulose được phân hủy bởi các enzyme ngoại bào cellulase. Các nhóm vi khuẩn
có khả năng phân hủy cellulose là: Cytophaga, Cellulomonas, Clostridium,
Pseudomonas (Trần Cẩm Vân, 2005).

Cellulose là cơ chất khó bị phân hủy vì có cấu trúc rất bền và hoàn hoàn không tan
trong cả nước nóng lẫn nước lạnh. Vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose vì chúng
có thể tạo ra được 3 loại enzyme phân hủy được cellulose. Tuy nhiên không phải tất
cả các vi khuẩn đều có khả năng cùng một lúc tổng hợp ra 3 loại enzyme. Có loài tổng
hơp ra enzyme này nhiều, loài khác lại tổng hợp ra enzyme khác nhiều hơn. Chính vì
thế, sự phân hủy các hợp chất cellulose trong thiên nhiên đòi hỏi rất nhiều loài vi
khuẩn khác nhau, thay phiên nhau phân hủy từng giai đoạn trong toàn bộ chuỗi chuyển
hóa các chất chứa cellulose (Nguyễn Đức Lượng et al. 2003).
2.4 Kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân bản
một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao,
kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ- Kary Mullis và cộng sự phát minh năm
1958 tại công ty Cetus.
Nguyên lý của kỹ thuật PCR:
Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase.
Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi
trường thích hợp.
Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt
chủ động.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Kỹ thuật PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng
biệt. Đây thực sự là Kỹ thuật hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của
một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Kỹ thuật này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA
polymerase được tìm thấy trong các sinh vậy ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối
nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính
phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các nhiệt độ này DNA sẽ bị biến tính (DNA

dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng).
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba
giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài.
Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành 2 sợi đơn.
Nhiệt độ tăng lên 94
o
C-96
o
C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nhiệt
độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường
được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách
hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1-2 phút.
Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn căp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA
đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến
tính khoảng 45-60
o
C. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi
không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ
1-2 phút.
Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.
DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo
sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA polymerasse. Thời gian của bước này phụ
thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Như một quy
tắc 1000bp/phút.
Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho
các chu kỳ tiếp theo.
Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo
lý thuyết số lượng bản sao là 2
n

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian, địa điểm
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm (PTN) Vi sinh vật, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển
Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
- Thời gian: từ tháng 7 đến tháng 11 năm 2014
3.1.2 Nguyên vật liệu
Rác thải (đất và dịch rác) được thu từ bãi rác Ngã Năm ở tỉnh Sóc Trăng.
3.1.3 Thiết bị, hóa chất
Thiết bị:
- Tủ cấy vi sinh vật vô trùng
- Tủ ủ vi sinh vật
- Nồi khử trùng nhiệt ướt
- Kính hiển vi
- Máy lắc mẫu
- pH kế điện tử
- Cân điện tử
- Lò vi sóng
- Micropipet
- Ống nghiệm 10ml, 20ml
- Đĩa petri
- Một số dụng cụ khác như: que cấy, bình tam giác, lam, lamen, que trải thủy
tinh, ống đong, eppendorf 1,5ml, cone xanh, cone vàng, đèn cồn.

0,15g
MgSO
4

0,037g
CaCl
2

0,017g
Yeast extract*
0,01g
Agar
2%
CMC (Carbon Mymethyl Cellulose)
1%
Nước cất
Vừa đủ 1Lít
* Hóa chất không sử dụng khi thực hiện thí nghiệm
- Bảng 2. Môi trƣờng thử khả năng phân hủy bột giấy (Yamin, 1978 cải tiến ).
Thành phần
Khối lƣợng
K
2
HPO
4

1,9g
KH
2
PO

4

0,94g
KCl
1,6g
NaCl
1,43g
NH
4
Cl
0,15g
MgSO
4

0,037g
CaCl
2

0,017g
Yeast extract*
0,01g
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Agar
1,5%
Bột giấy**
0,5%
Nước cất

Vừa đủ 1Lít
* Hóa chất không sử dụng khi thực hiện thí nghiệm
** Hóa chất CMC đƣợc thay bằng bột giấy
- Thuốc thử Lugol: 5g Iod : 10g Potassium Iodide trong 85ml nước cất, được
dung dịch màu nâu với nồng độ Iodine là 150mg/ml
- Hóa chất nhuộm Gram: Crystal Violet, Cồn 70
o
, Iod, Fushin
- Hóa chất thử hoạt tính enzyme cellulase
- Hóa chất kiểm tra hoạt tính catalase: H
2
O
2
3%
- Hóa chất kiểm tra methyl red:
Bảng 3: Môi trƣờng glucose-phosphate (Clark and Lubs, 1915)
Thành phần
Khối lƣợng
Peptone
5g
Glucose
5g
K
2
HPO
4

5g
Nước cất
1000ml

- Thuốc thử methyl red (hòa tan 0,4g bột Methyl red trong 60ml cồn 90
o
, sau đó
thêm 40 ml nước cất).
- Các hóa chất trong phản ứng PCR
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Chuẩn bị mẫu vật
- Địa điểm thu mẫu: Bãi rác ở huyện Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng.
- Phương pháp thu mẫu: lấy đất (5g) và dịch rác (5ml) cho vào 2 ống nhựa đựng
mẫu riêng biệt, trữ lạnh.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
Ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ đất và dịch
rác thải:
Mục đích: chọn lọc những dòng vi khuẩn có khả năng sống và sử dụng nguồn
cellulose có trong rác thải.
Nguyên tắc:lấy dịch rác (1ml) và phần đất (1g) pha loãng với nước cất vô trùng
(9ml), sau đó trãi mẫu lên môi trường chuyên biệt, tiếp tục cấy chuyển những dạng
khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng, kích thước khác nhau đặc trưng để tách ròng. Quan
sát mẫu dưới kính hiển vi, kiểm tra độ ròng.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường phân lập: Môi trường CMC (1% agar) sau khi pha xong
đem khử trùng nhiệt ướt ở 121
o
C, áp suất 1 atm trong 20 phút. Sau khi khử trùng, tiến
hành rót môi trường vào đĩa petri đã khử trùng. Sau đó, chiếu tia UV khoảng 7 phút rồi
đem môi trường ủ trong tủ ủ 30
o

C trong một ngày để chọn những đĩa petri không bị
nhiễm khuẩn. Trữ mẫu vào tủ lạnh khi chưa sử dụng.
- Trải mẫu và cấy chuyển: tiến hành pha loãng mẫu. Mẫu được phân lập theo quy
trình:
Dịch mẫu
Trộn đều
Pha loãng 10
-o
 10
-4

Hút 100µl
Cấy trải lên đĩa môi trường
Ủ 48h, 30
o
C ở điều kiện hiếu khí
Chọn khuẩn lạc riêng biệt, cấy sang đĩa mới

Tiếp tục cấy chuyển đến khi khuẩn lạc có dạng giống nhau

Kiểm tra độ ròng trên kính hiển vi

Vi khuẩn ròng

Cấy ống trữ.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ
____________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Mỗi nồng độ pha loãng trải trên 1 đĩa và ủ hiếu khí. Sau khi cấy chuyển mẫu và
quan sát, ghi nhận lại hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa, kích thước của khuẩn lạc
ròng. Cuối cùng, vi khuẩn tách ròng được cấy chuyển vào ống nghiệm chứa môi
trường phân lập, ủ 48 giờ ở nhiệt độ 30
o
C trong điều kiện hiếu khí. Mỗi mẫu ròng cấy
2 ống và trữ mẫu trong tủ lạnh 4
o
C.
Kiểm tra độ ròng của khuẩn lạc: Sau khi tách ròng, tiến hành quan sát hình dạng
và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phướng pháp giọt ép rồi quan sát dưới kính hiển
vi quang học ở vật kính X40. Các thao tác gồm:
Bước 1: Nhỏ 1 giọt nước cất khử trùng lên lame

Bước 2: Khử trùng kim cấy, lấy
một ít khuẩn lạc để lên giọt nước
Trộn đều
Bước 3: Dùng lamelle đậy lên giọt nước sao
cho không có bọt khí

Bước 4: Quan sát mẫu dưới kính hiển vi X10,
sau đó chuyển qua X40
- Nhuộm Gram vi khuẩn: Phương pháp này nhằm mục đích xác định vi khuẩn
Gram âm hay Gram dương, được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học
người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938). Ông phát hiện kỹ thuật này vào
năm 1884 để phân biệt Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae.
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và
màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên loại phức chất
khác nhau.

Vì vách tế bào không còn
crystal violet nên có màu
hồng của Fuchsin
(* Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
Các bước nhuộm Gram vi khuẩn:
Chuẩn bị tiêu bản
- Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa lame.
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn rồi cho vào giọt nước.
- Hơ nóng mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn.
Nhuộm tiêu bản:
- Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet từ mẫu đã cố định, để 2 phút.
- Rửa nước từ 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước.
- Nhỏ dung dịch Iod, để 1 phút.
- Rửa bằng nước cất, chậm nhẹ
- Rửa bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu cho đến khi giọt cồn cuối cùng không
còn màu tím.
- Rửa bằng nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm.
- Nhỏ 1-2 giọt Fushin, để 1 phút.
- Rửa bằng nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm.
- Quan sát dưới kính hiển vi

phân lập và tuyển chọn một số dõng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải sinh hoạt

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về